佛司可林在T细胞培养中的应用

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及佛司可林在T细胞培养中的应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫领域飞速发展，正在革命性的改变肿瘤诊疗现状

根据分化程度的不同，可以将T细胞粗略的分为三个亚群：初始T细胞(naive Tcells，Tn)、效应性T细胞(Effector T cells，TE)和记忆性T细胞(Memory T cells，TM)。不同亚群细胞在抗肿瘤免疫中发挥的作用不尽相同，其中记忆性T细胞拥有较长的存活时间，在机体再次遇到初次致敏的抗原时，会产生二次增强性免疫应答，该亚群细胞的数量及比例在很大程度上决定了T细胞免疫的持久性

目前的对提高记忆性T细胞比例的研究主要通过改良体外培养条件进行。临床实践中最常用的提高细胞产品中记忆性T细胞含量的方法，主要是基于IL-7、IL-15、IL-21等细胞因子在记忆性T细胞形成及维持中发挥的关键作用，通过直接向培养系统中添加上述细胞因子或利用转基因的方式在T细胞中过表达上述细胞因子或(和)受体实现的

中国专利201811257117.2提供了一种CD4

中国专利201910376238.7提供了一种外周血记忆T细胞培养方法，所述方法包括：a)将由外周血分离得到的PBMC进行磁珠分选得到CD8

尽管这些方法能够在一定程度上提升细胞产品中记忆性T细胞的比例进而优化治疗效果，但同时存在较多的问题：大规模细胞培养所需细胞因子的量极大，会额外提高细胞产品制备成本；细胞因子的稳定性问题也会影响细胞产品质量的一致性。因此，上述几种细胞因子不能完全满足临床实践对提高T细胞产品中记忆性T细胞含量的要求，亟需筛选更多性质稳定、价格低廉，且能够显著提高记忆性T细胞比例的(小分子)化合物，以达到优化T细胞产品的生物学特性的目的。

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发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种T细胞的培养方法，通过向培养基中添加佛司可林进行T细胞的培养，提高了培养物中记忆性T细胞的比例。

本发明中佛司可林英文为Forskolin，英文简写为FSK。

现有文献表明佛司可林对T细胞增殖有一定的抑制作用(宋兵，曾耀英，黄秀艳，等。Forskolin对小鼠体外T淋巴细胞活化、增殖和周期的影响[J]。中药材，2008(07):1008-1012。)，但本申请发现佛司可林对不同T细胞亚群的增殖抑制具有显著的差异性，其对非记忆性T细胞的抑制远强于对记忆性T细胞的抑制。本发明的关键在于利用佛司可林对不同T细胞亚群具有差异化的增殖抑制这一特性。在添加佛司可林培养过程中，记忆性T细胞比例会逐步升高而非记忆细胞比例逐步下降，最终的结果是T细胞产品中记忆性T细胞的提高。

一方面，本发明提供了佛司可林在T细胞培养中的应用。

所述的佛司可林添加在T细胞培养基中。

所述佛司可林添加终浓度为0-40μM，优选为20μM。

在一些实施例中，所述的佛司可林与细胞因子共同作用。

优选地，所述的细胞因子包括但不限于白细胞介素、干扰素、趋化因子、生长因子。

进一步优选地，所述的细胞因子为白细胞介素，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21。

在一些实施例中，所述的白细胞介素为IL-2，所述的IL-2的添加量为1000U/mL。

所述的T细胞培养基包括但不限于DMEM培养基，XVIVO培养基。

另一方面，本发明提供了一种T细胞的培养方法。

所述的培养方法中包括向培养基中添加终浓度为0-40μM的佛司可林。

优选地，所述的培养基中佛司可林的添加终浓度为20μM。

优选地，所述的培养基中还包括细胞因子，所述的细胞因子包括但不限于白细胞介素、干扰素、趋化因子、生长因子。

进一步优选地，所述的细胞因子为白细胞介素，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21。

在一些实施例中，所述的白细胞介素为IL-2，所述的IL-2的添加量为1000U/mL。

在一些实施例中，所述的培养方法包括以下步骤：

(1)包被细胞培养板；

(2)单个核细胞分离；

(3)用含有佛司可林的培养基重悬细胞后种入培养板进行培养；

(4)转入培养瓶培养。

在一些实施例中，所述的步骤中还包括：

(5)对培养瓶中的培养物进行半量换液。

优选地，所述的培养方法的培养天数为12天。

再一方面，本发明提供了一种T细胞培养基。

所述的T细胞培养基中添加终浓度为0-40μM的佛司可林。

优选地，所述的T细胞培养基中添加终浓度为20μM的佛司可林。

优选地，所述的T细胞培养基中还包括细胞因子，所述的细胞因子包括但不限于白细胞介素、干扰素、趋化因子、生长因子。

进一步优选地，所述的细胞因子为白细胞介素。

在一些实施例中，所述的白细胞介素为IL-2，所述的IL-2的添加量为1000U/mL。

所述的T细胞培养基的基础培养基包括但不限于DMEM培养基，XVIVO培养基。

又一方面，本发明提供了一种T细胞培养物。

所述T细胞培养物通过前述的培养方法制备。

又一方面，本发明提供了一种记忆性T细胞。

所述的记忆性T细胞通过前述的培养方法制备。

又一方面，本发明提供了前述的培养方法和/或T细胞培养物和/或记忆性T细胞在制备肿瘤相关药物中的应用。

所述的药物中包括前述的T细胞培养物和/或记忆性T细胞。

所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体。

又一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物。

所述的药物中包括前述的T细胞培养物和/或记忆性T细胞。

所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体。

本发明的有益效果：

1、与未添加佛司可林的培养系统相比，添加佛司可林的培养系统获得的人T细胞产品中记忆性T细胞(CD62L

2、与未添加佛司可林的培养系统相比，添加佛司可林的培养系统获得的人T细胞体内、外存活时间延长。

附图说明

图1为T细胞培养终产品中记忆性CD8阳性T淋巴细胞比例检测的流式细胞仪分析结果(图中Q1为CD3

图2为T细胞培养终产品中记忆性CD4阳性T淋巴细胞比例检测的流式细胞仪分析结果(图中Q1为CD3

图3为T细胞培养终产品中记忆性T淋巴细胞(CD45RA

图4为对照组和佛司可林组细胞培养一段时间后不再添加佛司可林(撤掉佛司可林)进行培养，绘制体外扩增曲线。其中A为0-21天的局部放大图，B为0-28天整体扩增曲线。

图5为对照组和佛司可林组细胞在免疫缺陷小鼠体内存活情况。其中A为小鼠活体成像图片；B为根据DIO标记细胞荧光强度绘制的曲线。

图6为CD19

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1添加佛司可林对制备T细胞终产品的影响

本实施例的实验材料来源为健康志愿者的外周血。

实验试剂包括：血浆(志愿者自体血浆)、人淋巴细胞分离液(中国美德太平洋公司)、抗人CD3单克隆抗体(日本Takara公司)、重组人纤维连接蛋白(日本Takara公司)、XVIVO无血清培养液(美国Lonza公司)、IL-2(山东泉港药业有限公司)、佛司可林(中国MCE公司)、DMSO(美国Sigma公司)。

实验设备包括：FACSCanto II流式细胞仪(美国BD公司)。

细胞培养方法参考步骤如下：

(1)提前包被6孔板，每孔用1.0mL生理盐水添加抗人CD3单克隆抗体(终浓度1.5μg/mL)和重组人纤维连接蛋白(终浓度6μg/mL)，充分混匀后在37℃，5％的CO

(2)抽取健康志愿者20mL外周血，用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞(PBMC)；此步骤亦可使用Ficoll密度梯度离心法获得PBMC。

(3)将步骤(2)分离得到的细胞计数后，分别用不含和含有佛司可林(终浓度为20μM)的XVIVO无血清培养液(添加1000U/mL的IL-2和2.5％自体血浆)按1×10

(4)培养4天后，分别将细胞转移入新的细胞培养瓶，并分别补加10倍体积新鲜的不含、含有佛司可林(终浓度为20μM)的XVIVO无血清培养液(添加1000U/mL的IL-2和2.5％自体血浆)，继续放置于37℃，5％的CO

(5)之后隔天对步骤(4)中的细胞进行半量换液，即分别用一半体积的不含、含有佛司可林(终浓度为20μM)的新鲜无血清培养液(添加1000U/mL的IL-2和2.5％自体血浆)替换6孔板中的培养液。

(6)培养12天即可得到T细胞终产品，将利用不含、含有佛司可林的培养液得到的细胞分别命名为对照组和佛司可林组。分别取2×10

(7)取步骤(6)得到的T细胞终产品，细胞密度为1×10

(8)分别取1×10

实施例2添加佛司可林对制备T细胞终产品的影响

本实施例的实验方法参照实施例1，区别在于培养基中的佛司可林的添加终浓度为40μM。

结果表明，本实施例得到的T细胞终产品在CD8阳性和CD4阳性T细胞亚群中，佛司可林组的记忆性T细胞比例均高于对照组。同时，统计结果显示佛司可林可以显著提升T细胞终产品中记忆性T细胞比例，且有统计学上的差异。

与IL-2共同作用时，佛司可林组细胞体外扩增较对照组更为持久，其中不添加IL-2组在7-14天保持增殖优势，而添加IL-2组在7-32天保持增殖优势。

体外存活实验结果显示佛司可林组细胞体内扩增较对照组更为持久。

实施例3添加佛司可林对制备CAR-T细胞终产品的影响

实验材料：健康志愿者外周血。

实验试剂：

血浆(志愿者自体血浆)、人淋巴细胞分离液(中国美德太平洋公司)、CD3

实验设备：

FACSCanto II流式细胞仪(美国BD公司)。

细胞培养步骤：

(一)纯化获得CD3

(1)提前包被6孔板，每孔用1.0mL生理盐水添加抗人CD3单克隆抗体(终浓度1.5μg/mL)和RetroNectin(终浓度6μg/mL)，充分混匀后在37℃，5％的CO

(2)抽取健康志愿者20mL外周血，用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞(PBMC)；

(3)细胞计数后，每1×10

(4)用磁珠分离液轻轻混匀后，600g离心10分钟后，弃上清，再次用磁珠分离液重悬后过分离柱，并用磁珠分离液冲洗一次；

(5)取下分离柱，用助推柄将包含CD3

(6)将分离得到的CD3

(二)T细胞慢病毒侵染(计为d1天)

向由步骤(一)得到的CD3

(三)去除病毒液(计为d2天)

小心的将步骤(二)处理的细胞培养液吸去，按每孔5mL分别加入新鲜的不含、含有佛司可林(终浓度为20μM)的无血清培养液(添加1000U/mL的IL-2和2.5％自体血浆)，继续培养。

(四)扩增培养(计为d4天)

将步骤(三)中的细胞转移至新的175cm

(五)CAR-T终产品检测(计为d8天)

培养8天即可得到CAR-T细胞终产品，将利用不含、含有佛司可林的培养液得到的细胞分别命名为对照组和佛司可林组。分别取2×10