一种动物血液连续分离方法

技术领域

本发明属于动物血液分离技术领域，具体涉及一种动物血液连续分离方法。

背景技术

血液是流动在动物的血管和心脏中的一种红色不透明的黏稠液体。血液由血浆和血细胞组成，一升血浆中含有900—910克的水，65—85克的蛋白质和20克的低分子物质，低分子物质中有多种电解质和有机化合物，血细胞包括红细胞和白细胞和血小板三类细胞。红细胞平均寿命为120天，白细胞寿命为9—13天，血小板寿命为8—9天。血液的功能包含血细胞功能和血浆功能两部分，有运输、调节人体温度、防御、调节人体渗透压和酸碱平衡四个功能。

目前现有的动物血液连续分离方法还存在一些问题：在提取DNA和超氧化物歧化酶时，没有对血液进行单独处理，两者之间的操作可能存在相互影响，降低了提取的纯度，为此我们提出一种动物血液连续分离方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种动物血液连续分离方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种动物血液连续分离方法，包括以下步骤：

S1.采血：收集动物血液并加入抗凝剂；

S2.血液分管：将S1处理后的血液分别加入两组试管中，得第一血液、第二血液；

S3.提取动物血液中的DNA；

S4.提取动物血液中的超氧化物歧化酶。

优选的，所述S1中的抗凝剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一、分别量取肝素钠和蒸馏水，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；

步骤二、用1ml注射器稀释所述抗凝剂母液，得待烘抗凝剂稀释液；

步骤三、用所述1ml注射器向5ml注射器内定量注入所述待烘抗凝剂稀释液；

步骤四、将装有所述待烘抗凝剂稀释液的所述5ml注射器在35-65℃下烘干，得抗凝剂。

优选的，所述步骤二具体为：先用蒸馏水将所述抗凝剂母液稀释，然后用1ml注射器定量吸取稀释后的所述抗凝剂母液，再吸取蒸馏水至1ml，得所述待烘抗凝剂稀释液。

优选的，所述步骤三之后、所述步骤四之前还包括：旋转所述5ml注射器，使所述待烘抗凝剂稀释液均匀附着于所述5ml注射器的管壁之上。

优选的，所述S3种提取动物血液中的DNA的具体步骤包括：

步骤一、取第一血液；

步骤二、血液稀释：在第一血液样本中加入KCl溶液，第一血液与KCl溶液的体积比为1：5，颠倒混匀；

步骤三、去除红细胞：向步骤二中的溶液中加入与第一血液体积相同的甲醇-乙酸混合液，颠倒混匀，离心弃上清，得到残留细胞团；向细胞团中加入5倍第一血液体积的甲醇-乙酸混合液，吹散混匀，离心弃上清，重复2-3次，直至上清液变无色；

步骤四、裂解白细胞沉淀蛋白：将得到的细胞团转入2ml微量离心管中，加入适量的双蒸水混匀，离心弃上清，加入细胞裂解液0.5ml、12μl浓度为222mg/ml的蛋白酶K，60℃孵育4小时；再加入120μl6M的乙酸铵混匀、离心；所述细胞裂解液是0.02M Tris-HCl、1.2mMEDTA、1.5％SDS的混合液；

步骤五、分离纯化DNA：用无水乙醇沉淀DNA，并用72％乙醇洗涤沉淀。

优选的，所述步骤五分离纯化DNA是吸取0.4ml上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，待出现絮状沉淀后，离心弃上清；再加入1.5ml 72％乙醇洗涤沉淀，离心弃上清；干燥沉淀，加入25-55μl TE溶解DNA。

优选的，所述S4中提取动物血液中的超氧化物歧化酶的具体包括以下步骤：

步骤一、取第二血液；

步骤二、血液分离：向第二血液中加入质量浓度为4-14％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为第二血液体积的4-12％，经抗凝处理后再经离心机离心收集得到红细胞，泵入水解反应罐；

步骤三、溶血破碎细胞：向步骤二收集的红细胞中加入1-3倍体积的纯净水，使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；

步骤四、热变性：将红细胞溶血液加热至60℃保温10-30分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，至碱金属盐浓度为0.1-0.5mol/L，继续加热至70℃，保温30-50分钟后，再升温至77-80℃，保温12-25分钟，立即放料冷；

步骤五、压滤：用800目滤布对经步骤四处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液；

步骤六、超滤浓缩：SOD粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的2％-14％，即为SOD浓缩液；

步骤七、沉淀除杂蛋白：向步骤六所得的SOD浓缩液中加入金属盐，至该金属盐浓度为1-5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，获得的SOD粗品经离子交换层析后再经分子筛层析后获得SOD精品。

优选的，所述步骤四中的碱金属盐为碱金属的氯化物中的一种或几种的混合物。

优选的，所述步骤七中的金属盐为铜盐或锌盐中的一种或几种的混合物。

优选的，所述步骤二中离心机的控制系统采用的数学模型有：静态模型、动态模型、离散模型、连续模型、几何模型、微分方程模型、图论模型、规划论模型、马氏链模型，且所述离心机的控制系统采用的数学公式有：牛顿-莱布尼茨公式、贝叶斯公式；

所述牛顿-莱布尼茨公式为：

所述贝叶斯公式为：

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在对血液进行DNA提取和超氧化物歧化酶提取时，通过先对血液进行分管处理，得第一血液和第二血液，然后再分别对第一血液和第二血液单独进行分离，从而降低了两者之间的影响，增加了提取的纯度。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为本发明中提取动物血液中的DNA的流程图；

图3为本发明中提取动物血液中的超氧化物歧化酶的流程图；

图4为本发明中离心机的控制电路示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

请参阅图1-图4，本发明提供一种技术方案：一种动物血液连续分离方法，包括以下步骤：

S1.采血：收集动物血液并加入抗凝剂；

S2.血液分管：将S1处理后的血液分别加入两组试管中，得第一血液、第二血液；

S3.提取动物血液中的DNA；

S4.提取动物血液中的超氧化物歧化酶。

本实施例中，优选的，所述S1中的抗凝剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一、分别量取肝素钠和蒸馏水，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；

步骤二、用1ml注射器稀释所述抗凝剂母液，得待烘抗凝剂稀释液；

步骤三、用所述1ml注射器向5ml注射器内定量注入所述待烘抗凝剂稀释液；

步骤四、将装有所述待烘抗凝剂稀释液的所述5ml注射器在35℃下烘干，得抗凝剂。

本实施例中，优选的，所述步骤二具体为：先用蒸馏水将所述抗凝剂母液稀释，然后用1ml注射器定量吸取稀释后的所述抗凝剂母液，再吸取蒸馏水至1ml，得所述待烘抗凝剂稀释液。

本实施例中，优选的，所述步骤三之后、所述步骤四之前还包括：旋转所述5ml注射器，使所述待烘抗凝剂稀释液均匀附着于所述5ml注射器的管壁之上。

本实施例中，优选的，所述S3种提取动物血液中的DNA的具体步骤包括：

步骤一、取第一血液；

步骤二、血液稀释：在第一血液样本中加入KCl溶液，第一血液与KCl溶液的体积比为1：5，颠倒混匀；

步骤三、去除红细胞：向步骤二中的溶液中加入与第一血液体积相同的甲醇-乙酸混合液，颠倒混匀，离心弃上清，得到残留细胞团；向细胞团中加入5倍第一血液体积的甲醇-乙酸混合液，吹散混匀，离心弃上清，重复2次，直至上清液变无色；

步骤四、裂解白细胞沉淀蛋白：将得到的细胞团转入2ml微量离心管中，加入适量的双蒸水混匀，离心弃上清，加入细胞裂解液0.5ml、12μl浓度为222mg/ml的蛋白酶K，60℃孵育4小时；再加入120μl6M的乙酸铵混匀、离心；所述细胞裂解液是0.02M Tris-HCl、1.2mMEDTA、1.5％SDS的混合液；

步骤五、分离纯化DNA：用无水乙醇沉淀DNA，并用72％乙醇洗涤沉淀。

本实施例中，优选的，所述步骤五分离纯化DNA是吸取0.4ml上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，待出现絮状沉淀后，离心弃上清；再加入1.5ml 72％乙醇洗涤沉淀，离心弃上清；干燥沉淀，加入25μl TE溶解DNA。

本实施例中，优选的，所述S4中提取动物血液中的超氧化物歧化酶的具体包括以下步骤：

步骤一、取第二血液；

步骤二、血液分离：向第二血液中加入质量浓度为4％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为第二血液体积的4％，经抗凝处理后再经离心机离心收集得到红细胞，泵入水解反应罐；

步骤三、溶血破碎细胞：向步骤二收集的红细胞中加入1倍体积的纯净水，使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；

步骤四、热变性：将红细胞溶血液加热至60℃保温10分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，至碱金属盐浓度为0.1mol/L，继续加热至70℃，保温30分钟后，再升温至77℃，保温12分钟，立即放料冷；

步骤五、压滤：用800目滤布对经步骤四处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液；

步骤六、超滤浓缩：SOD粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的2％，即为SOD浓缩液；

步骤七、沉淀除杂蛋白：向步骤六所得的SOD浓缩液中加入金属盐，至该金属盐浓度为1mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，获得的SOD粗品经离子交换层析后再经分子筛层析后获得SOD精品。

本实施例中，优选的，所述步骤四中的碱金属盐为碱金属的氯化物中的一种或几种的混合物。

本实施例中，优选的，所述步骤七中的金属盐为铜盐或锌盐中的一种或几种的混合物。

本实施例中，优选的，所述步骤二中离心机的控制系统采用的数学模型有：静态模型、动态模型、离散模型、连续模型、几何模型、微分方程模型、图论模型、规划论模型、马氏链模型，且所述离心机的控制系统采用的数学公式有：牛顿-莱布尼茨公式、贝叶斯公式；

所述牛顿-莱布尼茨公式为：

所述贝叶斯公式为：

实施例2

请参阅图1-图4，本发明提供一种技术方案：一种动物血液连续分离方法，包括以下步骤：

S1.采血：收集动物血液并加入抗凝剂；

S2.血液分管：将S1处理后的血液分别加入两组试管中，得第一血液、第二血液；

S3.提取动物血液中的DNA；

S4.提取动物血液中的超氧化物歧化酶。

本实施例中，优选的，所述S1中的抗凝剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一、分别量取肝素钠和蒸馏水，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；

步骤二、用1ml注射器稀释所述抗凝剂母液，得待烘抗凝剂稀释液；

步骤三、用所述1ml注射器向5ml注射器内定量注入所述待烘抗凝剂稀释液；

步骤四、将装有所述待烘抗凝剂稀释液的所述5ml注射器在65℃下烘干，得抗凝剂。

本实施例中，优选的，所述步骤二具体为：先用蒸馏水将所述抗凝剂母液稀释，然后用1ml注射器定量吸取稀释后的所述抗凝剂母液，再吸取蒸馏水至1ml，得所述待烘抗凝剂稀释液。

本实施例中，优选的，所述步骤三之后、所述步骤四之前还包括：旋转所述5ml注射器，使所述待烘抗凝剂稀释液均匀附着于所述5ml注射器的管壁之上。

本实施例中，优选的，所述S3种提取动物血液中的DNA的具体步骤包括：

步骤一、取第一血液；

步骤二、血液稀释：在第一血液样本中加入KCl溶液，第一血液与KCl溶液的体积比为1：5，颠倒混匀；

步骤三、去除红细胞：向步骤二中的溶液中加入与第一血液体积相同的甲醇-乙酸混合液，颠倒混匀，离心弃上清，得到残留细胞团；向细胞团中加入5倍第一血液体积的甲醇-乙酸混合液，吹散混匀，离心弃上清，重复3次，直至上清液变无色；

步骤四、裂解白细胞沉淀蛋白：将得到的细胞团转入2ml微量离心管中，加入适量的双蒸水混匀，离心弃上清，加入细胞裂解液0.5ml、12μl浓度为222mg/ml的蛋白酶K，60℃孵育4小时；再加入120μl6M的乙酸铵混匀、离心；所述细胞裂解液是0.02M Tris-HCl、1.2mMEDTA、1.5％SDS的混合液；

步骤五、分离纯化DNA：用无水乙醇沉淀DNA，并用72％乙醇洗涤沉淀。

本实施例中，优选的，所述步骤五分离纯化DNA是吸取0.4ml上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，待出现絮状沉淀后，离心弃上清；再加入1.5ml 72％乙醇洗涤沉淀，离心弃上清；干燥沉淀，加入55μl TE溶解DNA。

本实施例中，优选的，所述S4中提取动物血液中的超氧化物歧化酶的具体包括以下步骤：

步骤一、取第二血液；

步骤二、血液分离：向第二血液中加入质量浓度为14％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为第二血液体积的12％，经抗凝处理后再经离心机离心收集得到红细胞，泵入水解反应罐；

步骤三、溶血破碎细胞：向步骤二收集的红细胞中加入3倍体积的纯净水，使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；

步骤四、热变性：将红细胞溶血液加热至60℃保温30分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，至碱金属盐浓度为0.5mol/L，继续加热至70℃，保温50分钟后，再升温至80℃，保温25分钟，立即放料冷；

步骤五、压滤：用800目滤布对经步骤四处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液；

步骤六、超滤浓缩：SOD粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的14％，即为SOD浓缩液；

步骤七、沉淀除杂蛋白：向步骤六所得的SOD浓缩液中加入金属盐，至该金属盐浓度为5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，获得的SOD粗品经离子交换层析后再经分子筛层析后获得SOD精品。

本实施例中，优选的，所述步骤四中的碱金属盐为碱金属的氯化物中的一种或几种的混合物。

本实施例中，优选的，所述步骤七中的金属盐为铜盐或锌盐中的一种或几种的混合物。

本发明的工作原理及优点：本发明在对血液进行DNA提取和超氧化物歧化酶提取时，通过先对血液进行分管处理，得第一血液和第二血液，然后再分别对第一血液和第二血液单独进行分离，从而降低了两者之间的影响，增加了提取的纯度。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。