一株产油酵母菌及其应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株富含棕榈油酸的产油酵母菌及其应用。

背景技术

棕榈油酸 (Palmitoleic acid，C16：0，POA)，是由十六个碳原子组成且含有一个双键的ω-7单不饱和脂肪酸。近年来，棕榈油酸在营养、医药和工业上的应用价值逐渐受到重视。棕榈油酸能够降低C-反应蛋白(CRP)的水平，通过减少炎症降低心脏病，中风的危险；增加细胞膜的流动性，降低血液中低密度脂蛋白胆固醇（LDL）含量，减少血管中粥样硬化斑块形成而造成的阻塞血管，从而防止心律失常和减少高血压等。另外，棕榈油酸已被证明能提高人体对胰岛素的敏感性，对糖尿病，代谢综合症有效，且没有明显的副作用。此外，棕榈油酸被认为是生产优质生物柴油以及化学工艺中辛烯合成的理想原料。

迄今，棕榈油酸大多来源于生物合成。目前，野生植物是棕榈油酸产品的主要原料。沙棘果、猫爪草、澳洲坚果等含有含量(15%-40%)较丰富的棕榈油酸。然而，在这些高积累脂肪酸的野生植物中，绝大多数因种子小、产量低、地理分布窄等原因，不能像普通油料作物那样进行大规模种植和商业化生产。而大田栽培的大豆等常见油料作物种子的主要成分包括棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）和亚油酸（C18:2）,而仅含微量的棕榈油酸（<2%）,难以满足人类食用和工业需求。

鉴于棕榈油酸等ω-7脂肪酸在人类健康、医药上的独特价值以及可作为再生资源的重要性，筛选富含棕榈油酸的产油微生物应用于实际生产逐渐成为近年来的研究热点。产油酵母，相较其他产油微生物，具有培养简单、生物量大、油脂含量高、底物利用谱广泛，以及工业化中适应性强等众多优点。但在大多数产油酵母(能够积累超过细胞干重20%的油脂的酵母)中，棕榈油酸含量稀缺（<10%）.而非产油酵母中棕榈油酸含量高对棕榈油酸实际产量无应用意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株富含棕榈油酸的产油酵母菌，通过氧调控策略，使最终棕榈油酸的产量得到明显的提高。

为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一株产油酵母菌，其特征在于，分类命名为

本发明的另一目的在于提供上述产油酵母菌在生产棕榈油酸中的应用。将所述产油酵母菌接种至YM平板培养基上培养后，取单菌落接种至种子培养基进行两代种子培养，种子培养得到的种子液接种至发酵培养基发酵产棕榈油酸。

进一步的，所述种子培养基和发酵培养基均为无机盐培养基，其组分如下：

50 g/L葡萄糖、8.99 g/L KH

盐溶液组分为20 g/L MgSO

微量元素溶液组分为4 g/L CaCl

进一步的，所述两代种子培养的方式为：

1）一代种子培养：从YM平板培养基上取单菌落，接种于种子培养基恒温培养；

2）二代种子培养：取一代种子培养的培养液接种于新的种子培养基，和步骤1）同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。

进一步的，所述恒温培养的条件为：25℃，200 rpm下培养24h。

进一步的，发酵培养的条件为：25℃下发酵8-10天，从第二天起每天补充葡萄糖至浓度为90 g/L，同时补充2%的盐溶液和2%的微量元素溶液。

进一步的，发酵培养时转速600~1000 rpm，通气速率0.1~2vvm。优选的，发酵培养时转速1000rpm，通气速率1vvm。

进一步的，将发酵培养的发酵液离心去上清，利用生理盐水冲洗两次，得到的菌体经过液氮速冻后冷冻干燥至恒重，获得含棕榈油酸油脂产品。

本发明提供了一株产油酵母菌及其应用。本发明筛选到的

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。此外，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明所述的生物材料，其分类命名为

实施例中使用的培养基如下：

YM液体培养基：10 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母粉，3 g/L麦芽提取物。

YM固体培养基：10 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母粉，3 g/L麦芽提取物，15-20 g/L琼脂粉，pH 6.2±0.2；115℃灭菌20 min。

无机盐种子培养基：50 g/L葡萄糖、8.99 g/L KH

盐溶液组分为20 g/L MgSO

微量元素溶液组分为4 g/L CaCl

其配制方式如下：

葡萄糖母液：称取500g葡萄糖溶于一定量蒸馏水中，定容至1 L，115℃灭菌20min；

主培养基：称取8.99 g KH

盐溶液：称取2 g MgSO

微量元素溶液：称取4 g CaCl

按葡萄糖母液10%，主培养基86%，盐溶液2%，微量元素2%的体积含量混合配制无机盐培养基。

实施例中产油酵母总油脂含量和油脂组分测定方式为：

通过一步萃取和转酯化的方法甲酯化脂肪酸样品。称取冻干的菌体约20 mg，置于15 mL的玻璃管中，首先加入1.5 mL正己烷和0.5 mL含有2 mg/mL苯甲酸甲酯的正己烷用于油脂萃取，然后加入2 mL 含有15 % H

产油酵母总油脂含量和油脂组分测定条件：高效气相色谱配置毛细血管柱DBWaxcolumn（Length: 30 m, diam:0.25 mm, film: 0.25 μm; Agilent TechnologiesDeutschland GmbH, Böblingen, Germany; 122-7032），火焰离子化检测器（FID, Agilent6890 GC），工作压力1.083 bar。氮气作为载气，流速为1 mL/min。气相色谱升温程序为：进样口温度为250℃，柱温以8 ℃/min的速度从40℃升高到250℃，在250℃保持10 min后降回到40℃。脂肪酸甲酯的标准品为GLC-65-100mg（ 武汉尼乌斯科技有限公司）。标准品用正己烷配置成10 mg/L的GC标准品溶液，作为标准溶液与测试样品一起检测。

实施例1 产油酵母菌筛选。

利用取自南京老山森林公园的土壤，在YM琼脂平板上划线，20℃-25℃培养分离获得菌落，将菌落从YM琼脂平板转移到滤纸上，在60℃下干燥15min，然后用0.08%苏丹黑B染色20分钟 96%乙醇清洗过滤两次，富含油脂的菌株被染成蓝色的菌落。

利用油脂成分含量测定的方法鉴定到一株棕榈油酸含量达到14%以上的产油酵母，经鉴定为

实施例2 产油酵母菌在生产棕榈油酸中的应用

（1）将

（2）从YM固体培养基上挑取单菌落点接种于装液量含10m无机盐培养基于100m培养基的三角瓶中，25℃，200 rpm恒温摇床中培养24 h，得到一代种子液。

（3）取步骤（2）中所得种子液按初始OD600为0.5~1.0接种于装液量含100mL无机盐培养基于1L培养基的三角瓶中，25℃，200 rpm恒温摇床中培养24 h，得到二代种子液。

（4）取步骤（3）中所得的二代种子液，按初始OD600为1接种于含1L无机盐培养基的2.5 L发酵罐中，25℃，600 rpm，1 vvm。发酵第二天开始每天补充葡萄糖至浓度为90 g/L，并补充体积比2%的盐溶液与2%的微量元素，培养8-10天，得到发酵液。

（5）取步骤（4）中得到的发酵液，5000 rpm下离心5 min，离心去上清，利用生理盐水(0.9% NaCl溶液)冲洗两次，得到的菌体经过液氮速冻，置于-40℃、0.370 mbar条件下冷冻干燥至恒重，获得含POA油脂干燥产品。

实施例3

采取不同的搅拌速率和通气速率进行发酵实验，研究不同溶氧状态下POA产量，结果如表1所示：

表1 不同溶氧状态下

生物量指每升发酵液中获得的细胞干重。

其中600-1000rpm指600rpm发酵48h后调整至1000 rpm。1000 rpm，1 vvm。