多重生化反应中分析物的定量方法

本申请要求2018年7月11日提交的第62/696,558号美国临时专利申请的权益，该临时申请为了所有目的通过引用整体并入本文。

背景技术

在PCR中，通过将每个核酸靶标与不同的荧光标签相关联，来实现在单个反应中检测多个靶核酸序列。PCR可用来扩增核酸以供分析。本公开提供了一种无需固定、分离、质谱分析或解链曲线分析(melting curve analysis)即可对单个样品体积中的一种或多种分析物的存在进行定量的精确方法。

发明内容

在一些方面，本文公开了用于对样品中的核酸进行定量的方法、系统和组合物。在一方面，本公开提供了一种对样品中的至少第一核酸和第二核酸进行定量的方法，该方法包括：(a)提供混合物，其包含：(i)所述第一核酸和所述第二核酸；(ii)第一检测探针，其被配置为当存在所述第一核酸时并且在经受反应条件时生成第一信号；(iii)第二检测探针，其被配置为当存在所述第二核酸时并且在经受反应条件时生成第二信号；(b)使所述混合物经受所述反应条件，从而生成所述第一和第二信号；(c)测量(i)所述第一信号在第一波长范围内的强度，(ii)所述第一信号在第二波长范围内的强度，(iii)所述第二信号在第三波长范围内的强度；(d)生成从c)中测得的所述强度(i)和所述强度(ii)得出的第一数据集，并生成从(c)中测得的所述强度(iii)得出的第二数据集；以及(e)处理所生成的第一数据集和所生成的第二数据集，其中所述处理使用从参考数据集得出的参考量化参数来生成所述生成的第一和第二数据集的量化参数，其中所述参考数据集对应于参考条件，其中所述参考条件包括参考核酸的量，从而对所述第一核酸和第二核酸进行定量。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在(c)中，测量所述第一信号或第二信号在(iii)第三波长范围内的强度。在一些实施方案中，所述测量包括使用多通道检测器检测所述第一信号或第二信号。在一些实施方案中，所述第一信号或第二信号包括电磁辐射。在一些实施方案中，所述第一信号或第二信号是通过荧光发射生成的。在一些实施方案中，所述第一信号或第二信号是通过化学发光生成的。在一些实施方案中，所述第一波长范围和所述第三波长范围包括相同的波长。在一些实施方案中，所述第一波长范围和所述第三波长范围不包括相同的波长。

在一些实施方案中，所述处理包括将所述第一或第二数据集拟合至曲线。在一些实施方案中，所述第一或第二数据集被绘制为曲线。在一些实施方案中，所述第一或第二数据集是动力学特征。在一些实施方案中，所述第一或第二核酸包含DNA。在一些实施方案中，所述第一或第二核酸包含RNA。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在(c)中，测量所述第二信号在(iv)第四波长范围内的强度，并且进一步包括，在d)中，生成从所述强度iii)和所述第二信号在所述第四波长范围内的强度得出的所述第二数据。在一些实施方案中，所述第四波长范围与所述第一波长范围或所述第二波长范围相同。在一些实施方案中，所述第三波长范围与所述第一波长范围或所述第二波长范围相同。在一些实施方案中，所述处理包括将数据点鉴定为与所述第一数据集相对应。在一些实施方案中，所述处理包括将数据点鉴定为与所述第二数据集相对应。在一些实施方案中，所述定量包括计算相对定量。在一些实施方案中，所述相对定量是通过比较所述第一数据集和所述第二数据集而生成的。

在另一方面，本公开提供了一种系统，其包括控制器，该控制器包括或能够访问包含非暂时性计算机可执行指令的计算机可读介质，所述非暂时性计算机可执行指令在被至少一个电子处理器执行时实现包括以下步骤的方法：(a)提供混合物，其包含：(i)至少一种核酸；(ii)至少第一检测探针，其被配置为当存在所述至少一种核酸时并且在经受反应条件时生成信号；(b)使所述混合物经受所述反应条件，从而生成所述信号；(c)测量(i)所述信号在第一波长范围内的强度和(ii)所述信号在第二波长范围内的强度；(d)生成从(c)中测得的所述强度得出的数据集；以及(e)处理所生成的数据集，其中所述处理使用从参考数据集得出的参考量化参数来计算所生成的数据集的量化参数，其中所述参考数据集对应于参考条件，其中所述参考条件包括参考核酸的量，从而对所述至少一种核酸进行定量。

在另一方面，本公开提供了一种用于对样品中的至少一种核酸进行定量的系统，其包括：(a)包含所述至少一种核酸的所述样品；(b)第一检测探针，其被配置为当存在所述至少一种核酸时并且在经受反应条件时生成信号；(c)一个或多个检测器，其被配置为测量(i)所述信号在第一波长范围内的强度和(ii)所述信号在第二波长范围内的强度；和(d)处理器，其被配置为：(i)生成从所测得的c)的强度得出的数据集；以及(ii)通过使用从参考数据集得出的参考量化参数来计算所生成的数据集的量化参数，来处理所述生成的数据集，其中所述参考数据集对应于参考条件，其中所述参考条件包括参考核酸的量。

在一些实施方案中，所述系统进一步在(c)中包括被配置为测量(iii)所述信号在第三波长范围内的强度的检测器。在一些实施方案中，所述检测器包括多通道检测器。在一些实施方案中，所述定量包括计算绝对定量。

在另一方面，本公开提供了一种对样品体积中的至少一种核酸进行定量的方法，该方法包括：(a)提供混合物，其包含：(i)至少一种核酸；(ii)第一检测探针，其被配置为当存在所述至少一种核酸时并且在经受反应条件时生成信号；(b)使所述混合物经受所述反应条件，从而生成所述信号；(c)测量(i)所述信号在第一波长范围内的强度和(ii)所述信号在第二波长范围内的强度；(d)生成从c)中测得的所述强度得出的数据集；以及(e)处理所生成的数据集，其中所述处理使用从参考数据集得出的参考量化参数来计算所生成的数据集的量化参数，其中所述参考数据集对应于参考条件，其中所述参考条件包括参考核酸的量，从而对所述至少一种核酸进行定量。

在一些实施方案中，所述方法不包括固定、分离、质谱分析或解链曲线分析。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在(c)中测量(iii)所述信号在第三波长范围内的强度。

在一些实施方案中，使所述混合物经受所述反应条件包括向所述混合物施加电磁辐射。在一些实施方案中，所述测量包括使用多通道检测器检测所述信号。在一些实施方案中，所述信号包括电磁辐射。在一些实施方案中，所述电磁辐射包括一定波长的电磁辐射。在一些实施方案中，其中所述电磁辐射包括多个波长的电磁辐射。在一些实施方案中，所述信号是通过荧光发射生成的。在一些实施方案中，所述信号是通过化学发光生成的。在一些实施方案中，所述第一波长范围和所述第二波长范围包括相同的波长。在一些实施方案中，所述第一波长范围和所述第二波长范围不包括相同的波长。

在一些实施方案中，所述检测探针被配置为与所述至少一种核酸退火。在一些实施方案中，所述检测探针被配置为在所述检测探针的一部分降解时生成所述信号。在一些实施方案中，所述检测探针包含荧光团或染料。在一些实施方案中，所述混合物进一步包含扩增寡聚物。在一些实施方案中，所述扩增寡聚物包含与至少所述核酸的序列的一部分互补的序列。在一些实施方案中，所述反应条件包括DNA延伸反应的条件。在一些实施方案中，所述DNA延伸反应是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述聚合酶链反应是定量聚合酶链反应(qPCR)。

在一些实施方案中，所述处理包括使用数学算法。在一些实施方案中，所述数学算法包括期望最大化、最近邻分析、基本模型参数化或贝叶斯估计。在一些实施方案中，所述数学算法包括过程参数。在一些实施方案中，所述过程参数包括a)循环阈值，b)幅度，或c)斜率。在一些实施方案中，所述处理包括将所生成的数据集拟合至曲线。在一些实施方案中，所述数据集被绘制为曲线。在一些实施方案中，数据集包含动力学特征。在一些实施方案中，所述参考条件包括扩增反应条件。在一些实施方案中，所述参考条件包括a)温度，b)pH，c)所述参考核酸的浓度，或其组合。在一些实施方案中，所述参考数据集对应于通过在扩增参数下扩增所述参考核酸而生成的数据集，其中所述参考数据集指示扩增参数，其包括：a)引物浓度，b)聚合酶浓度，c)聚合酶类型，d)参考核酸浓度，e)热循环数，f)热循环速率，g)热循环时间长度，h)探针序列；i)引物序列，或其组合。

在一些实施方案中，所述定量包括计算绝对定量。在一些实施方案中，所述参考数据集是使用预定浓度的所述参考核酸生成的。

在一些实施方案中，至少一种核酸来源于生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液或血浆。在一些实施方案中，所述生物样品衍生自病毒。在一些实施方案中，所述至少一种核酸包含DNA。在一些实施方案中，所述DNA包括基因组DNA。在一些实施方案中，所述至少一种核酸包含RNA。在一些实施方案中，所述RNA包括mRNA。

附图说明

图1B示出了在荧光多重PCR中由包含具有相似但不同的C

图2A-2F示出了包含靶标(A)变性肺病毒和FluB、(B)变性肺病毒和腺病毒、(C)PIV1和PIV3、(D)PIV 1和PIV2、(E)PIV3和PIV2、(F)RSVA和RSVB的不同组合的多重测定。

具体实施方式

以下描述提供了用于全面理解并允许描述本技术的各个实施方案的具体细节。所使用的术语旨在以最广泛的合理方式解释，即使与某些实施方案的详细描述一起使用。

在详细描述本教导之前，应当理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因此可以有所不同。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。此外，就说明书和/或权利要求书中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“如”或其变化形式而言，这些术语并非限制性的，并且旨在以与术语“包含”类似的方式为包含性的。除非明确指出，否则说明书中“包含”各种组分的实施方案也被理解为“由所列举的组分组成”或“基本上由所列举的组分组成”。

如本文所用的，术语“通道”、“颜色通道”或“光学通道”通常是指波长范围。可以基于去除或滤出特定波长的特定滤光器来设置或确定通道。术语“通道”、“颜色通道”和“光学通道”可互换使用。

聚合酶链反应(PCR)是在具有核酸聚合酶和引物的反应混合物中指数扩增特定核酸靶标的方法。引物是短的单链寡核苷酸，其互补于靶序列的正链和负链的3’序列。该反应混合物在重复的加热和冷却步骤中循环。加热循环使双链核酸靶标变性或分成单链模板。在冷却循环中，引物与模板上的互补序列结合。在模板被引发后，核酸聚合酶产生原始模板的拷贝。重复循环在每个循环中以指数方式将靶标扩增2倍，导致靶序列在30个循环中增加大约10亿倍(Saiki等人，1988)。

实时PCR(qPCR)是通过记录每个循环由嵌入染料如SYBR Green或靶标特异性报告探针生成的荧光来监测PCR反应的过程。这通常在实时PCR仪上进行，该PCR仪执行样品的热循环以完成PCR循环，并且在每个循环中的指定点通过一系列激发/发射滤光器组来测量每个通道中的样品的荧光。

在本文中可互换使用的引物或“扩增寡聚物”是指被配置为与另一种核酸结合并促进一个或多个反应(例如，转录、核酸合成和核酸扩增)的寡核苷酸或核酸。引物可以是双链的。引物可以是单链的。引物可以是正向引物或反向引物。正向引物和反向引物可以是与双链核酸的相对链结合的引物。例如，正向引物可以结合源自核酸的第一链(例如，Watson链)的区域，而反向引物可以结合源自核酸的第二链(例如，Crick链)的区域。正向引物相对于反向引物可以结合更靠近基因起始位点的区域，或者相对于反向引物可以结合更靠近基因末端位点的

通常，靶标特异性寡核苷酸探针是与所扩增的靶标的一条链互补的短寡核苷酸。该探针缺少3’羟基，因此无法被DNA聚合酶延伸。

使用靶基因或序列的扩增技术来确定(例如量化)靶基因或序列的初始浓度。初始浓度可以被称为循环阈值(C

通常，在扩增两个不同的扩增子(例如，两个不同的靶基因)的情况下，通常使用终点解链曲线分析来确定是否扩增了单个特定扩增子，是否扩增了两个扩增子，或者是否两个扩增子均未扩增。在成功的扩增中，如果两个扩增子的靶标均存在并且可以计算每个扩增子的C

根据本公开的各个实施方案，通过分析多重反应的幅度曲线(也称为总幅度曲线)可以发现未知的初始浓度(例如，C

在一些情况下，扩增反应之一是对照反应，其C

根据本公开的一些实施方案，提供了分析多重扩增子的总幅度曲线(例如，对应于总检测强度)的方法，从而使得能够推导每个多重反应的C

通过检查每个斜率的初始幅度，可以确定在每个斜率期间，单个扩增子正在被扩增(例如，通过验证代表指数扩增速率的斜率幅度)。尽管确立了C

两个靶标的扩增在不同循环数下发生的情况使得通过使用简单的数学分析，例如通过使用总幅度曲线的双导数，相对容易地确定每个反应的C

然而，在一些情况下，可能难以通过使用简单的数学分析来确定每个反应的C

图1显示了对于使用两个靶标(每个靶标分别由相应的扩增子标识)的多重反应的情况，在幅度曲线之间的各种可能的关系。假定反应是适当的，例如以预期的效率(例如幅度斜率)扩增正确的靶标。

在图1B中，总检测信号(例如，经由单个检测通道检测到的总发射荧光强度)由总幅度曲线(总)表示，总幅度曲线(总)对应于各个幅度曲线(扩增子1)和(扩增子2)的总和，其中扩增子1是鼻病毒，而扩增子2是RSVA。

在图1B所示的情况下，C

由于两个靶标之间C

然而，通过用在超过一个荧光通道中发荧光的荧光探针编码核酸靶标，提供了一种无需固定、分离、质谱分析或解链曲线分析即可对单个样品体积中至少一种核酸分析物的存在进行定量的方法；从而克服了无法精确量化多重反应中的相似靶标的问题。

图1A示出了qPCR运行的参数轨迹，其中用针对两个通道的荧光探针编码RSVA，从而根据先扩增的靶标生成不同的曲线形状。X轴绘出在一个通道中的强度，而Y轴绘出在第二个通道中的强度。值得注意的是，两个靶标的交叉点揭示了qPCR反应的终点。

通过直接将一个或多个靶标的幅度曲线与标准曲线进行比较，所公开的方法可用来确定绝对定量。类似地，所公开的方法通过先确定至少第一靶标与标准曲线的绝对定量，之后相对于第一扩增靶标比较第二靶标，可以用来确定相对定量。根据本公开的各个实施方案的算法可以用来分离不同的扩增曲线。

应当指出，尽管呈现了通过扩增两个不同靶标而获得的两个不同的扩增子，但是对两个靶标的多重反应不应被视为对所提出的实施方案的限制，而是如本文所公开的发明构思的示例性情况。相应地，可以将图1A的方法扩展为在测定中包括许多靶标。图2显示了在与图1相同的测定中，靶标的不同组合的另外6种组合。

本文公开了一种无需固定、分离、质谱分析或解链曲线分析即可对单个样品体积中的一种或多种分析物进行定量的方法。如本文所述的方法可以用来对样品体积中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种分析物进行定量。首先，可以提供包含多个核酸分子和多个寡核苷酸探针的混合物。所述多个核酸分子可以衍生自和/或可以对应于样品中的核酸靶标。所述多个寡核苷酸探针可以各自对应于核酸靶标的不同区域。该混合物可以进一步包含其他试剂(例如，扩增试剂)，包括例如寡核苷酸引物、dNTP、核酸酶(例如，聚合酶)和盐(例如，Ca2+、Mg2+等)。接下来，可以在定量聚合酶链反应(qPCR)中使用该混合物，从而可以生成多个信号。所述多个信号中的至少一个可以在多个颜色通道中是可检测的。基于所述检测，可以对样品中的核酸靶标进行定量。所述多个信号中的信号可以仅在一个颜色通道中是可检测的。例如，在多个颜色通道中检测所述多个信号中的第一信号，并且第二信号仅在一个颜色通道中是可检测的，并且可以量化与第一和第二信号相关的分析物。在另一实例中，在第一两个颜色通道中检测所述多个信号中的第一信号，并在第二两个颜色通道中检测所述多个信号中的第二信号，并且第一两个颜色通道和第二两个颜色通道中的至少一个通道是相同或基本相同的颜色通道。可以在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50个或更多个通道中检测或测量信号。可以在不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50个或更少的通道中检测或测量信号。

所述多个信号可以由来自混合物的所述多个探针中的一个或多个探针生成。可以通过所述多个核酸分子的核酸扩增(例如，PCR)来生成所述多个信号。核酸扩增可以降解所述多个寡核苷酸探针(例如，通过核酸酶的活性)，从而生成所述多个信号。多个信号可以是多个荧光信号、多个化学发光信号或其组合。

在本文所述的多个方面中，对与信号检测有关的信号和数据进行处理，以便将信号和数据用于后续步骤或下游方法。该处理可以使用数学算法来分析或处理信号数据。在一些情况下，该处理可以使用从仪器或检测器获得的数据。该处理可以使用从多个通道或单个通道获得的数据。在一些情况下，该处理可以使用来自预计不会与来自给定探针或荧光团的信号相关的通道的数据。例如，该数据可包括从其中获得背景信号的参考通道获得的数据。该处理可以使用从给定检测装置的所有可用通道获得的数据。

用于数据处理的数学算法可包括期望最大化、最近邻分析、基本模型参数化、贝叶斯估计或其组合。该数学算法可以使用过程参数。过程参数的实例包括循环阈值、幅度或斜率的参数。

数据的处理可包括对数据进行作图。处理数据可以使用作图功能来分析单个或多个点，以便计算相关性或更好地可视化数据。数据可以被绘制为曲线。数据可以被表示为动力学特征，其中信号幅度可以相对于时间度量(如循环或秒)或可以被数学地转换成时间度量的度量(如频率)来作图。数据可以拟合至多种函数，以便从数据得出参数。例如，绘制的数据可以拟合至线性函数，使得可以从该数据得出斜率参数。

数据的处理还可包括将数据点确定为属于数据集。在一些情况下，同时分析多种分析物，其中从分析物生成的信号可包括来自不同分析物的重叠信号。处理数据可以减轻重叠的信号，或者可以将数据点与不同的数据集相关联，在该不同的数据集中，通过另一种方法或替代通道或检测器来检测信号。

在各个方面，参考条件用于与数据集进行比较，或用于得出参考参数，如参考量化参数。参考条件可包括已知浓度的试剂或分析物。参考条件可包括已知的反应条件，如溶液的温度或pH。例如，参考条件可包括参考核酸的浓度、量或数量。具有已知参数的参考条件可用来外推、内插或以其他方式计算单独样品中另一种核酸的浓度、量或数量。参考条件可包括可以被检测或处理的信号，或者如本文其他地方针对其他任何信号所述的信号。例如，来自参考条件的数据可以用来生成参考数据，该参考数据进而可以通过数学算法进行参数化，以生成参考量化参数。参考量化参数的生成可以用来直接与数据集的生成的量化参数进行比较，或者可以用来基于例如数据集的参数化、拟合、外推、内插或估计或参数集的参数来计算量化参数。

参考条件可能是特定于反应类型的。参考条件可包括扩增反应的条件。扩增反应的实例在本文其他地方描述。例如，参考条件可包括聚合酶的浓度或聚合酶的类型。例如，参考条件可包括：a)引物浓度，b)聚合酶浓度，c)聚合酶类型，d)参考核酸浓度，e)热循环数，f)热循环速率，g)热循环时间长度，h)探针序列；i)引物序列，或其组合。

在一些情况下，样品进一步包含另外的多个核酸分子和另外的多个寡核苷酸探针。所述另外的多个核酸分子可以衍生自和/或对应于另外的核酸靶标。所述另外的多个寡核苷酸探针可以各自对应于所述另外的核酸靶标的不同区域。

在各个方面，可以对核酸分子进行定量。该定量可以是绝对定量。例如，可以确定核酸起始量的摩尔浓度。这可以使用参考条件或量以及已知摩尔浓度的核酸来确定。定量可以是相对定量。例如，可以确定第二核酸具有比第一核酸更大的起始量。

样品可以是生物样品。样品可以来源于生物样品。生物样品可以是，例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便或泪液。生物样品可以是流体样品。流体样品可以是血液或血浆。生物样品可包含无细胞核酸(例如，无细胞RNA、无细胞DNA等)。核酸靶标可以是来自病原体(例如，病毒、细菌等)的核酸。核酸靶标可以是被怀疑包含一个或多个突变的核酸。

在一些实施方案中，本公开提供了一种用于同时扩增、检测和/或量化样品中的至少一种分析物的多重测定。在一些实施方案中，本公开的方法可以用来检测和/或量化样品中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000种或更多种不同的目标分析物。在一些实施方案中，本公开的方法可以用来检测和/或量化样品中至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000种或更少的不同的目标分析物。

在一些情况下，可以使用化学组合物中的试剂运行测定。测定可以使用试剂来进行反应。该反应可包括杂交反应。例如，该试剂可包含核酸并与另一种核酸杂交。该核酸和该另一种核酸可以彼此互补。该反应可包括延伸反应。例如，该反应可包括通过添加核苷酸来延伸核酸分子。该反应可包括聚合酶链反应。

本文所述的方法可以在不使用固定、分离、质谱分析或解链曲线分析的情况下进行。例如，样品试剂和分析物可以全部在溶液中。可以对分析物进行分析，而无需将分析物纯化或彼此物理分离。可以在不通过质谱法或任何类似技术获得大量分析物的情况下进行分析物的鉴定。另外，可以在不观察解链反应并将信号相对于温度作图的情况下使用该方法。例如，可以在不使分析物经受温度梯度的情况下鉴定分析物，以便分析其中分析物经历物理或化学变化时的特定温度。可以通过使用固定、分离、质谱分析或解链曲线分析的技术来证实本文所述的方法。

可以使用本公开的测定来检测任何数目的核酸靶标。在一些情况下，测定可以明确地检测至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50个或更多个核酸靶标。在一些情况下，测定可以明确地检测至多50、40、30、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个核酸靶标。测定可以包括任何数目的反应，其中这些反应的结果一起确定多个核酸靶标的存在或不存在的任何组合。测定可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个反应。单独的每个反应可能无法非简并地检测核酸靶标的任何组合的存在或不存在。然而，每个反应的结果一起可以明确地检测每个核酸靶标的存在或不存在。

反应可以在相同的样品溶液体积中进行。例如，第一反应可以在至少第一颜色通道中生成荧光信号，而第二反应可以在第二颜色通道中生成荧光信号，从而生成两个测量值以供比较。或者，可以在不同的样品溶液体积中进行反应。例如，第一反应可以在第一样品溶液体积中进行，并在至少两个通道中生成荧光信号，而第二反应可以在第二样品溶液体积中进行，并在相同的颜色通道或不同的颜色通道中生成荧光信号，从而生成两个测量值以供比较。

每个寡核酸探针可以用荧光团标记。可以在另一波长下发光的波长下激发荧光分子。荧光分子可以是人肉眼可见的。荧光分子可以是通过光谱方法可见或可鉴定的，以分析由包含荧光分子的溶液透射或吸收的光的波长。

荧光分子可具有电磁辐射的激发或发射波长的独特或已知的特征。荧光分子特征的检测可包括确定信号在不同波长下的一个或多个幅度。在一些情况下，荧光分子特征可包括在一定波长下的信号，该波长与化学组合物中的试剂可生成的波长重叠。在一些情况下，该分子的激发波长可包括与化学组合物中的试剂可生成的波长重叠的信号。在一些情况下，可以同时检测该反应和荧光分子的信号。可以使用的荧光分子的非限制性实例包括Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750、Cy3、Cy5、Texas Red、荧光素(FITC)、6-FAM、5-FAM、HEX、JOE、TAMRA、ROX、BODIPY FL、Pacific Blue、Pacific Green、香豆素、Oregon Green、Pacific Orange、三甲基罗丹明(TRITC)、DAPI、APC、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、藻红蛋白(PE)，量子点(例如Qdot 525、Qdot 565、Qdot 605、Qdot 705、Qdot 800)或其衍生物。

在一些方面，所公开的方法包括核酸扩增。扩增条件可包括热循环条件，其包括每个热循环的温度和时间长度。特定扩增条件的使用可用来修改每个信号的信号强度，从而使每个信号能够对应于核酸靶标的独特组合。扩增可包括使用酶来产生核酸的额外拷贝。扩增反应可包括使用如本文其他地方所述的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物可以使用特定序列来扩增特定序列。寡核苷酸引物可通过与引物上游和下游的序列杂交来扩增特定序列，并导致在上游引物与下游引物之间包含的序列的扩增。扩增反应可包括使用核苷酸三磷酸试剂。核苷酸三磷酸试剂可包括使用脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。核苷酸三磷酸试剂可以用作扩增的核酸的前体。扩增反应可包括使用如本文其他地方所述的寡核苷酸探针。扩增反应可包括使用酶。酶的非限制性实例包括热稳定酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。扩增反应可包括生成不同核苷酸类型的核酸分子。例如，靶核酸可包含DNA，并且可以生成RNA分子。在另一个实例中，可以使RNA分子经历扩增反应，并且可以生成cDNA分子。

本公开的方法可以包括热循环。热循环可以包括一个或多个热循环。热循环可以在适合于用PCR扩增模板核酸的反应条件下进行。模板核酸的扩增可能需要寡核苷酸引物与模板核酸结合或退火。适当的反应条件可以包括适当的温度条件、适当的缓冲液条件和适当试剂的存在。在一些情况下，适当的温度条件可以使得每个热循环在所需的退火温度下进行。所需的退火温度可能足以使寡核苷酸探针与核酸靶标退火。在一些情况下，适当的缓冲液条件可以使得在热循环过程中使用的缓冲液中存在适当的盐。适当的盐可以包括镁盐、钾盐、铵盐。适当的缓冲液条件可以使得适当的盐以适当的浓度存在。用于通过PCR扩增多个核酸靶标的每个成员的适当试剂可包括脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。dNTP可包括天然或非天然dNTP，包括例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP及其变体。

在各个方面，利用引物延伸反应来生成扩增产物。引物延伸反应通常包括以下的循环：将反应混合物在变性温度下孵育一段变性持续时间，以及将反应混合物在延伸温度下孵育一段延伸持续时间。在各个方面中的任一方面，可以进行引物延伸反应的多个循环。可以进行任何适当数目的循环。例如，进行的循环数可以小于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。进行的循环数可以取决于，例如，用来获得可检测的扩增产物(例如，可检测量的扩增DNA产物，其指示核酸样品中存在靶DNA)的循环数(例如，循环阈值(C

扩增反应产生可检测量的扩增核酸的时间可以根据核酸样品、靶核酸的序列、引物的序列、进行的特定核酸扩增反应和扩增的特定循环数、反应温度、反应pH值而不同。例如，靶核酸的扩增可以在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短或者5分钟或更短的时间段产生指示存在靶核酸的可检测量的产物。

在一些实施方案中，核酸的扩增可以在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短或者5分钟或更短的时间段产生可检测量的扩增DNA。

本公开的核酸靶标可以来源于生物样品。生物样品可以是来源于受试者的样品。生物样品可以包含任何数目的大分子，例如细胞大分子。生物样品可以来源于另一样品。生物样品可以是组织样品，如活检物、针芯活检物、针抽吸物或细针抽吸物。生物样品可以是流体样品，如血液样品、尿液样品或唾液样品。生物样品可以是皮肤样品。生物样品可以是颊拭子。生物样品可以是血浆或血清样品。生物样品可以包含一个或多个细胞。生物样品可以是，例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便或泪液。

核酸靶标可以来源于一个或多个细胞。核酸靶标可包括脱氧核糖核酸(DNA)。DNA可以是任何种类的DNA，包括基因组DNA。核酸靶标可以是病毒DNA。核酸靶标可包括核糖核酸(RNA)。RNA可以是任何种类的RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA和微小RNA。RNA可以是病毒RNA。

核酸靶标可含一个或多个成员。成员可以是核酸靶标的任何区域。成员可以具有任何长度。成员可以是，例如，至多1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、50000或100000个或更多个核苷酸。在一些情况下，成员可以是基因。核酸靶标可包括其检测可用于诊断一种或多种疾病的基因。基因可以是其检测可用于确定受试者中是否存在病原体的病毒基因或细菌基因。在一些情况下，本公开的方法可用于检测受试者中是否存在一种或多种感染原(例如，病毒)。

核酸靶标在反应中可以是各种浓度。可以将核酸样品稀释或浓缩，以获得不同浓度的核酸。核酸样品中核酸的浓度可以是至少0.1纳克/微升(ng/μL)、0.2ng/μL、0.5ng/μL、1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、40、ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、1000ng/μL、10000ng/μL或更高。在一些情况下，核酸样品中核酸的浓度可以是至多ng/μL、0.2ng/μL、0.5ng/μL、1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、40、ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、1000ng/μL、10000ng/μL或更低。

可以与本公开的方法同时、在其之前或之后处理样品。可以处理样品以纯化或富集核酸(例如，从血浆样品中纯化核酸)。可以处理包含核酸的样品，以纯化或富集目的核酸。

本公开的混合物和组合物可以包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以具有外切核酸酶活性。核酸酶可以具有内切核酸酶活性。核酸酶可以具有RNA酶活性。核酸酶可能能够降解包含一个或多个核糖核苷酸碱基的核酸。核酸酶可以是例如RNA酶H或RNA酶III。RNA酶III可以是例如切酶。核酸酶可以是内切核酸酶I，例如T7内切核酸酶I。核酸酶可能能够降解包含非天然核苷酸的核酸。核酸酶可以是内切核酸酶V，例如大肠杆菌内切核酸酶V。

核酸酶可以是聚合酶(例如，DNA聚合酶)。可以使用DNA聚合酶。可以使用任何合适的DNA聚合酶，包括可商购获得的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常是指能够以模板结合的方式将核苷酸掺入DNA链中的酶。聚合酶可以是Taq聚合酶或其变体。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热曲线。核酸酶在适当条件下可能能够降解寡核苷酸探针。例如，核酸酶可以是聚合酶，并且具有外切活性并降解探针，从而产生可检测的信号。核酸酶在适当条件下可能能够从寡核苷酸探针释放猝灭剂。

在本文其他地方公开的各个方面，进行反应。反应可以包括使核酸靶标与一个或多个寡核苷酸探针接触。反应可以包括使样品溶液体积(例如，小液滴、孔、管等)与多个寡核苷酸探针接触，每个寡核苷酸探针对应于多个核酸靶标之一，以生成由所述多个寡核苷酸探针生成的多个信号。反应可以包括聚合酶链反应(PCR)。

在本文其他地方公开的各个方面，使用寡核苷酸引物。本公开的寡核苷酸引物(或“扩增寡聚物”)可以是脱氧核糖核酸。寡核苷酸引物可以是核糖核酸。寡核苷酸引物可以包含一个或多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以是，例如，脱氧肌苷。

寡核苷酸引物可以是正向引物。寡核苷酸引物可以是反向引物。寡核苷酸引物的长度可以是约5个至约50个核苷酸。寡核苷酸引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个或更多个碱基对。寡核苷酸引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。寡核苷酸引物的长度可以是约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个碱基对。

一组寡核苷酸引物可包含配对的寡核苷酸引物。配对的寡核苷酸引物可包含正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物。正向寡核苷酸引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如，3’末端)杂交，而反向寡核苷酸引物可以被配置为与该核酸序列的第二区域(例如，5’末端)杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增该核酸序列。不同组寡核苷酸引物可以被配置为扩增不同的核酸靶标序列。例如，第一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的第一核酸序列，并且第二组寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度比第一核酸序列更短的第二核酸序列。在另一个实例中，第一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增给定长度的第一核酸序列，并且第二组寡核苷酸引物可以被配置为扩增长度比第一核酸序列更长的第二核酸序列。

混合物可包含多个正向寡核苷酸引物。多个正向寡核苷酸引物可以是脱氧核糖核酸。或者，多个正向寡核苷酸引物可以是核糖核酸。多个正向寡核苷酸引物的长度可以是约5个至约50个核苷酸。多个正向寡核苷酸引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个或更多个碱基对。多个正向寡核苷酸引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。

混合物可包含多个反向寡核苷酸引物。多个反向寡核苷酸引物可以是脱氧核糖核酸。或者，多个反向寡核苷酸引物可以是核糖核酸。多个反向寡核苷酸引物的长度可以是约5个至约50个核苷酸。多个反向寡核苷酸引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个或更多个碱基对。多个反向寡核苷酸引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。

一组寡核苷酸引物(例如，正向引物和反向引物)可被配置为扩增给定长度的核酸序列(例如，可以与相距给定距离的核酸序列的区域杂交)。一对寡核苷酸引物可被配置为扩增长度为至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275或至少300个碱基对(bp)或更长的核酸序列。一对寡核苷酸引物可被配置为扩增长度为至多300、至多275、至多250、至多225、至多200、至多175、至多150、至多125、至多100、至多75或至多50bp或更短的核酸序列。

在一些方面，混合物可包含用于PCR反应的一种或多种合成(或以其他方式生成的，以与目的靶标不同)引物。

在一些方面，可以使混合物经历足以使寡核苷酸引物与核酸分子退火的条件。在一些方面，可以使混合物经历足以使多个寡核苷酸引物与核酸分子退火的条件。

在一些方面，可以使混合物经历足以使多个寡核苷酸引物与多个核酸靶标退火的条件。可以使混合物经历足以使核酸分子变性的条件。使混合物经历足以使寡核苷酸引物与核酸靶标退火的条件可包括在适合于扩增核酸靶标的反应条件下通过例如聚合酶链反应(PCR)使混合物发生热循环。

条件可以使得寡核苷酸引物对(例如，正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物)被核酸酶降解。寡核苷酸引物对可以被核酸酶的外切核酸酶活性降解。寡核苷酸引物对可以被核酸酶的RNA酶活性降解。寡核苷酸引物对的降解可导致寡核苷酸引物的释放。一旦释放，寡核苷酸引物对就可以与模板核酸结合或退火。

在本文其他地方公开的各个方面，使用寡核苷酸探针。本公开的样品、混合物、试剂盒和组合物可包含寡核苷酸探针，在本文中也称为“检测探针”或“探针”。寡核苷酸探针可以是核酸(例如，DNA、RNA等)。寡核苷酸探针可包含与核酸靶标的区域互补的区域。寡核苷酸探针的浓度可以使其相对于样品中的其他组分过量。

寡核苷酸探针可包含非靶标杂交序列。非靶标杂交序列可以是与核酸靶标序列的任何区域都不互补的序列。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是发夹检测探针。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子信标探针。分子信标探针的实例在例如美国专利7,671,184中提供，该专利通过引用整体并入本文。包含非靶标杂交序列的寡核苷酸探针可以是分子火炬(molecular torch)。分子火炬的实例在例如美国专利6,534,274中提供，该专利通过引用整体并入本文。

样品可包含超过一个寡核苷酸探针。多个寡核苷酸探针可以相同，或者可以不同。寡核苷酸探针的长度可以是至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或至少30个或更多个核苷酸。寡核苷酸探针的长度可以是至多30个、至多20个、至多15个、至多10个或至多5个核苷酸。在一些实例中，混合物包含第一寡核苷酸探针和一个或多个另外的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以是核酸(例如，DNA、RNA等)。寡核苷酸探针的长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个或更多个核苷酸。寡核苷酸探针的长度可以是至多50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸。

在一些情况下，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个不同的寡核苷酸探针。每个寡核苷酸探针可以对应于(例如，能够结合)样品中核酸靶标(例如，染色体)的给定区域。在一个实例中，第一寡核苷酸探针对第一核酸靶标的第一区域具有特异性，第二寡核苷酸探针对第一核酸靶标的第二区域具有特异性，第三寡核苷酸探针对第一核酸靶标的第三区域具有特异性。每个寡核苷酸探针可包含具有大致相等的发射波长的信号标签。在一些情况下，每个寡核苷酸探针包含相同的荧光团。在一些情况下，每个寡核苷酸探针包含不同的荧光团。在一些情况下，每个荧光团能够在单个光学通道中被检测。在其他情况下，荧光团可以在多个通道中被检测。在一些情况下，寡核苷酸探针可以与样品中的另一种寡核苷酸探针具有相似或相同的可检测剂或荧光团。在一些情况下，与样品中的另一种寡核苷酸探针相比，寡核苷酸探针可具有不同的可检测剂或荧光团。在一些情况下，寡核苷酸探针可以与样品中的另一种寡核苷酸探针具有相似的序列或能够结合相似的序列。在一些情况下，与样品中的另一种寡核苷酸探针相比，寡核苷酸探针可具有不同的序列或能够结合不同的序列。

探针可以对应于核酸靶标的区域。例如，探针可以与核酸靶标的区域具有互补性和/或同源性。探针可包含与核酸靶标的区域互补或同源的区域。对应于核酸靶标区域的探针可能能够在适当条件(例如，温度条件、缓冲液条件等)下与核酸靶标区域结合。例如，探针可能能够在适合于聚合酶链反应的条件下与核酸靶标的区域结合。探针可以对应于与核酸靶标相对应的寡核苷酸。例如，寡核苷酸可以是具有与核酸靶标互补的区域和与探针互补的区域的引物。

探针可以以特定浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以至少约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X、约8X或更高的浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以至多约8X、约7X、约6X、约5X、约4X、约3X或约2X的浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X或约8X的浓度提供。X可以是所公开的方法中提供的核酸探针的浓度。在一些情况下，X为至少50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM或更高。在一些情况下，X为至多500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM或50nM。X可以是核酸探针的任何浓度。

探针可以是与给定核酸靶标的区域互补的核酸。在本公开的方法和测定中使用的每个探针可包含至少一个荧光团。荧光团可以选自任何数目的荧光团。荧光团可以选自三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个荧光团。在单个反应中使用的一个或多个寡核苷酸探针可包含相同的荧光团。在一些情况下，在单个反应中使用的所有寡核苷酸探针均包含相同的荧光团。每个探针在被激发并与其对应的核酸靶标接触时可生成信号。信号可以是荧光信号。可以由一个或多个探针生成多个信号。

寡核苷酸探针可以与多个核酸靶标的任何成员具有小于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的互补性。寡核苷酸探针可以与所述多个核酸靶标的任何成员不具有互补性。

寡核苷酸探针可包含可检测标记。可检测标记可以是化学发光标记。可检测标记可包含荧光标记。可检测标记可包含荧光团。荧光团可以是，例如，FAM、TET、HEX、JOE、Cy3或Cy5。荧光团可以是FAM。荧光团可以是HEX。寡核苷酸探针可以进一步包含一种或多种猝灭剂。猝灭剂可以抑制从荧光团生成信号。猝灭剂可以是，例如，TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或Dabcy。猝灭剂可以是BHQ-1。猝灭剂可以是BHQ-2。

可以进行热循环，使得一个或多个寡核苷酸探针被核酸酶降解。寡核苷酸探针可以被核酸酶的外切核酸酶活性降解。寡核苷酸探针可以在降解时生成信号。在一些情况下，只有在混合物中存在多个核酸靶标的至少一个成员时，寡核苷酸探针才可以生成信号。

反应可以生成一个或多个信号。反应可以生成包含多个信号之和的累积强度信号。信号可以是化学发光信号。信号可以是荧光信号。信号可以由寡核苷酸探针生成。例如，激发包含发光信号标签的杂交探针可以生成信号。信号可以由荧光团生成。荧光团可以在从杂交探针上释放时生成信号。反应可以包括荧光团的激发。反应可以包括信号检测。反应可以包括检测来自荧光团的发射。

信号可以是荧光信号。信号可以对应于荧光强度水平。在本公开的方法中测量的每个信号可以具有不同的荧光强度值，从而对应于存在核酸靶标的独特组合。信号可以由一个或多个寡核苷酸探针生成。测定中生成的信号数可对应于存在的寡核苷酸探针和核酸靶标的数目。

N可以是在本公开的测定中在单个光学通道中检测到的信号的数目。N可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50或更多。N可以是至多50、40、30、24、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2。N可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50。

如将会认识到并在本文其他地方描述的，可以在多个不同的光学通道中生成成组信号，其中在单个光学通道中检测每组信号，从而显著增加在单个反应中能够测得的核酸靶标的数目。在一些情况下，在单个反应中检测两组信号。反应中检测到的每组信号可以包含相同数目的信号或不同数目的信号。

在一些情况下，可在寡核苷酸探针与核酸区域杂交的同时生成信号。例如，寡核苷酸探针(例如，分子信标探针或分子火炬)可以在与核酸杂交后生成信号(例如，荧光信号)。在一些情况下，可在寡核苷酸探针与核酸区域杂交之后，在寡核苷酸探针被核酸酶降解之后生成信号。

在寡核苷酸探针包含信号标签的情况下，该寡核苷酸探针当与寡核苷酸引物的区域结合时可以被降解，从而生成信号。例如，寡核苷酸探针(例如，

寡核苷酸探针可包含猝灭剂和荧光团，使得猝灭剂在寡核苷酸探针降解时释放，从而生成荧光信号。可以利用热循环生成一种或多种信号。热循环可以生成至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个信号。热循环可以生成至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个信号。多个信号可以是相同的类型或不同的类型。不同类型的信号可以是具有不同荧光波长的荧光信号。不同类型的信号可以由包含不同荧光团的可检测标记生成。相同类型的信号可以具有不同的强度(例如，相同荧光波长的不同强度)。相同类型的信号可以是在相同颜色通道中可检测的信号。相同类型的信号可以由包含相同荧光团的可检测标记生成。包含相同荧光团的可检测标记可以通过处于不同浓度的性质而生成不同的信号，从而生成相同信号类型的不同强度。

尽管已经使用荧光探针来阐释该原理，但是所公开的方法同样适用于提供包括电化学信号、化学发光信号、磁性粒子和表现出永久偶极的驻极体结构在内的可定量信号的其他任何方法。

在本公开的某些部分中，所述信号可以是荧光信号。例如，像荧光信号一样，以上描述的任何电磁信号也可以在波长方面进行表征，由此荧光信号的波长也可以按照颜色来描述。可以基于在特定波长或波长范围内测量强度来确定颜色，例如，通过确定不同波长处的荧光强度分布和/或通过使用带通滤波器确定特定波长范围内的荧光强度来确定颜色。

可以检测一个或多个信号的存在或不存在。可以检测一个信号，或者可以检测多个信号。可以同时检测多个信号。或者，可以顺序检测多个信号。可以在整个热循环过程中，例如在每个热循环结束时检测信号。可以在多通道检测器中检测信号。例如，可以使用检测器来观察信号，该检测器可以同时、基本同时或顺序地观察多个波长范围内的信号。可以在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个通道中观察信号。可以在不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2个或更少的通道中观察信号。

在一些情况下，信号强度随每个热循环而增加。信号强度可以以S形的方式增加。信号的存在可以与多个靶核酸的至少一个成员的存在相关联。将信号的存在与多个靶核酸的至少一个成员的存在相关联可以包括建立信号强度阈值。对于不同的信号，信号强度阈值可以不同。将信号的存在与多个靶核酸的至少一个成员的存在相关联可以包括确定信号的强度是否增加超过信号强度阈值。在一些实例中，信号的存在可以与多个靶核酸的所有成员中至少一个成员的存在相关联。在其他实例中，第一信号的存在可以与多个靶核酸的成员的第一子集中至少一个的存在相关联，而第二信号的存在可以与多个靶核酸的成员的第二子集中至少一个的存在相关联。

信号的存在可以与核酸靶标的存在相关联。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个信号的存在可以与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸靶标中至少一个的存在相关联。信号的不存在可以与相应核酸靶标的不存在相关联。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个信号的不存在可以与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸靶标分子中的每一个的不存在相关联。

本公开还提供了用于分析的试剂盒。试剂盒可包含一个或多个寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以被冻干。不同的寡核苷酸探针可以以不同的浓度存在于试剂盒中。寡核苷酸探针可包含荧光团和/或一种或多种猝灭剂。

试剂盒可包含一组或多组如本文所述的寡核苷酸引物(或“扩增寡聚物”)。一组寡核苷酸引物可包含配对的寡核苷酸引物。配对的寡核苷酸引物可包含正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物。一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增与特定靶标相对应的核酸序列。例如，正向寡核苷酸引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如，3’末端)杂交，而反向寡核苷酸引物可以被配置为与该核酸序列的第二区域(例如，5’末端)杂交，从而被配置为扩增该核酸序列。不同组寡核苷酸引物可以被配置为扩增核酸序列。在一个实例中，第一组寡核苷酸引物可以被配置为扩增第一核酸序列，并且第二组寡核苷酸引物可以被配置为扩增第二核酸序列。被配置为扩增核酸分子的寡核苷酸引物可以在进行所公开的方法中使用。在一些情况下，试剂盒中的所有寡核苷酸引物都被冻干。

试剂盒可包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以是核酸聚合酶。核酸聚合酶可以是脱氧核糖核酸聚合酶(DNA酶)。DNA酶可以是Taq聚合酶或其变体。核酸酶可以是核糖核酸聚合酶(RNA酶)。RNA酶可以是RNA酶III。RNA酶III可以是切酶。核酸酶可以是内切核酸酶。内切核酸酶可以是内切核酸酶I。内切核酸酶I可以是T7内切核酸酶I。核酸酶可能能够降解包含非天然核苷酸的核酸。核酸酶可以是内切核酸酶V，例如大肠杆菌内切核酸酶V。核酸酶可以是聚合酶(例如，DNA聚合酶)。聚合酶可以是Taq聚合酶或其变体。核酸酶在适当条件下可能能够降解寡核苷酸探针。核酸酶在适当条件下可能能够从寡核苷酸探针释放猝灭剂。试剂盒可以包含关于在本文所述的方法中使用任何前述物质的说明书。

本文提供的试剂盒可用于例如计算至少第一和第二总和，每个总和是与第一和第二靶核酸相对应的多个靶信号的总和。

可以使用多种系统来执行本文公开的方法。可以配置系统，使得可以执行该方法的步骤。例如，所述系统可包括用于检测信号的检测器，如本文其他地方所述。该系统可包括被配置为处理、接收、绘制或以其他方式表示从检测器获得的数据的处理器。该处理器可被配置为处理数据，如本文其他地方所述。

本公开提供了计算机系统，其被编程用于实现本公开的方法。该计算机系统可以执行本公开的各个方面。计算机系统可以是用户的电子设备，或者是相对于该电子设备位于远程的计算机系统。该电子设备可以是移动电子设备。

计算机系统可包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)，中央处理单元可以是单核或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统可包括存储器或存储器位置(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口(例如，网络适配器)和外围设备，如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器、存储单元、接口和外围设备通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU通信。存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统可以借助于通信接口可操作地耦合至计算机网络(“网络”)。网络可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。网络在一些情况下是电信和/或数据网络。网络可包括能够实现分布式计算如云计算的一个或多个计算机服务器。在一些情况下，网络借助于计算机系统可以实现对等网络，这可以使得耦合至计算机系统的设备能够起到客户端或服务器的作用。

CPU可以执行一系列可以在程序或软件中体现的机器可读指令。所述指令可以存储在诸如存储器的存储器位置中。所述指令可被导向CPU，其随后可对CPU进行编程或以其他方式进行配置，以实现本公开的方法。由CPU执行的操作的实例可以包括获取、解码、执行和写回。

CPU可以是电路如集成电路的一部分。系统中的一个或多个其他组件可被包括在该电路中。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元可以存储文件，如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统可以包括位于计算机系统外部(诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统通信的远程服务器上)的一个或多个附加数据存储单元。

计算机系统可以通过网络与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统可以与用户(例如，操作者)的远程计算机系统进行通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板PC(例如，

如本文所述的方法可通过存储在计算机系统的电子存储位置上(例如存储器或电子存储单元上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。该机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用过程中，该代码可以由处理器执行。在一些情况下，该代码可从存储单元中检索并存储在存储器上，以备处理器访问。在一些情况下，可以不包括电子存储单元，而将机器可执行指令存储在存储器上。

可将该代码预编译并配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行过程中对其进行编译。该代码可以以编程语言的形式提供，该编程语言可以被选择为使得该代码能够以预编译或实时编译的方式执行。

本文提供的系统和方法的各方面，如计算机系统，可以在编程中体现。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，其一般为在某种类型的机器可读介质中携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或全部有形存储器，或其相关模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以随时为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分可以不时地通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可以使软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨越本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及经由各种空中链路所使用的。携带这类波的物理元件，如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。除非局限于非暂时性有形“存储”介质，否则如本文所用的诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，机器可读介质，如计算机可执行代码，可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机中的任何存储设备等，例如可用来实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外线(IR)数据通信期间生成的那些信号或波。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、其他任何磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、其他任何光学介质、穿孔卡片纸带、其他任何具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、其他任何存储器芯片或匣盒、传输数据或指令的载波、传输这类载波的线缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的其他任何介质。这些计算机可读介质形式中的许多形式可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列运载到处理器以供执行。

计算机系统可包括电子显示器或与电子显示器进行通信，该电子显示器包括用于提供例如数据图、动力学特征图、关于信号幅度的信息的用户界面(UI)。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

本公开的方法和系统可以通过一个或多个算法来实现。算法可以通过软件在由中央处理单元执行时实现。例如，该算法可以对数据点进行参数化，或使数据点拟合至指定的数学函数，以便对分析物进行定量。

实施例

当在PCR反应中检查分析物的动力学特征时，可以确定在每个斜率期间，单个扩增子正在被扩增(例如，通过验证代表指数扩增速率的斜率幅度)。因此，在两个靶标的扩增(即多重化)在不同循环数下发生的情况下，通过使用简单的数学分析，例如通过使用总幅度曲线的双导数，相对容易地确定每个反应的C

本文公开了一种使用在超过一个荧光通道中发荧光的荧光探针对单个样品体积中的至少一种核酸分析物的存在进行定量的方法，从而生成两个独特的曲线特征，其可用来区分扩增循环并对PCR反应中的一个或多个靶标进行定量。

根据本公开的一些实施方案，分析多重扩增子的总幅度曲线(例如，对应于总检测强度)的方法使得能够推导每个多重反应的C

所述方法可以使用至少一种在至少两个不同的颜色通道中可测量的荧光团。如前所述，根据本公开的各个实施方案的方法可以扩展到多个(例如，超过两个)扩增子。

图1显示了对于使用两个靶标(每个靶标分别由相应的扩增子标识)的多重反应的情况，在幅度曲线(即，动力学特征)之间的各种可能的关系。假定反应是适当的，例如以预期的效率(例如幅度斜率)扩增正确的靶标。

在图1B中，总检测信号(例如，经由单个检测通道检测到的总发射荧光强度)由总幅度曲线(总)表示，总幅度曲线(总)对应于各个幅度曲线(扩增子1)和(扩增子2)的总和，其中扩增子1是鼻病毒，而扩增子2是RSVA。

图1B绘制了两个靶标(鼻病毒和RSVA)在单通道多重反应中的强度值，其中每个靶标包含各种浓度的模板。长划线表示存在5,000个拷贝的每个模板的实验条件。短划线表示存在5,000个拷贝的RSVA和50个拷贝的鼻病毒的实验条件。实线表示存在50个拷贝的RSVA和5,000个拷贝的鼻病毒的实验条件。三个重复中的每一个都表示从三个单独的孔中提取的数据(即，数据是从三个单独的扩增事件汇总的)。重要的是，长划线数据示出了鼻病毒和RSVA靶标同时开始扩增的扩增事件。短划线数据示出了RSVA在鼻病毒之前开始扩增的扩增事件，而实线数据示出了鼻病毒在RSVA之前开始扩增的扩增事件。

在图1B所示的情况下，C

C

然而，通过用在超过一个荧光通道中发荧光的荧光探针编码核酸靶标，提供了一种无需固定、分离、质谱分析或解链曲线分析即可对单个样品体积中至少一种核酸分析物的存在进行定量的方法；从而克服了如图1B所示无法精确量化多重反应中的相似靶标的问题。

图1A例示了用针对两个通道的荧光探针编码RSVA，从而根据先扩增的靶标生成不同的曲线形状的情况。在示例性实施方案中，鼻病毒和RSVA在具有不同输入浓度的模板的PCR反应中被扩增。同样，长划线表示存在5,000个拷贝的每个模板的实验条件。短划线表示存在5,000个拷贝的RSVA和50个拷贝的鼻病毒的实验条件。实线表示存在50个拷贝的RSVA和5,000个拷贝的鼻病毒的实验条件。

图1A示出了qPCR运行的参数轨迹，其中X轴绘出了在一个通道中的强度，而Y轴绘出了在第二个通道中的强度。长划线数据示出了鼻病毒和RSVA靶标同时开始扩增的扩增事件。短划线数据示出了RSVA在鼻病毒之前开始扩增的扩增事件，而实线数据示出了鼻病毒在RSVA之前开始扩增的扩增事件。值得注意的是，两个靶标的交叉点揭示了qPCR反应的终点。

根据本公开的各个实施方案的算法可以用来分离不同的扩增曲线。通过直接将一个或多个靶标的幅度曲线与标准曲线进行比较，方法可用来确定绝对定量。类似地，该方法通过先确定至少第一靶标与标准曲线的绝对定量，之后相对于第一扩增靶标比较第二靶标，可以用来确定相对定量。各种方法可包括期望最大化、最近邻分析、基本模型参数化、贝叶斯估计或其他。

应当指出，尽管呈现了通过扩增两个不同靶标而获得的两个不同的扩增子，但是对两个靶标的多重反应不应被视为对所提出的实施方案的限制，而是本文所公开的发明构思的示例性情况。相应地，可以将图1A的方法扩展为在测定中包括许多靶标。图2显示了在与图1相同的测定中，靶标的不同组合的另外6种组合。

在示例性方法中，构建了12重(12-plex)测定。在十二个核酸靶标中，十二个核酸靶标中的八个用在超过一个荧光通道中发荧光的荧光探针特异性编码。同时扩增这些靶标，从而为扩增的靶标的每种组合生成至少两组独特的曲线特征结果。

图2A示出了存在变性肺病毒和FluB时的实验数据。图2B示出了存在变性肺病毒和腺病毒时的实验数据。图2C示出了存在PIV1和PIV3时的实验数据。图2D示出了存在PIV1和PIV2时的实验数据。图2E示出了存在PIV3和PIV3时的实验数据。图2F示出了存在RSVA和RSVB时的实验数据。

对多个靶标进行定量的另一种方法可涉及使用通道之间的交叉关联来确定靶标可以扩增时的循环。可以使用各种相关方法，结合或不结合其他模型，如基础S形曲线的分解。

该方法不必限于示例性PCR实例，并且可以在利用多个基于时间的信号的其他类型的测定中使用，作为采用多种颜色和/或斑点位置的ELISA的示例。这不必限于基于时间的信号，例如可以使用空间分隔作为维度。