谷子叶片直接PCR扩增的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及谷子叶片直接PCR扩增的方法。

背景技术

谷子(学名：Setaria italica)：属禾本科的一种植物。古称稷、粟，亦称粱。一年生草本；秆粗壮、分蘖少，狭长披针形叶片，有明显的中脉和小脉，具有细毛。

在谷子分子育种的实验工作中，经常需要对大量材料进行PCR扩增检测。现有技术的常规做法是用CTAB植物基因组DNA提取法，虽然可以获得质量高的DNA，满足大多数的分子检测需求。但传统的CTAB植物基因组DNA提取法提取步骤多，再进行PCR扩增，并需要用到苯酚、氯仿等多种有毒的有机溶剂，因此，成本较高、提取时间较长，并对操作人员、环境产生不利影响。

如果直接用叶子进行PCR扩增，由于叶子中的各种杂质抑制了PCR酶活性，导致了PCR扩增效率低下，甚至无PCR产物，若选用抗耐性高的PCR酶，成本随之大幅增加。同时，其它的PCR增强剂，如BSA、DMSO、甲酰胺等，常常在模板GC含量>70％，或者引物有二级结构的时候应用，使用上述增强剂可以打开这些结构，增加特异性，降低退火温度，但是会使PCR产率降低，且需要增加taq酶的量以保证扩增的完成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷子叶片直接PCR扩增的方法。

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将谷子叶片放入MgCl

(2)进行PCR扩增。

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，所述PCR扩增包括以下步骤：

(a)预变性：94℃5min，1个循环；

(b)扩增：94℃30s，55℃30s，72℃20s，35个循环；

(c)再延伸：72℃10min，1个循环；

(d)保存：4℃10min，1个循环。

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，所述PCR反应体系包括PCR MASTER MIX 20～30uL、引物1～2uL、ddH

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，所述PCR MASTER MIX包括Taq DNA Polymerase、dNTP混合物、MgCl

其中，做PCR时MASTER MIX是指反应混合物，即PCR试验时使用的预混物。所述PCRMASTER MIX包括Taq DNA Polymerase、dNTP混合物、MgCl

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，向所述PCR反应体系中添加2.5uL 20mM MgCl

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，所述引物包括正向引物F和反向引物R，其中，

正向引物F：5’-CGTTTAGTAATGACATAATT-3’；

反向引物R：5’-GCAGAATAAGGTAAGCTTAT-3’。

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，所述谷子叶片选自新鲜嫩叶。

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，所述谷子叶片的形状为圆形，直径为1～3mm。

根据本发明具体实施方式的谷子叶片直接PCR扩增的方法，将反应体系加入到EP管中，震荡混匀后瞬时离心，进行PCR扩增。

本发明的有益效果：

本发明的PCR扩增方法不需要提取DNA，直接利用叶片进行DNA的PCR扩增，采用MgCl

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为谷子叶片直接PCR产物的电泳检测结果，其中，M：D2000 Marker；1-9：用豫谷18的叶片作为模板直接进行PCR扩增；对照组：用豫谷18的叶片提取高质量的DNA作为模板进行PCR扩增。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1谷子叶片直接PCR

1.1配制直接扩增PCR体系

PCR反应体系如下表所示：

上述PCR体系中还包含1uL的叶片。

正向引物F：5’-CGTTTAGTAATGACATAATT-3’；

反向引物R：5’-GCAGAATAAGGTAAGCTTAT-3’。

2×Hieff

1.2 PCR扩增

(1)用打孔器取谷子新鲜嫩叶片1片(直径为1-3mm的圆形叶片)放入配制好反应体系的EP管中，震荡混匀后瞬时离心，放在PCR仪上进行PCR反应；

(2)PCR扩增条件按照下表设置:

1.3琼脂糖凝胶电泳检测

按gDNA的检测方法进行琼脂糖凝胶电泳，检测所提取DNA的完整度及纯度。

(1)在水平电泳槽内加入650mL 1×TAE电泳缓冲液。将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，用手指轻压胶孔附近，将胶孔中的气泡赶尽，将琼脂糖凝胶取出加样；

(2)取1μL需要电泳的DNA样品加入点样板孔中，再依次加入1μL 6×loadingbuffer(含gelred染料)、4μL灭菌水，终体积为6μL，混匀后加到凝胶点样孔中；

(3)凝胶每排的第一个点样孔预留为Marker点样孔，该孔中用1μL Trans15K DNAMarker代替样品，再依次加入1μL 6×loading buffer(含gelred染料)、4μL灭菌水，终体积为6μL，混匀后加到凝胶点样孔中。

(4)将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，使加样孔一侧置于电泳槽阴极端。

(5)接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，设置电泳程序(恒压120V，20min)，开始电泳。

电泳结果如图1所示，以叶片为模板和以高质量的DNA为模板进行PCR，扩增得到的目的条带是一致的，且重复性稳定。因此，本发明的发明利用谷子叶片直接PCR，省去了DNA提取步骤，可以大大提高分子检测的效率。

实施例2验证MgCl

本发明通过添加20mM MgCl

表1 MgCl

结果如表1所示，MgCl

因此，本发明方法通过叶片组织直接进行PCR扩增，叶片取用量为1uL,其中DNA只有微量，这种情况下，本发明不需要调整酶、dNTP量或其他因素条件，仅是直接添加MgCl

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。