一种复合佐剂、含有所述复合佐剂的疫苗及应用

技术领域

本发明涉及免疫佐剂技术领域，尤其涉及一种复合佐剂、含有所述复合佐剂的疫苗及应用。

背景技术

免疫佐剂简称佐剂，即非特异性免疫增生剂，指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。铝佐剂是被应用最多的传统佐剂，但铝佐剂只能提高体液免疫应答和局部(注射部位)巨噬细胞的应答，免疫增强效果不均衡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合佐剂、含有所述复合佐剂的疫苗及应用，本发明的复合佐剂在提高体液免疫的同时，也能提高细胞免疫，且具有较高的中和抗体。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种复合佐剂，所述复合佐剂包括：多肽佐剂和铝佐剂；

所述多肽佐剂具有式I所示结构；

优选的，所述复合佐剂的剂型包括注射剂。

优选的，所述注射剂中多肽佐剂的浓度为0.05～50mg/ml；所述铝佐剂的浓度为1.75mg/ml。

优选的，所述多肽佐剂和铝佐剂独立包装。

本发明还提供了上述方案所述复合佐剂在制备疫苗中的应用。

本发明还提供了一种含有上述方案所述复合佐剂的疫苗，所述疫苗中还含有免疫原。

优选的，所述疫苗包括新冠疫苗。

优选的，所述免疫原包括新冠病毒表面S蛋白。

优选的，所述疫苗中铝佐剂和免疫原的质量比为(0.1～10)：1。

本发明还提供了上述方案所述疫苗的制备方法，包括以下步骤：用铝佐剂吸附免疫原后，再加入多肽佐剂，得到疫苗。

本发明提供了一种复合佐剂，所述复合佐剂包括：多肽佐剂和铝佐剂；所述多肽佐剂具有式I所示结构；

本发明复合佐剂中的多肽佐剂能够有效的促进DC细胞的成熟，对抗原有更好的提呈作用，进而可以有效的提高T细胞免疫应答水平。本发明的复合佐剂在增强体液免疫的同时，也能够增强T细胞的免疫应答，可以刺激机体产生较高中和抗体，具有良好的免疫原性和保护效果。本发明的免疫佐剂在常温下即可放置，可短时间运输，是一种安全、稳定、有效的疫苗佐剂。

附图说明

图1为本发明多肽佐剂的MS结果；

图2为本发明多肽佐剂的HPLC检测结果；

图3为电镜检测结果，其中A为多肽佐剂的电镜图、B为铝佐剂电镜图、C为复合佐剂电镜图；

图4为ELISA检测结果；

图5为中和抗体检测结果；

图6为IFN-γELISPOT检测结果；

图7为流式细胞仪分析CD137的分泌水平；

图8为流式细胞仪分析IL-2的分泌水平。

具体实施方式

本发明提供了一种复合佐剂，所述复合佐剂包括：多肽佐剂和铝佐剂；所述多肽佐剂具有式I所示结构；

在本发明中，所述多肽佐剂优选的由吉尔公司合成获得。

在本发明中，所述多肽佐剂的最低成胶浓度为0.25mg/ml。多肽佐剂浓度为0.25mg/ml时就可以组装成水凝胶，本发明的多肽佐剂的成胶浓度低，用量少，可降低成本。

在本发明中，所述多肽佐剂的氨基酸序列为：F(苯丙氨酸)-F(苯丙氨酸)-E(谷氨酸)-Y(酪氨酸)；所述Y经Nap(2-萘丙胺)修饰；所述多肽的相对分子质量为851.93。在本发明中，对所述多肽佐剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

本发明的多肽佐剂中苯丙氨酸和Nap含有芳香环，能够促进β折叠，本发明的多肽佐剂利用芳香相互作用来驱动单个肽形成β折叠，促进多肽组装，而多肽组装后的水凝胶可以包裹抗原，促进抗原缓释，可以持续引起机体的免疫应答，有效的增强疫苗的免疫应答效果。

在本发明中，所述多肽佐剂和所述铝佐剂的质量比优选为100：(35～3500)，进一步优选为100：(100～1000)，更进一步优选为100：(175～200)。

在本发明的实施例中，所述铝佐剂又称为氢氧化铝佐剂，购自于美国GeneralChemical公司。

在本发明中，所述复合佐剂的剂型优选的包括注射剂。在本发明中，所述注射剂中多肽佐剂的浓度优选为0.05～50mg/ml，进一步优选为1～20mg/ml，更进一步优选为5～10mg/ml；所述铝佐剂的浓度优选为1.75mg/ml。

本发明中，所述复合佐剂中的多肽佐剂和铝佐剂优选的独立包装，在使用时与免疫原现用现配。

本发明还提供了上述方案所述复合佐剂在制备疫苗中的应用。

本发明还提供了一种含有上述方案所述复合佐剂的疫苗，所述疫苗中还含有免疫原。

在本发明中，所述疫苗优选的包括新冠疫苗。在本发明中，所述免疫原优选的包括新冠病毒表面S蛋白。在本发明中，所述疫苗中铝佐剂和免疫原的质量比优选为(0.1～10)：1，进一步优选为(1～5)：1，更进一步优选为3.5：1。在本发明中，所述疫苗的剂型优选的包括注射剂。

在本发明中，所述疫苗中优选的还包括碱性磷酸酶；所述碱性磷酸酶的添加量为0.5～1.5μL/mL疫苗，进一步优选为1μL/mL疫苗。碱性磷酸酶介导的脱磷酸化可以显著提高肽的疏水作用，促进单个肽形成β折叠，促进多肽组装。

本发明还提供了上述方案所述疫苗的制备方法，包括以下步骤：用铝佐剂吸附免疫原后，再加入多肽佐剂，得到疫苗。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所用的材料及试剂购自：IFN-γELISPOT购自Abcam；所有动物实验经中国医学科学院医学生物学研究所中心动物伦理委员会批准，严格按照实验室动物伦理委员会规定操作。

实施例1

1、由吉尔公司合成获得式I所示多肽佐剂。在固相多肽合成仪上将FFEY(谷氨酸和磷酸形成甲酯基，酪氨酸的羧基裸露)加入HATU和DIEA活化后再与2-萘丙胺的氨基进行缩合反应，随后在浓度为0.5M的氢氧化铝水溶液中水解脱去甲酯保护基，进而可以得到目标产物。

2、对所述多肽佐剂进行MS检测和HPLC检测，MS检测结果参见图1，HPLC检测结果参见图2，通过MS检测结果我们可以看出多肽的相对分子质量为851.93，通过HPLC结果可以看出在12.247min开始出峰，12.642min时达到峰值，13.294min时峰结束，且纯度可达到95.5829％。

3、对所述多肽佐剂进行电镜观察：

25℃条件下，称取2mg多肽加入1ml的0.9％的生理盐水，用NaOH调节pH值至9，使用时用0.9％的生理盐水或PBS稀释为1mg/ml的多肽佐剂；铝佐剂为1.75mg/ml；铝佐剂与多肽佐剂按照质量比100：175混合，多肽佐剂检测浓度为1mg/ml，分别用枪混匀；三个样品通过磷钨酸负染，铜网300目，电镜下观察多肽的结构，电镜下显示为纤维状结构，形成纤维后可包裹免疫原。如图3所示，其中A为多肽佐剂的电镜图、B为铝佐剂电镜图、C为复合佐剂电镜图。

实施例2

SPF级的Balb/c小鼠，6～8周龄，在无菌环境下饲养。包含3组，每组6只小鼠。A、新冠S蛋白+铝佐剂+多肽佐剂组；B、新冠S蛋白+铝佐剂组；C、新冠S蛋白组；混合后免疫。

具体方法：A、新冠S蛋白+铝佐剂+多肽佐剂组免疫2次，S蛋白为50μg/只鼠，S蛋白与铝佐剂的质量比例为1：3.5，多肽佐剂为100μg/只鼠；

B、新冠S蛋白+铝佐剂组，S蛋白为50μg/只鼠，S蛋白与铝佐剂的质量比例为1：3.5；

C、新冠S蛋白，S蛋白为50μg/只鼠；

免疫方式为肌肉注射，免疫间隔为0、3周，最后一次免疫后10天采血、取脾脏，做流式、ELISPOT、ELISA、中和抗体检测、保护性实验、组学等相关检测。

ELISA检测

用稀释液(0.012mol/LNa

检测结果参见图4，复合佐剂可以在小鼠体内有效增强新冠疫苗引起的抗体反应。通过对多个稀释度血清抗体的检测，可以看出复合佐剂可以有效增强IgG免疫反应水平。

中和抗体检测

在96孔U底板中，加入293TACE2转基因细胞，使每孔细胞数为2×10

IFN-γELISPOT检测

IFN-γELISPOT检测板加入100μl/孔，25℃10min，在吸水纸上轻轻拍干。加入100μl样品/孔，样品包括50μl刺激物稀释液+50μl细胞稀释液(5×10

流式细胞仪分析

提取新鲜脾细胞，用PBS洗两次，调整细胞悬液终浓度为1×10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。