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利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用

文献发布时间：2023-06-19 10:57:17

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及利用双sgRNA的CRISPR/cas9系统和Cre-loxp编辑系统敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用。

背景技术

载体表达系统是重组疫苗研制及应用成功的关键，它不仅能携带外源基因，而且能高效表达外源基因。目前，应用于重组疫苗的活病毒载体主要包括慢病毒、腺病毒、痘病毒、杆状病毒、疱疹病毒等。猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒，作为病毒载体具有基因组相对较大、复制非必需区段较多、可以同时插入多个外源基因等显著优点：是一个非常理想的多价重组疫苗载体，可用于构建基因标记疫苗，实现一针多防。TK基因即UL23基因，是伪狂犬病毒的重要毒力基因，属于病毒的早期基因，也是非必须基因，缺失TK基因的PRV在神经元中的复制能力极弱。因此，利用基因工程技术敲除PRV的TK基因，可使毒株毒力下降和潜伏感染能力降低。

近年来基因编辑技术发展迅速，CRISPR/Cas技术已经发展成为基因编辑的首选工具。其工作原理是通过guide RNA的引导，Cas9结合到有PAM结构的目的位点，利用Cas9蛋白对DNA双链进行切割。通过非同源末端连接(NHEJ)修复机制在切割位点引入插入或缺失，诱导基因突变或沉默。在Cas9切割DNA的同时引入具有同源臂的外源基因，就可以利用同源重组(HR)修复机制将外源基因片段插入到基因组目的位点，实现精确高效的基因编辑——敲入或敲除。

然而，CRISPR/Cas敲除方法脱靶效率较高，敲除结果具有不稳定性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)设计伪狂犬病毒TK基因上的靶序列sgRNA1和sgRNA2，并根据sgRNA设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列，其中，sgRNA1的核苷酸序列为GTATTTACGATGCGCAGACC(SEQ IDNO.1)，sgRNA2的核苷酸序列为GCCCACGCGTGCACCTCGAG(SEQ ID NO.2)；

(2)将sgRNA双链寡聚核苷酸序列与Cas9载体连接，转化宿主细胞，得到重组Cas9-sgRNA载体；

(3)构建含有靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段的donor载体；

(4)将donor载体、Cas9-sgRNA载体混合转染细胞；

(5)用伪狂犬病毒感染细胞，挑取带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失过渡病毒；

(6)转染Cre质粒，挑取不带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失病毒。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，步骤(1)中，在sgRNA 5'端加上caccg或cacc得到正向寡核苷酸；

同时根据导向序列获得互补序列在5'端加上aaac得到反向核苷酸序列，分别合成上述正反向序列，将两个序列变性、退火形成双链。

sgRNA1和sgRNA2双链寡聚核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：正向寡核苷酸sgRNA1-F：

5'-caccGTATTTACGATGCGCAGACC-3'；

SEQ ID NO.4：反向核苷酸序列sgRNA1-R：

5'-aaacGGTCTGCGCATCGTAAATAC-3'；

SEQ ID NO.5：正向寡核苷酸sgRNA2-F：

5'-caccGCCCACGCGTGCACCTCGAG-3'；

SEQ ID NO.6：反向核苷酸序列sgRNA2-R：

5'-aaacCTCGAGGTGCACGCGTGGGC-3'。

将形成的双链与Cas9载体连接，转化到感受态大肠杆菌中，涂布与AMP+LB平板，挑取阳性克隆，测序鉴定，增菌培养，提取质粒DNA，得到重组Cas9-sgRNA载体。所述Cas9载体为pX330等非病毒载体。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，步骤(2)中，donor载体中插入的序列包括TK基因左侧同源臂、loxp序列、启动子、荧光标记基因、loxp序列、右侧同源臂。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，所述启动子包含了CMV增强子和CMV启动子。

Donor载体的制备方法：根据伪狂犬病毒株TK上下游基因的测序结果设计引物。上游同源臂引物加入loxp序列，当用PCR扩增时，获得伪狂犬病毒TK基因上游同源臂hm1序列并引入loxp序列，获得的序列包含了hm1和loxp。下游同源臂引物加入loxp序列，当PCR扩增时，获得伪狂犬病毒TK基因下游同源臂hm2序列并引入loxp序列，获得序列包含了hm2和loxp。用PCR扩增获得pEGEP-C1载体并引入loxp序列和酶切位点，获得序列包含了CMV增强子-CMV启动子-EGFP序列。将三个片段经融合PCR方法和酶切方法连接，胶回收后插入PMD18T载体，获得PMD18T-donor载体。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，构建含有靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段的donor载体，包括以下步骤：

(a)获得伪狂犬病毒TK基因上游同源臂hm1序列，并引入loxp序列，得到TKhm1-Loxp片段；

(b)获得伪狂犬病毒TK基因下游同源臂hm2序列序列，并引入loxp序列和酶切位点，得到Loxp-TKhm2片段；

(c)获得CMV增强子-CMV启动子-EGFP基因序列，并引入loxp序列和酶切位点，得到CMV-EGFP片段；

(d)将Loxp-TKhm2片段与CMV-EGFP片段进行融合PCR，获得CMV-EGFP-Loxp-TKhm2片段；

(e)使用酶切和连接酶，将TKhm1-Loxp片段、CMV-EGFP-Loxp-TKhm2片段连接得到靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段；

(f)用所述同源重组片段与质粒连接，得到donor载体。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，上游同源臂引物hm1引物序列为：

SEQ ID NO.7：TK-HM1F：

5'-ATAACTAGTAATTGGTAGTTGTAGCGGTACGAGATGC-3'；

SEQ ID NO.8：TK-HM1R：

5'-GGAATTCGCTAGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGCGCATCGT-3'。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，下游同源臂引物hm2引物序列为：

SEQ ID NO.9：TK-hm2 F：

5'-TATACGAAGTTATGCGCGTCTCCCACCGTC-3'；

SEQ ID NO.10：TK-hm2 R：

5'-CCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGTCGTCGCTCTCGTG-3'。

根据权利要求5所述的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，CMV启动子-EGFP基因片段的引物序列为：

SEQ ID NO.11：EGFP F：

5'-ATAACTAGTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGG-3'；

SEQ ID NO.12：EGFP R：

5'-GACGCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCGCCCTTTGACGTTGGAG-3'。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，可用于伪狂犬病毒基因缺失疫苗制备，利用特异性靶序列sgRNA1和sgRNA2针对伪狂犬病毒TK基因进行基因敲除和插入外源基因。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，可用于伪狂犬病毒示踪技术中的应用，伪狂犬病毒TK基因中插入donor载体，同时donor载体中含有CMV增强子、CMV启动子以及EGFP绿色荧光蛋白，从而可以进行伪狂犬病毒示踪。

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，TKhm1-Loxp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示:

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，TKhm2-Loxp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示:

ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCGCGTCTCCACCGTCGACCTGGGGCCCTCGCCGCGCGTCTGCGCCGCGGCCGTGGCGGCGCAGACGCGCGGCATGGAGGTGACGGAGTCCGCGTACGGCGACCACATCCGGCAGTGCGTGTGCGCCTTCACGTCGGAGATGGGGGTGTGACCCTCGCCCCTCCCACCCGCGCCGCGGCCAGATGGAGACCGCGACGGAGGCAACGACGACGGCGTGGGAGGGGGCTCGGGGCGCGTATAAAGCTATGTGTATGTCATCCCAATAAAGTTTGCCGTGCCCGTCACCATGCCCGCGTCGTCCGTGCGCCTCCCGCTGCGCCTCCTGACCCTCGCGGGCCTCCTGGCCCTCGCGGGGGCCGCCGCCCTCGCCCGCGGCGCGCCGCAGGGTGGGCCGCCCTCGCCGCAGGGGGGTCCCGCGCCCACCGCGGCGCCCGCGCGCGGGCCCACCCTGTTCGTCCTGGTCGGCGACGGCTCCGCGTGGTTCGTCTTCCAGCTCGGCGGGCTGGGGGCGCTCAACGACACGCGCATCCGCGGGCACCTGCTCGGCCGGTACCTCGTCTCGTACCAGGTGGTGCCCCCGCCCGTCTCCGCGTGGTACTTTGTGCAGCGCCCGCGCGAGCGCCCGCGCCTCTCGGGGCCGCCCTCGGGCGCGGAGCTCGTGGCCTTCGACGCGCCCGGCGTCCGGCGCACGTACACCACGGCGGCGGTGTGGCCCGCGGAGGTGGCCGTCCTCGCGGACGCGGAGGCGCGCTGCCCCGCGGCCGTCTTCAACGTGACGCTGGGCGAGGCCTTCCTCGGCCTGCGCGTCGCGCTGCGCTCCTTCCTGCCGCTGGAGGTCATCATCTCCGCCGAGCGGATGCGCATGATCGCGCCCCCGGCGCTCGGCTCGGACCTGGAGCCGCCGGGCCCGCCCGCGGGCCGCTTCCACGTGTACACGCTCGGCTTCCTCTCCGACGGGGCCATGCACCAGACGATGCGCGACGTGGCCGCCTACGTGCACGAGAGCGACGACTACC

根据本发明具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，启动子-EGFP基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示:

CCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGA

根据本发明具体实施方式的利用CRISPR/cas9系统敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，donor载体插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示:

GGTAGTTGTAGCGGTACGAGATGCGCCCGCCCTCGGCCAGCGCCTGGCTCAGCGCGTCCAGGTACTCGGGGACCCGCTCCAGCAGGTCCGCGATGCCCAGCGGGGCGGCGGCGCCCGCGGCGCCGGCCCCCTGCCGCACGCGGTGCACCAGGTGCAGGCACAGCGCGGCGCTCTCGAGCGCCGAGTAGTGCCGGTTGCCCACGTACAGGCGCCCGCAGGCCTGCAGCGCCGTGGTCGTCACGCCCATGAAGGTGCGCGACATGCGGCCGTCGCGCGAGTCGATGGCGCGCGAGACCTGCGGGCGCTCCGCGACGAGCGTGGCCTGGAGCGTGGCGTACCACGTGCCGAAGAGCACGCCGGAGGCGGCGCCGCGCGCGGCGTACACCATGGCCAGGAAGTCCAGCGAGAGGTTGGCGTCGTAGGCGAGCGCCACGTCGTTCTTGGCGATCTGCACCTCGCGGCCCTCGTCCGCGGCCGCGGTCGCCTCGGGCGCCTCCTCGGCGGCGCGCGCCGCGTCCGCCTCCTCGGCGGCGCGCGCCGTCTCCTCGAGCACCACGAGCGCCTCGGCCACGCGCTCCACCTGCCGCTCCAGCGGCCGCAGCTGCTCGTCCACCTCGGCCTCGAGGCGCGCGCCCGCGGCCATGGCGTTGTCCAGCGCCGCGGCGGCCGCGCGGCGGCGCGCGTTCGCGTGCGCCAGCGCGAGGCGCGCGTCGAGGCCCTCGCTGAAGCCCGGGCGGGCCCAGAAGCCCACGGGGAACGGGGGCGCGATGAAGTGGCGCGCGCTGCCCGGGATCGCAGCGGCCTCGAAGGCGAACCACGCGCGGTCCATGGCGCGGGGGGACATGGGCCGCGCGCCGCCGCGCGCCGCCTTATCACCGCGCCCACCCGCTCCCCGCCCGTCCCCGCGCGCCGCGATCGCGATCACCGCCGCGGGCCGGCGACGTACTCGGCGAGGCCGCGCACGGTCGCGGCCATCGCGCTCGCGTTGCCGCGCGTCTGGGTGCAGGGCAGGCGCGTCACGTCGAGCACGCGCATGCTCCGCTGGGCCACGAACACCAGCAGGGGCACGAGCGTGATCTCCTCGCCGCCCGGGGGCACGGCGGCGGCGAGGAGGCGCGCCGAGTCGCGCAGCTGGCACAGCCCCTCGTGCCGCTGCCCGCGCTTGCTGGGCGTGTTGAGGTTCCGGGGGAAGCGGCACGTCTTGAGCTCGATGACGAAGCACAGGTGCGGCCCCACCCCCAGCCGCACCACGCACACGCAGTCGGGGCGGCGCACCCCGAGGTTGACTTCAAAGGCCAGGGTCAAGGACGCCTTCTTAAGCGTCTCGCGGGGAAGCCCGAAGAGACTCTCGCCGTACGCGGACGGGTCGCGGCGCAGGCGTTCGTAGAAGCGGTTGTGGCAGCGGATCCCCGCCCGGAAGCGCGCCGGGATGCGCATCCTCCGGATCTACCTCGACGGCGCCTACGGCACCGGCAAGAGCACCACTGCCCGGGTGATGGCGCTCGGCGGGGCGCTGTACGTGCCCGAGCCGATGGCGTACTGGCGCACTCTGTTCGACACGGACACGGTGGCCGGTATTTACGATGCGCAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCGCGTCTCCACCGTCGACCTGGGGCCCTCGCCGCGCGTCTGCGCCGCGGCCGTGGCGGCGCAGACGCGCGGCATGGAGGTGACGGAGTCCGCGTACGGCGACCACATCCGGCAGTGCGTGTGCGCCTTCACGTCGGAGATGGGGGTGTGACCCTCGCCCCTCCCACCCGCGCCGCGGCCAGATGGAGACCGCGACGGAGGCAACGACGACGGCGTGGGAGGGGGCTCGGGGCGCGTATAAAGCTATGTGTATGTCATCCCAATAAAGTTTGCCGTGCCCGTCACCATGCCCGCGTCGTCCGTGCGCCTCCCGCTGCGCCTCCTGACCCTCGCGGGCCTCCTGGCCCTCGCGGGGGCCGCCGCCCTCGCCCGCGGCGCGCCGCAGGGTGGGCCGCCCTCGCCGCAGGGGGGTCCCGCGCCCACCGCGGCGCCCGCGCGCGGGCCCACCCTGTTCGTCCTGGTCGGCGACGGCTCCGCGTGGTTCGTCTTCCAGCTCGGCGGGCTGGGGGCGCTCAACGACACGCGCATCCGCGGGCACCTGCTCGGCCGGTACCTCGTCTCGTACCAGGTGGTGCCCCCGCCCGTCTCCGCGTGGTACTTTGTGCAGCGCCCGCGCGAGCGCCCGCGCCTCTCGGGGCCGCCCTCGGGCGCGGAGCTCGTGGCCTTCGACGCGCCCGGCGTCCGGCGCACGTACACCACGGCGGCGGTGTGGCCCGCGGAGGTGGCCGTCCTCGCGGACGCGGAGGCGCGCTGCCCCGCGGCCGTCTTCAACGTGACGCTGGGCGAGGCCTTCCTCGGCCTGCGCGTCGCGCTGCGCTCCTTCCTGCCGCTGGAGGTCATCATCTCCGCCGAGCGGATGCGCATGATCGCGCCCCCGGCGCTCGGCTCGGACCTGGAGCCGCCGGGCCCGCCCGCGGGCCGCTTCCACGTGTACACGCTCGGCTTCCTCTCCGACGGGGCCATGCACCAGACGATGCGCGACGTGGCCGCCTACGTGCACGAGAGCGACGACTACC

本发明的有益效果：

1、本发明提供了一种应用CRISPR/cas9系统敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，使用两个sgRNA，可针对TK基因两个位点进行剪切，能够精确定位编辑位点，基因编辑效率高效，大大增加了敲除结果的稳定性，且具有高精确性和低脱靶效应的特点；

2、本发明应用cre/loxp系统敲除插入病毒中的荧光素标记基因，大大缩短了病毒筛选的时间；

3、本发明提供的制备donor载体的方法，在上下游引物设计时加入了loxp序列，制备过程中只需完成上下游同源臂和CMV-EGFP三个片段的融合，构建过程简便。CMV-EGFP可更换为其他外源基因表达盒，实现外源蛋白的共表达；

4、本发明制备的donor载体中使用了高效启动子(CMV增强子+CMV启动子)，可以增加绿色荧光蛋白EGFP的表达量，便于依照绿色荧光蛋白筛选重组病毒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为显微镜下观察病毒重组后的荧光显色情况；

图2是PCR鉴定伪狂犬病毒重组毒株的纯化图，其中，1：R13139-gE-TK双基因缺失毒株；2：R13139毒株；3：空白对照；M：DL2000 DNA marker；

图3为PRV-gE-TK双基因缺失病毒和PRV R13139株的生长曲线对比情况；

图4为PRV-gE-TK双基因缺失病毒连续传代后PCR鉴定TK基因结果，其中，1：F5代病毒；2：F10代病毒；3：F1代病毒；4：空白对照；M：DL2000DNA marker。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。实施例1构建猪伪狂犬病毒TK基因缺失株

1 试验材料

1.1 供试病毒株

猪伪狂犬病毒(PRV)R13139为本发明在天津市猪场疑似伪狂犬病病例中分离获得的PRV流行毒株，R13139-gE毒株为本发明制备的R13139株gE基因缺失毒株。

1.2主要试剂

LA TaqDNA酶、2XGC buffer I、dNTP、DL2000 DNA Marker、IPTG、X-gaL、氨苄青霉素(AMP)、DNA胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶为宝生物工程(大连)有限公司产品；胎牛血清、DMEM培养基购自GIBICO公司；E.coil JM109感受态细胞由本实验室制备。

1.3载体

Cas9n表达载体PX330载体购于Addgene公司；PMD18-T Vector为宝生物工程(大连)有限公司产品；pEF载体为上海信裕生物科技有限公司产品；Fastpfu酶为上海闪晶分子生物科技有限公司产品。

2构建CRISPR/Cas9系统

2.1设计sgRNA

在PRV TK基因上选择符合"-NGG-"的PAM序列设计引物；为了尽量避免脱靶的可能性，sgRNA靶标序列选择在病毒基因组中唯一位点，经过了反复优化，所设计的sgRNA具有高特异性；为了提高编辑效率，使用了针对TK基因不同位点的两个sgRNA序列，降低了脱靶效率。

设计的靶位点如下：

SEQ ID NO.1：sgRNA1：5'-GTATTTACGATGCGCAGACC-3'；

SEQ ID NO.2：sgRNA2：5'-GCCCACGCGTGCACCTCGAG-3'。

本发明的靶位点在病毒基因组中位置唯一，能够尽量避免脱靶的可能。

根据基因序列分别设计并合成两对gRNA寡聚单链DNA，oligo序列如下：

正向寡核苷酸sgRNA1-F：5'-caccGTATTTACGATGCGCAGACC-3'，

反向核苷酸序列sgRNA1-R：5'-aaacGGTCTGCGCATCGTAAATAC-3'；

正向寡核苷酸sgRNA2-F：5'-caccGCCCACGCGTGCACCTCGAG-3'，

反向核苷酸序列sgRNA2-R：5'-aaacCTCGAGGTGCACGCGTGGGC-3'。

2.2合成sgRNA单链

将寡聚单链DNA退火成双链，将双链的gRNA oligo分别插入到CRISPR/Cas9载体中，构建CRISPR/Cas9重组质粒，并转化至大肠杆菌JM109。

1)gRNA的退火

用无菌的TE buffer稀释引物使终浓度为100μMol。分别吸取10μL的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR管内进行退火。结束后置于冰上放置几分钟，直接连接或于-20℃冷冻保存。

2)CRISPR/Cas9载体的酶切

Bbs1酶切线性化PX330载体，将退火后形成的TK-sgRNA双链DNA分别连接至PX330表达载体上。于37℃酶切约30min。待酶切结束后进行核酸电泳，切胶回收酶切产物。

3)CRISPR/Cas9载体与引物的连接

连接体系如下：

于25℃水浴中孵育30min。

4)转化

将大肠杆菌置于冰上待其自然解冻后，把连接产物全部加入大肠杆菌中，于冰上放置20min，后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上放置2-3min。加入1000μL不含抗生素的LB培养基于37℃，150rpm振荡培养45min。3000rpm离心2min，弃掉约850μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有相应抗性的培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。

5)测序鉴定阳性克隆

利用U6启动子通用引物，测序鉴定阳性克隆。

6)重组质粒的制备

挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。37℃摇床培养阳性克隆12～16h，提取质粒，得到TK-sgRNA的表达载体。

7)sgRNA脱靶效率检测

sgRNA与Cas9 Nuclease进行组合体外切割靶DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，发现所合成的sgRNA可以有效引导Cas9 Nuclease在特定位点切割并产生特定大小的DNA片段，具备较高的编辑效率。

2.3构建TK基因hm1同源臂

根据PRV TK基因设计上游同源臂引物，在引物设计中引入了loxp序列，引物序列如下：

TK-HM1F：

5'-ATAACTAGTAATTGGTAGTTGTAGCGGTACGAGATGC-3'；

TK-HM1R：

5'-GGAATTCGCTAGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTT ATTGCGCATCGT-3'。

切胶回收扩增产物，pEF载体用Nhe1/EcoR1进行酶切，PCR扩增产物用Spe1/EcoR1进行酶切，用T4 DNA ligase进行常规连接，转化入大肠杆菌JM109，获得pEF-HM1质粒，测序验证。

扩增得到上游同源臂TKhm1-Loxp，序列为SEQ ID NO.13。

2.4构建TK基因hm2同源臂

根据PRV TK基因设计下游同源臂引物，在引物设计中引入了loxp序列，引物序列如下：

TK-hm2 F：5'-TATACGAAGTTATGCGCGTCTCCCACCGTC-3'；

TK-hm2 R：

5'-CCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGTCGTCGCTCTCGTG-3'。

使用TK-hm2 F和TK-hm2 R引物组合，伪狂犬病毒基因组DNA做模板，进行PCR扩增。扩增得到下游同源臂Loxp-TKhm2，序列为SEQ ID NO.14。

2.5EGFP表达盒扩增

根据pEGFP-c1载体设计引物扩增EGFP表达盒，引物序列如下：

EGFP F：

5'-ATAACTAGTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGG-3'；

EGFP R：

5'-GACGCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCGC CCTTTGACGTTGGAG-3'。

使用EGFP F和EGFP R引物组合，pEGFP-c1做模板，进行PCR扩增。扩增得到CMV-EGFP，序列为SEQ ID NO.15。

2.6融合PCR

应用融合PCR将CMV-EGFP和Loxp-TKhm2序列连接起来。

PCR完成后，切胶回收扩增产物，用T4 DNA ligase与PMD18T载体连接，转化入大肠杆菌JM109，测序验证。

融合后得到CMV-EGFP-Loxp-TKhm2。

2.7获得TKhm1-Loxp-CMV-EGFP-Loxp-TKhm2序列

将pEF-HM1质粒用Nhe1进行单酶切；CMV-EGFP+LoxP+HM2片段用Spe1进行单酶切用T4 DNA ligase与PMD-18T载体进行常规连接，TKhm1-Loxp-CMV-EGFP-Loxp-TKhm2序列，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建PMD-TK-donor载体。

2.8Cas9-TK sgRNA表达载体和PMD-TK-donor质粒的转染

1)细胞培养

将PK-15细胞传代到12孔培养皿中，当第二天细胞长到70％～80％时准备转染。转染前2h更换新鲜无抗生素培养液。

2)转染

用脂质体或电转化法进行转染。Cas9-TK sgRNA1 2μL、Cas9-TK sgRNA22μL、PMD-TK-donor 8μL溶于Opti-MEM 50μL；1μL Lipo2000溶于Opti-MEM50μL，室温放置5分钟；将两管溶液混合，室温放置20min；将混合液全部加入细胞孔中。补加200μL用无血清培养基，4～6h后换为有血清培养基。

2.9病毒感染

转染完成后将细胞中加入1～10MOI猪伪狂犬病毒R13139-gE基因缺失株，37℃1h后，换为新培养基，继续培养24～48h后，在显微镜下观察，是否出现绿色荧光细胞。

结果如图1所示，其中A为病毒重组后出现绿色荧光，B为对照细胞不出现荧光。

将细胞冻融三次，5000rpm离心10min，收获细胞上清液。

2.10病毒纯化

1)用胰酶消化PK-15细胞，加入生长培养基悬浮细胞，将细胞接种12孔细胞板，等待细胞长满80～90％，用于病毒接种；

2)将病毒做10倍稀释，共做5个梯度，并向每个细胞孔中加入200μL稀释好的病毒液，置于37℃温箱吸附1h后弃残液；

3)将2×DMEM(含4％血清)与2％的低熔点琼脂糖等体积混匀，每个细胞孔覆盖400μL，37℃CO2培养箱培养48～96h；

4)在荧光显微镜下每天观察出现细胞，挑选出现绿色荧光的蚀斑，溶于细胞维持液，冻融三次后，上清液用于传代接种；

5)重复三次以上蚀斑纯化，直至接种细胞后的细胞病变均产生绿色荧光。

2.11带绿色荧光蛋白的重组病毒PRV-gE-TK-EGFP的鉴定

提取重组病毒PRV-gE-TK-EGFP的核酸，用PCR方法进行鉴定，引物如下：

TK001：5’-ATGCGCATCCTCCGGATCTACCTC-3’；

TK002：5’-TCACACCCCCATCTCCGACGTG-3’。

TK基因敲除后毒株扩增片段为346bp，原病毒为963bp，结果如图2所示。

实施例2测定伪狂犬病毒gE-TK双基因株生物学特性

1.生长曲线测定

将病毒含量为1MOI的PRV-gE-TK双基因缺失病毒和PRV R13139株分别接种PK15细胞，37℃吸附1h后弃去上清，每隔4h收获一次病毒液，直至36h。将收获的病毒液分别进行病毒含量测定，绘制两种病毒的生长曲线，结果见图3。

结果如图3所示，PRV-gE-TK双基因缺失病毒和PRV R13139株病毒的生长曲线无明显差异，均在28h达到增殖高峰。

2.测定遗传稳定性

PRV-gE-TK病毒在PK15细胞上连续传10代，每代病毒均进行PCR鉴定TK基因是否缺失。

结果如图4所示，F5代病毒、F10代病毒的TK基因未发生回补，说明PRV-gE-TK病毒株可稳定传代。

3.测定猪伪狂犬病毒基因缺失株对小鼠致病力

3.1毒株：天津地区PRV R13139株、R13139-gE-TK双基因缺失株；

3.2试验动物：7周龄SPF雄性BALB/c小鼠(25g左右)；

3.3病毒对小鼠致病力及LD

将55只小鼠随机分成3个试验组。第1组空白对照组，5只小鼠，颈部皮下注射DMEM细胞培养液，0.1mL/只；第2～3组，每组25只小鼠，分别注射PRV-gE-TK基因缺失株、PRVR13139病毒，将病毒稀释为10

结果显示，PRV R13139病毒对小鼠的LD

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 天津市农业科学院

<120> 利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(gtatttacga tgcgcagacc )

<400> 1

gtatttacga tgcgcagacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcccacgcgt gcacctcgag 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccgtattt acgatgcgca gacc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacggtctg cgcatcgtaa atac 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgcccac gcgtgcacct cgag 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacctcgag gtgcacgcgt gggc 24

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataactagta attggtagtt gtagcggtac gagatgc 37

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaattcgct agcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattgc gcatcgt 57

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tatacgaagt tatgcgcgtc tcccaccgtc 30

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccggggatcc tctagagatt ggtagtcgtc gctctcgtg 39

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ataactagtc cgcgttacat aacttacggt aaatgg 36

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacgcgcata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttcgcccttt gacgttggag 60

<210> 13

<211> 1624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtagttgta gcggtacgag atgcgcccgc cctcggccag cgcctggctc agcgcgtcca 60

ggtactcggg gacccgctcc agcaggtccg cgatgcccag cggggcggcg gcgcccgcgg 120

cgccggcccc ctgccgcacg cggtgcacca ggtgcaggca cagcgcggcg ctctcgagcg 180

ccgagtagtg ccggttgccc acgtacaggc gcccgcaggc ctgcagcgcc gtggtcgtca 240

cgcccatgaa ggtgcgcgac atgcggccgt cgcgcgagtc gatggcgcgc gagacctgcg 300

ggcgctccgc gacgagcgtg gcctggagcg tggcgtacca cgtgccgaag agcacgccgg 360

aggcggcgcc gcgcgcggcg tacaccatgg ccaggaagtc cagcgagagg ttggcgtcgt 420

aggcgagcgc cacgtcgttc ttggcgatct gcacctcgcg gccctcgtcc gcggccgcgg 480

tcgcctcggg cgcctcctcg gcggcgcgcg ccgcgtccgc ctcctcggcg gcgcgcgccg 540

tctcctcgag caccacgagc gcctcggcca cgcgctccac ctgccgctcc agcggccgca 600

gctgctcgtc cacctcggcc tcgaggcgcg cgcccgcggc catggcgttg tccagcgccg 660

cggcggccgc gcggcggcgc gcgttcgcgt gcgccagcgc gaggcgcgcg tcgaggccct 720

cgctgaagcc cgggcgggcc cagaagccca cggggaacgg gggcgcgatg aagtggcgcg 780

cgctgcccgg gatcgcagcg gcctcgaagg cgaaccacgc gcggtccatg gcgcgggggg 840

acatgggccg cgcgccgccg cgcgccgcct tatcaccgcg cccacccgct ccccgcccgt 900

ccccgcgcgc cgcgatcgcg atcaccgccg cgggccggcg acgtactcgg cgaggccgcg 960

cacggtcgcg gccatcgcgc tcgcgttgcc gcgcgtctgg gtgcagggca ggcgcgtcac 1020

gtcgagcacg cgcatgctcc gctgggccac gaacaccagc aggggcacga gcgtgatctc 1080

ctcgccgccc gggggcacgg cggcggcgag gaggcgcgcc gagtcgcgca gctggcacag 1140

cccctcgtgc cgctgcccgc gcttgctggg cgtgttgagg ttccggggga agcggcacgt 1200

cttgagctcg atgacgaagc acaggtgcgg ccccaccccc agccgcacca cgcacacgca 1260

gtcggggcgg cgcaccccga ggttgacttc aaaggccagg gtcaaggacg ccttcttaag 1320

cgtctcgcgg ggaagcccga agagactctc gccgtacgcg gacgggtcgc ggcgcaggcg 1380

ttcgtagaag cggttgtggc agcggatccc cgcccggaag cgcgccggga tgcgcatcct 1440

ccggatctac ctcgacggcg cctacggcac cggcaagagc accactgccc gggtgatggc 1500

gctcggcggg gcgctgtacg tgcccgagcc gatggcgtac tggcgcactc tgttcgacac 1560

ggacacggtg gccggtattt acgatgcgca ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 1620

ttat 1624

<210> 14

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgcgcgt ctccaccgtc gacctggggc 60

cctcgccgcg cgtctgcgcc gcggccgtgg cggcgcagac gcgcggcatg gaggtgacgg 120

agtccgcgta cggcgaccac atccggcagt gcgtgtgcgc cttcacgtcg gagatggggg 180

tgtgaccctc gcccctccca cccgcgccgc ggccagatgg agaccgcgac ggaggcaacg 240

acgacggcgt gggagggggc tcggggcgcg tataaagcta tgtgtatgtc atcccaataa 300

agtttgccgt gcccgtcacc atgcccgcgt cgtccgtgcg cctcccgctg cgcctcctga 360

ccctcgcggg cctcctggcc ctcgcggggg ccgccgccct cgcccgcggc gcgccgcagg 420

gtgggccgcc ctcgccgcag gggggtcccg cgcccaccgc ggcgcccgcg cgcgggccca 480

ccctgttcgt cctggtcggc gacggctccg cgtggttcgt cttccagctc ggcgggctgg 540

gggcgctcaa cgacacgcgc atccgcgggc acctgctcgg ccggtacctc gtctcgtacc 600

aggtggtgcc cccgcccgtc tccgcgtggt actttgtgca gcgcccgcgc gagcgcccgc 660

gcctctcggg gccgccctcg ggcgcggagc tcgtggcctt cgacgcgccc ggcgtccggc 720

gcacgtacac cacggcggcg gtgtggcccg cggaggtggc cgtcctcgcg gacgcggagg 780

cgcgctgccc cgcggccgtc ttcaacgtga cgctgggcga ggccttcctc ggcctgcgcg 840

tcgcgctgcg ctccttcctg ccgctggagg tcatcatctc cgccgagcgg atgcgcatga 900

tcgcgccccc ggcgctcggc tcggacctgg agccgccggg cccgcccgcg ggccgcttcc 960

acgtgtacac gctcggcttc ctctccgacg gggccatgca ccagacgatg cgcgacgtgg 1020

ccgcctacgt gcacgagagc gacgactacc 1050

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<211> 1783

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 60

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 120

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 180

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 240

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 300

taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg 360

gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca 420

acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg 480

tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg 540

ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 600

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 660

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 720

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 780

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 840

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 900

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 960

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 1020

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 1080

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 1140

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 1200

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 1260

gagctgtaca agtccggact cagatctcga gctcaagctt cgaattctgc agtcgacggt 1320

accgcgggcc cgggatccac cggatctaga taactgatca taatcagcca taccacattt 1380

gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa 1440

atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 1500

aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 1560

tccaaactca tcaatgtatc ttaacgcgta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt 1620

cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat 1680

cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa 1740

gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cga 1783

<210> 16

<211> 4457

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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