一种鉴定抗菌核病油菜品系的方法及应用

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，尤其涉及一种鉴定抗菌核病油菜品系的方法及应用。

背景技术

油菜菌核病是我国油菜主产区的最主要病害，常年导致油菜产量损失10％-20％。菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)侵染引起的真菌性病害，该病原菌是典型的死体营养型病原菌，化学防治经常会由于对菌核病发病时期把握不准和使用方法掌握不当影响使用效果，生产上迫切需要抗病油菜品种。但目前在油菜及其近缘种中还没有发现对菌核病免疫的种质资源，同时由于菌核病鉴定程序繁琐，工作量极大，要获得自然资源中抗性资源十分困难。因此需要新的鉴定方法和技术。

硫代葡萄糖苷(下文简称硫苷)是一类含硫、氮的重要的次生代谢产物，主要存在于白花菜目植物中，如白菜、甘蓝、油菜、萝卜、芥菜、辣根、拟南芥等。硫苷对于植物的生长发育、防卫反应等方面都具有重要作用。

硫苷在白花菜目植物的生长与发育中起着重要的作用。硫苷及其降解产物参与了植物的防卫反应，有效地抵御了病虫害对植物的影响，主要表现为：脂肪族硫苷可以抵御叶食虫和一些寄主性病原菌的侵害；吲哚族硫苷可以有效抵御昆虫产卵和非寄主性病原菌的侵害。硫苷的生物学活性尤其是植物防御方面的活性主要是通过它的降解产物来发挥功能的。当植物的组织遇到昆虫的咀嚼取食或者病原菌的入侵等各种生物与非生物的胁迫时都会诱导硫苷合成或降解代谢，进而产生异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈类化合物和重要的硫化物等等，进而对病害和虫害起到一定的防御作用。

植物应对抗原入侵时的防御方式分为组成型和诱导型两种，硫苷的抗病类型属于前者，硫苷在植物组织中的合成即使没有受到外界的诱导或胁迫也一直存在。而当病原菌侵入植物组织进而破坏了隔离芥子酶与硫苷的细胞器之后，芥子酶与硫苷相接处进而催化硫苷降解，其降解产物进而发挥防御功能，最终达到减少病原菌扩散甚至杀死病原菌的目的。

病原菌按其营养方式分为活体营养型病原菌(Biotrophic pathogen)和死体营养型病原菌(Necrotrophic pathogen)两大类，其中，如果病原菌从宿主细胞组织中吸收营养物质而并不很快引起宿主细胞死亡的称为活体营养型病原菌，如白粉病菌(Erysiphecichoracearum)、白绣菌(Albugo candida)等；如果病原菌先杀死寄主的细胞或组织，然后再从死亡的细胞中吸收养分进而继续繁殖的病原菌称为死体营养型病原菌，如核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等。活体型病原菌一般不会在一开始就破坏寄主的细胞或组织结构，硫苷也不会因此而降解，所以一般情况下硫苷不会很快的受到活体营养型病菌的诱导，也使得此类病菌对硫苷的降解产物变得十分的敏感；死体营养型病原菌直接破坏植物的细胞或组织结构而引起硫苷的降解，长期与硫苷的降解产物相接处而使得它们进化出了抵抗硫苷降解产物毒性的能力。因此，改变植物的硫苷成分和含量可以有效地影响植株的抗病性。有报道发现，在甘蓝型油菜中发现种子中的吲哚族硫苷特别是3-吲哚甲基硫苷与油菜抗菌核病显著地相关(李云昌,2001；Zhao and Meng,2003)。

糖基转移酶是一个多成员的基因家族，广泛存在于所有的有机体中，催化糖基转移，因其糖基供体为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，而命名为尿苷二磷酸-糖基转移酶(UDP—glycosyltransferases,UGT)(姬向楠等,2013)。UGT在调节植物激素平衡、防御解毒和次生代谢产物的修饰方面都发挥着重要的作用，其中UGT74B1在植物合成吲哚族硫苷起关键作用(Grubb et al.,2004)。拟南芥UGT74B1编码的酶在吲哚族硫苷合成途径中，将上游产生的硫代乙醛肟基酸糖基化形成脱硫硫苷，后被磺基转移酶催化形成完整的硫苷(王建升等,2012)。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鉴定抗菌核病油菜品系的方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本发明利用基因BnUGT74B1，建立基因表达量与抗病关系，根据该基因特定时期表达量，鉴定出抗病新资源，从而提高油菜菌核病抗性。

本发明是这样实现的，一种鉴定抗菌核病油菜品系的方法，包括在油菜开花后期接种核盘菌后，对BnUGT74B1基因表达量进行检测，BnUGT74B1基因表达量显著提高的为抗性系。

本发明还披露了如上述的一种鉴定抗菌核病油菜品系的方法在油菜优良品种选育中的应用。

本发明所涉及BnUGT74B1基因是从油菜中克隆到的，对非转基因不同材料中该基因表达水平进行分析，可以依据该基因表达水平差异，鉴别出具有较强菌核病能力的油菜品系，从而利用非转基因材料提高油菜抗菌核病能力，为育种提供新的遗传资源。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明对两个生育期相似的两个油菜品系，通过RNAseq分析其基因在接种后的表达水平，确定该基因在开花后期表达水平，发现该基因表达水平与抗菌核病能力存在直接关联。选取抗性差异显著的两个DH系(R line和S line)，其病斑分别达到6.8和12.1cm，BnUGT74B1基因的两个拷贝均表现出差异，接种核盘菌24小时后，抗性系的基因表达水平升高，且达到显著水平。

本发明确定BnUGT74B1基因表达量对油菜菌核病抗病性有直接关联，可用于确定油菜抗菌核病能力的差异，从而为鉴别油菜抗菌核病的遗传差异提供指示，可提高鉴定不同油菜抗病能力的准确性，减少表型鉴定的误差和工作量，可为油菜抗菌核病育种提供新方法。

附图说明

图1是两个DH系茎秆接种7天后病斑长度；

图2是BnUGT74B1两个拷贝的表达水平分析结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种鉴定抗菌核病油菜品系的方法及应用。BnUGT74B1基因的编码序列见SEQ ID NO.1所示。

实施例

1.抗感材料确定

选取两个生育期相似的两个DH系进行转录组测序。这两个材料茎秆接种核盘菌后7天病斑差异极显著，病斑长度分别为6.8和12.1cm，将其分别命名为R系和S系line(图1)。

2.转录组测序

叶片RNA提取：试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司TRIpure(货号：RN0102)。具体操作步骤如下：

1).取50-100mg植物组织样品放入1.5mL离心管中，液氮中保存；

2).将样品放入研钵，加入适量液氮，迅速研磨至粉末状。将粉末转入1.5mL RNasefree的离心管中；

3).迅速加入1mL TRIpure，混匀并于15-30℃条件下孵育5min；

4).加入0.2mL氯仿，盖紧离心管盖，用力摇晃15s，于30℃条件下孵育2-3min；

5).4℃条件下以不超过12000rpm的转速离心10min；

6).取上清液大约0.5-0.6mL到干净的1.5mL RNase free的离心管中，加入0.5mL异丙醇，于15-30℃条件下孵育10min；

7).4℃条件下以不超过12000rpm的转速离心10min，倒掉上层悬浮液；

8).加入75％乙醇1mL，旋涡振荡数秒。4℃条件下以不超过7500rpm的转速离心5min；

9).倒掉上清，干燥5-10min，加入30-50μL DEPC水溶解RNA。

RNA提取后，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳的方法检测RNA的完整性，并用Agilent2100生物分析仪和NanoDrop分光光度计检测其纯度和浓度。每个样品取2μg总RNA，稀释至50μg，利用

3.基因表达水平分析

将经过NGS QC tool kit质量控制后的clean reads用TopHat v2.0.11分别比对到甘蓝型油菜的参考基因组上，参数采用默认设置。提取出只能比对到唯一位置的reads进行基因的表达量计算。基因的表达量计算及差异表达基因的鉴定采用软件Cufflinksv2.2.0进行。每个基因的表达丰度以FPKM来表示。通过对FPKM值的分析来筛选接种样品和对照样品之间的差异表达基因(Differentially expressed genes(DEGs))。

结果显示，BnUGT74B1基因的两个拷贝均表现出差异，未接菌前，对照R mock与Smock的两个拷贝的表达量水平差异都不显著；接种核盘菌24小时后，与S系相比，R系的两个基因拷贝的表达水平升高(图2)，且达到显著水平；与各自的mock对照相比，R系的两个拷贝比S系变化更加剧烈，这一结果说明了该基因表达水平与抗菌核病能力存在直接关联，基因BnUGT74B1的表达量提高显著增强对病菌的抗性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种鉴定抗菌核病油菜品系的方法及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> BnUGT74B1

<400> 1

atggcggaaa caacaacaac aacaacagcg accaactcca aaggccacgt cgtggtctta 60

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