一种液质联用测定生物体液样品中cAMP浓度的高灵敏方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种液质联用测定生物体液样品中cAMP浓度的高灵敏方法。

背景技术

环磷酸腺苷(cAMP)是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”。在体内可以促进心肌细胞的存活，增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力；促进钙离子向心肌细胞内流动，增强磷酸化作用，促进兴奋-收缩偶联，提高心肌细胞收缩力，增加心输出量；同时还扩张外周血管，降低心脏射血阻抗，减轻心脏前后负荷，增加心排出量，改善心功能，从而对心脏起到营养心肌、正性肌力、舒张血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用，在临床上主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死。因此，检测动物血浆与尿液中环磷酸腺苷浓度具有重要的生理意义，对于评价药物对动物分泌环磷酸腺苷的影响也有重要作用。

目前，最常用的体液(血浆、尿液、脑脊液等)中cAMP检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)。虽然ELISA应用较广泛，但是仍存在一些缺点，主要为操作过程有些繁琐，易出现假阳性结果，重复性待提高。液相色谱串联质谱法相对于ELISA具有更加简单、快速、准确的优点。

本方法除首次建立了体液中cAMP液相色谱串联质谱检测法外，并且针对现有方法检测过程繁琐、时间长的缺点进行了改进和优化，以节省检测时间、同时保证了检测的准确性和可靠性，从而使之更加有利于评价药物和临床样本的高通量筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液质联用测定生物体液样品中cAMP浓度的高灵敏方法。

本发明公开了一种液质联用测定生物体液样品中cAMP浓度的高灵敏方法，包括下列步骤：

(1)待测样品预处理；

(2)液相色谱-质谱联用检测进行标准曲线制备；

(3)液相色谱-质谱联用检测待测样品中cAMP浓度；

所述待测样品预处理为生物体液样品以磷酸二酯酶抑制剂(P DE s)为稳定剂，以待测物的氘代化合物为内标，取一定体积的血浆与尿液样品，加入一定体积的氘代内标混合溶液，混合后再加入到

在优选例中，所述生物体液样品为血浆、尿和/或脑脊液；所述生物体液样品为血浆，其含有抗凝剂，如EDTA-K2(肝素钠)等。

优选例中，磷酸二酯酶抑制剂优选为PDE4选择性抑制剂或PDE7选择性抑制剂，更优选为IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、尼莫地平、长春西汀、IC86340、IC224、EHNA、BAY60-7750、IC933、双嘧达莫、西洛他唑、西洛酰胺、米力农、氨力农、依诺昔酮和、氰胍佐旦、茶碱、咯利普兰、吡拉米司特、罗氟司特、西洛司特、BRL-50481、IC242、喹唑啉类小分子化合物S14、噻二唑类小分子化合物VP1.15；最优选为IBMX。

在一优选例中，所述待测样品预处理为血浆与尿液以EDTA-K2与IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)为抗凝剂与稳定剂，以待测物的氘代化合物为内标，取一定体积的血浆与尿液样品，加入一定体积的氘代内标混合溶液，混合后再加入到

在一优选例中，所述液相色谱-质谱联用检测为：

①液相色谱测定，条件为：色谱柱：GL Sciences Inc.Inertsil HILIC，(或其他类似色谱柱)；色谱柱温：20-60℃；流动相A：1-5mM甲酸铵的水溶液；流动相B：100％ACN溶液；洗液：R0(50％甲醇溶液)和R3(乙腈/甲醇(1:1,v:v))；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.2-0.6mL/min，进样量为10uL，分析时间4-10min；

②质谱测定，条件为：离子源为电喷雾离子源，接口温度：300℃，脱溶剂管温度：250℃，加热气流量：10L/min，加热块温度：400℃，干燥器流量：10L/min；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z330.05→m/z136.10(环磷酸腺苷)；和m/z335.05→m/z136.05(环磷酸腺苷-d5)；

在一优选实施例中，所述液相色谱测定中梯度洗脱的参数为：梯度洗脱：0min，水相与乙腈的体积比为5∶95；5.0min，水相与乙腈的体积比为10∶90；5.1min水相与乙腈的体积比为50∶50；9.3min水相与乙腈的体积比为50∶30，9.31min水相与乙腈的体积比为5∶95柱温为20-60℃。

本发明的本发明方法与现有技术相比，具有如下优势：

1、本发明方法快速、准确、灵敏度高，样品预处理方法采用相对复杂的固相萃取法，但其他内源性干扰小，方法的选择性好，灵敏度高；

2、专属性强，采用特殊的GL Sciences Inc.Inertsil HILIC,3.0*100mm色谱柱，水相2mM甲酸铵的水溶液和有机相100％乙腈溶液作为流动相，梯度洗脱。环磷酸腺苷保留时间5min左右，出峰位置无其他干扰峰，无明显基质效应；

3、灵敏度高，环磷酸腺最低定量限均为5.00ng/mL。

附图说明

图1为标准曲线定量下限(5.00ng/mL)色谱图；

图2为标准曲线定量上限(500ng/mL)色谱图；

图3为食蟹猴血浆样品色谱图；

图4为标准曲线(5.00-500ng/mL)。

图5为蛋白沉淀法处理血浆样本定定量下限色谱图。

图6为固相萃取法处理血浆样本定量下限色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

环磷酸腺苷标准品购自SIGMA，环磷酸腺苷-d5标准品购自TRC。乙腈、甲醇、甲酸铵等均为HPLC级别，来自美国Fisher公司，其他化学试剂均为分析纯。

CMS-8060质谱联用仪(日本岛津公司)，Lab Solutions 6.84SP1数据采集软件(日本岛津公司)，梅特勒XS 105DU电子天平(瑞士梅特勒公司)；Eppendorf Centrifuge 5424R高速低温离心机(德国Eppendorf公司)。

实施例1.储备液及工作液的配制

称量适量环磷酸腺苷及其氘代内标，加入一定量的DMSO配制浓度均为1.00mg/mL的储备液。在室温条件下用50％甲醇溶液分别序列稀释单独的储备液来配制标准曲线样品的工作溶液。所有工作溶液都配制在透明聚丙烯管中并储存于-20℃冷冻冰箱。

内标工作液浓度：

环磷酸腺苷-d5：100ng/mL；

表1.标准曲线工作液浓度(ng/mL)：

实施例2样品预处理：

食蟹猴血浆以EDTA-K2与IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)为抗凝剂与稳定剂，以待测物的氘代化合物为内标，取50uL的血浆与尿液样品，加入50uL的氘代内标混合溶液，混合后再加入到

实施例3液相色谱-质谱联用检测：

①液相色谱测定，条件为：色谱柱：GL Sciences Inc.Inertsil HILIC,3.0*100mm；色谱柱温：20-60℃；流动相A：1-5mM甲酸铵的水溶液；流动相B：100％ACN溶液；洗液：R0(50％甲醇溶液)和R3(乙腈/甲醇(1:1,v:v))；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.6mL/min，进样量为10uL，分析时间10min；

②质谱测定，条件为：离子源为电喷雾离子源，接口温度：300℃，脱溶剂管温度：250℃，加热气流量：10L/min，加热块温度：400℃，干燥器流量：10L/min；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m m/z330.05→m/z136.10(环磷酸腺苷)；和m/z335.05→m/z136.05(环磷酸腺苷-d5)；

实施例4、标准曲线制备：

用以5％的牛血清蛋白溶液将工作液稀释20倍，取50uL的牛血清蛋白溶液样品，再加入50.0uL的的氘代内标混合溶液，混合后再加入到

实施例5、血浆与尿液中环磷酸腺苷浓度的测定：

将待测血浆与尿液按步骤(1)样品制备的方法制备，取待测样品按步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录环磷酸腺苷对应的峰面积，将环磷酸腺苷和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到所述待测血浆与尿液中环磷酸腺苷的浓度。

实施例6、对照例

方法的精密度与准确度：

质控工作液浓度(ng/mL)：

食蟹猴血浆以EDTA-K2与IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)为抗凝剂与稳定剂，以待测物的氘代化合物为内标，取50uL的血浆与尿液样品，加入50uL的氘代内标混合溶液，混合后再加入到

由上述表中的数据可知：

该方法的实验结果RE％均在15％的可接受范围内，RSD％均在15％的可接受范围内。由此可知，该方法的重复性良好，精密度与准确度较高，灵敏度高，且检测限较低。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。