一种制备高纯度乳铁蛋白的方法

技术领域

本发明属于乳制品加工技术领域，其涉及一种高纯度乳铁蛋白的规模化生产技术，特别是以牛/羊乳、初乳或乳清为原材料，每批次制备公斤级以上符合国家标准GB1903.17-2016质量要求的高纯度乳铁蛋白产品的方法。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin)是动物乳中的天然蛋白质，具有广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁的平衡、调节机体免疫功能、抑制人体肿瘤细胞生长的作用。婴幼儿配方奶粉主要采用牛乳作为配方的基础，但人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0～3.0mg/mL，是牛乳中的10倍(牛乳中含量为0.02～0.35mg/mL)，因此婴幼儿配方奶粉中需要额外添加乳铁蛋白，以使配方组成和功能更接近于人乳。因此，奶粉行业存在规模化使用乳铁蛋白的实际需求。

2016年12月，我国卫计委和食药监总局联合发布了关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016，其中对食品营养强化剂乳铁蛋白的理化指标以及检测方法提出明确的要求：乳铁蛋白占总蛋白质量百分比(w/％)≥95％，纯度检测方法为使用C4反相分析柱在高效液相色谱仪上进行分析。由此可见，出于对食品安全和产品质量的高标准要求，需要开发规模化制备高纯度乳铁蛋白的方法。

目前已经能够使用阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析、电分离、交叉流过滤等技术互相配合，从乳、初乳或乳清中制备得到乳铁蛋白。由于乳铁蛋白和乳过氧化物酶是乳中少数带有正电荷的蛋白质分子，乳中其它蛋白和小分子物质主要带负电荷或电中性。因此，乳、初乳或乳清经过阳离子交换层析柱时，乳铁蛋白或乳过氧化物酶依靠和层析介质之间异性电荷相互吸引结合到层析介质上。由于这两种蛋白所带电荷量不同，乳过氧化物酶在阳离子交换层析介质上的结合比乳铁蛋白弱。通过低浓度的NaCl或KCl溶液，可先将乳过氧化物酶洗脱下来，进一步提高NaCl或KCl溶液的浓度，可洗脱得到纯化的乳铁蛋白溶液。由于阳离子交换层析具有分辨率高、结合载量大、成本低、易于放大等优势，成为工业化生产乳铁蛋白的主流技术。

中国专利CN104926936A公布了一种使用阳离子交换树脂纯化乳铁蛋白的方法，液体乳平均粒径D90为1微米以下，所述液体乳在离子交换柱中保留时间为6～8分钟，第一洗脱液为25～35质量％的NaCl溶液，第二洗脱液为75～100质量％的NaCl溶液。第二洗脱液经过膜浓缩和脱盐，得到乳铁蛋白。在实际规模化生产中，液体乳在层析柱中的保留时间(对应于本发明的第一步阳离子交换层析的保留时间)超过4分钟，并不能明显提高树脂对蛋白的吸附能力，反而大幅降低了层析步骤的生产效率，增加了未进行巴氏杀菌的液体乳中微生物大量滋长的风险。并且此文献披露的第一步洗脱液25质量％浓度对应的NaCl摩尔浓度为4.2mol/L，此浓度明显过高，将会把所有结合在树脂上的蛋白一起洗脱下来，无法实现蛋白分级纯化的目的。此文献所述方法制备的乳铁蛋白纯度为90～95％(根据食品安全国家标准GB1903.17-2016检测纯度约为84～89％之间)，未达到GB1903.17-2016乳铁蛋白占总蛋白质量百分比(w/％)≥95％的要求。

中国专利CN106008704A公布了另一种使用阳离子交换层析制备乳铁蛋白的工艺参数组合。乳液温度≤55℃，在树脂柱上的保留时间为1～6分钟，第一洗脱液为浓度1％～2.5％的NaCl或KCl水溶液，第二洗脱液为浓度4.5％～12％的NaCl或KCl水溶液。第二洗脱液经过膜浓缩和脱盐后，得到乳铁蛋白原液。此工艺参数组合中液体乳在树脂柱中的保留时间优选1～2分钟，虽然较短的保留时间增加了层析步骤的处理速度，但是由于目标蛋白分子在层析填料上扩散和吸附需要适当时间，1～2分钟的保留时间不足以充分利用层析填料的吸附能力，尤其是大规模生产时，乳铁蛋白容易流穿出层析柱，造成回收率的下降。其制备出来的样品使用离子交换层析(非国标方法，分辨率低)作为分析手段，得到的乳铁蛋白纯度为93.2％～95.7％(根据食品安全国家标准GB1903.17-2016检测纯度约为85～91％之间)。同样也无法达到GB1903.17-2016乳铁蛋白占总蛋白质量百分比(w/％)≥95％的要求。

中国专利CN103709246A公布了一种从转基因牛乳中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法。将预处理得到的脱脂乳首先进行阳离子交换层析分离，分别在不同盐浓度条件下将乳铁蛋白与乳过氧化物酶分离，进一步通过疏水层析将乳铁蛋白中少量残留的杂质去除，最后对纯化的蛋白样品进行浓缩脱盐。使用凝胶过滤色谱进行纯度分析(分辨率比食品安全国家标准GB1903.17-2016规定的分辨率低)，得到纯度99％以上的乳铁蛋白。此方法通过两步层析步骤的串联组合，实现了高纯度乳铁蛋白的制备。但由于疏水层析需要向样品和缓冲液中大量加入硫酸铵，纯化成本高，环保压力大，因此在食品领域并不适用。

目前报道的乳铁蛋白纯化方案存在如下问题：1、蛋白纯度不能满足关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016的质量要求；2、生产速度过慢，不适合规模化生产；3、疏水层析成本高、环保压力大。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于从液体乳中规模化、低成本制备符合关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016质量要求的高纯度乳铁蛋白同时乳铁蛋白回收率较高的乳铁蛋白的方法。

本发明涉及一种制备高纯度乳铁蛋白的方法，其包括以下步骤：

(1)将脱脂液体乳进行预处理；

(2)将经过预处理的脱脂液体乳进行第一阳离子交换层析，第一阳离子交换层析中，上样流速为500～1000cm/h，洗杂盐溶液为浓度0.3～0.45M的金属卤化物水溶液，得到乳铁蛋白溶液；

(3)将乳铁蛋白溶液进行超滤脱盐或稀释；

(4)然后将经过超滤脱盐或稀释的乳铁蛋白溶液进行第二阳离子交换层析，第二阳离子交换层析中，上样流速为50～400cm/h，洗杂盐溶液为浓度0.35～0.55M的金属卤化物水溶液，得到乳铁蛋白纯度不低于95％的乳铁蛋白溶液；

(5)将乳铁蛋白纯度不低于95％的乳铁蛋白溶液进行超滤浓缩和脱盐，得到乳铁蛋白原液。

根据本发明的一个实施方案，其中第一阳离子交换层析中的上样流速为500～1000cm/h、优选600～950cm/h、更优选700～900cm/h。

根据本发明的一个实施方案，其中第一阳离子交换层析中的洗杂盐溶液为浓度0.35～0.40M的金属卤化物水溶液。

根据本发明的一个实施方案，其中第一阳离子交换层析采用平均粒径在100～300微米、优选150～275微米、更优选200～250微米的层析介质。

根据本发明的一个实施方案，其中第二阳离子交换层析中的上样流速为75～380cm/h、优选100～350cm/h、更优选150～300cm/h。

根据本发明的一个实施方案，其中第二阳离子交换层析中的洗杂盐溶液为浓度0.40～0.50M的金属卤化物水溶液。

根据本发明的一个实施方案，其中第二阳离子交换层析采用平均粒径在60～200微米、优选75～175微米、更优选90～150微米的层析介质。

根据本发明的一个实施方案，其中经过预处理的脱脂液体乳在第一阳离子交换层析柱上的保留时间为1.5～3.6分钟、优选2.0～3.0分钟。

根据本发明的一个实施方案，其中经过超滤浓缩和脱盐的乳铁蛋白溶液在第二阳离子交换层析柱上的保留时间为3.6～30分钟、优选4.8～24分钟、更优选6.0～18分钟。

根据本发明的一个实施方案，其中金属卤化物中的金属为碱金属或碱土金属，卤化物中的卤素为F、Cl、Br或I。

根据本发明，实现了规模化、低成本制备符合关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016质量要求的乳铁蛋白纯度不低于95％同时乳铁蛋白回收率不低于62.5％的乳铁蛋白的方法。

附图说明

下面结合附图描述本发明，但是本发明并不限于此。附图中：

图1是本发明的制备高纯度乳铁蛋白的工艺流程图；

图2是显示本发明实施例1制备的乳铁蛋白的纯度示意图。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，下面通过具体实施方案并且结合附图来详细描述本发明，但是本发明并不因此而受任何限制。

需要说明的是，本发明的术语“第一”和“第二”仅用于描述的目的，而不能理解为表明相对重要性。除非另外说明，否则本发明中的％均基于质量。

另外，需要说明的是，本发明中的数值范围均包括端值以及端值之间的任何点值。例如，数值范围1～10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；数值范围0.1～0.9包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9；数值范围0.01～0.09包括0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；数值范围0.08～0.21包括0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21。另外，本发明中的“以上”、“以下”和“以内”均包括本数。

另外，需要说明的是，本发明中使用的术语“液体乳”应作广义理解，其是指以液体形式存在的能够提供任何乳成分的物质，也可以是通过将“乳粉”和“水”两个组分混合配制获得的液体奶，只要最终组成不变即可。

本发明提出一种制备高纯度乳铁蛋白的方法，其中以含有乳铁蛋白的脱脂液体乳为原料，首先进行第一次阳离子交换层析，使用低离子强度的盐溶液洗脱去除大部分乳过氧化物酶杂质，然后高盐洗脱得到乳铁蛋白粗提物。此粗提物经浓缩脱盐后再进行第二次阳离子交换层析作为精细纯化步骤，最后对纯化的乳铁蛋白进行浓缩脱盐，得到符合关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016的乳铁蛋白原液。

本发明的构思是通过一种两步阳离子交换层析工艺组合使用的方式，在保证产物纯度的同时，能够快速、高回收率地制备乳铁蛋白产品。每一步阳离子交换层析主要涉及三种工艺参数的组合：层析介质粒径、上样流速(或保留时间)和洗杂盐浓度。

具体而言，第一步阳离子交换层析采用平均粒径在100～300微米的层析介质，上样的线性流速为500～1000cm/h(对应样品在层析柱上的保留时间为1.5～3.6分钟)，洗杂盐浓度为0.3～0.45M的金属卤化物水溶液。金属卤化物中，金属为碱金属如Li、Na、K、Rb、Cs或碱土金属如Be、Mg、Ca、Sr、Ba，卤化物中的卤素为F、Cl、Br、I。

第一步层析的目的是快速捕获目标物质，保证回收率。由于液体乳中含有大量蛋白质和糖类物质，自身粘度比较大，大粒径介质保证层析上样时反压较低，是高流速工艺的物质基础。介质粒径过小，高粘度样品上样时反压过大，只能降低工作流速上样，使得延长工艺时间，而工艺时间过长会导致样品酸化变质；相比之下，较高上样流速可以在层析介质能够充分捕获乳铁蛋白的基础上，缩短工艺时间。另外，较低洗杂盐浓度保证乳铁蛋白不会在洗杂步骤中产生损失。

第二步阳离子交换层析采用平均粒径在60～200微米的层析介质，上样的线性流速为50～400cm/h(对应样品在层析柱上的保留时间为3.6～30分钟)，洗杂盐浓度为0.35～0.55M的NaCl或KCl水溶液。

第二步层析的目的是提高纯度，保证回收率。经过粗提取后，样品杂质大大减少，粘度相应降低，样品体积大大减少。这一步骤采用较小粒径的介质可以得到更高的载量和分辨率。较低的上样流速也保证了乳铁蛋白在层析介质上的高载量。洗杂盐浓度相比第一步层析更高，保证充分去除乳过氧化物酶杂质，确保乳铁蛋白纯度达到食品安全国家标准GB1903.17-2016。

本发明通过两步阳离子层析交换并且每一步均采用合理的参数组合，解决了目前现有技术工艺中存在的缺陷。

下面结合图1详细描述本发明制备高纯度乳铁蛋白的方法。图1中，脱脂液体乳在层析之前需要使用10～50微米孔径的滤芯或滤袋过滤，去除可能堵塞层析柱的蛋白或脂肪颗粒。脱脂液体乳包括含有乳铁蛋白和乳过氧化酶的人乳、牛乳、羊乳、马乳、驼乳中的一种或多种。采用10微米以下孔径的滤器进行过滤，部分脱脂液体乳中的蛋白质会被截留在滤器上，从而造成蛋白质回收率的降低。使用超过50微米孔径的滤器过滤，无法有效截留脱脂液体乳中的颗粒物，在规模化生产中，长时间层析上样会造成层析柱超压，从而破坏制备工艺的连续性。

然后，进行第一步阳离子交换层析，以快速、高回收率地捕获脱脂液体乳中的乳铁蛋白分子。为了达到这一目的，第一步阳离子交换层析采用平均粒径在100～300微米的层析介质，层析上样的线性流速为500～1000cm/h(对应样品在层析柱上的保留时间为1.5～3.6分钟)。在上述平均粒径范围内，层析介质粒径越大越有利于快速处理，缩短工艺时间。在本发明的第一步阳离子交换层析中，由于采用了大粒径如平均粒径在100～300微米的层析介质，脱脂液体乳流经层析柱时反压降低，不容易堵塞。另外，乳铁蛋白规模化生产中，每天往往需要处理200吨以上的脱脂液体乳，低于500cm/h的线性流速难以在10小时以内完成第一步层析的上样步骤；然而，上样流速高于1000cm/h，样品在层析柱上的保留时间过短，乳铁蛋白不能有效结合在层析柱上，造成工艺回收率降低。

完成第一步阳离子交换层析上样后，进行超滤脱盐或稀释。具体而言，使用0.3～0.45M NaCl或KCl水溶液以250～500cm/h线性流速洗脱乳过氧化物酶杂质。使用洗脱盐浓度越高，线性流速越大，乳过氧化物酶去除率也越高，但也会带来少量乳铁蛋白的损失。为了提高整体工艺的回收率，这一层析步骤需使用较低浓度的NaCl或KCl水溶液以及较低的洗脱速度作为工艺参数组合。经过这一步骤层析，乳铁蛋白纯度提高到80～90％(根据食品安全国家标准GB1903.17-2016的方法检测)。

将上述步骤得到的乳铁蛋白溶液使用10～50K的超滤膜进行脱盐或者直接稀释降低盐浓度。

然后，进行第二步阳离子交换层析。其目的在于，在保证高回收率的情况下，去除少量残留的乳过氧化物酶杂质，得到纯度95％以上的乳铁蛋白，以符合关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016的质量要求。为了达到这一目的，第二步阳离子交换层析采用平均粒径在60～200微米的层析介质，层析上样的线性流速为50～400cm/h(对应样品在层析柱上的保留时间为3.6～30分钟)。

完成第二步阳离子交换层析上样后，进行超滤浓缩和脱盐。具体而言，使用0.35～0.55M NaCl或KCl水溶液以50～400cm/h线性流速洗脱乳过氧化物酶杂质。为了获得足够纯度的乳铁蛋白，这一层析步骤需要使用较高浓度的NaCl或KCl水溶液作为洗杂盐溶液。第二步洗脱使用0.8～1M NaCl或KCl水溶液洗脱层析柱上所有结合的乳铁蛋白。经过这一步骤层析，乳铁蛋白纯度提高到95％以上(根据食品安全国家标准GB1903.17-2016的方法检测)。将第二步阳离子交换层析得到的乳铁蛋白溶液使用10～50K的超滤膜进行8～15倍浓缩和脱盐，得到乳铁蛋白原液。之后，可以将其制粉或以液体的形式用于下游的食品加工工艺。

乳铁蛋白的含量及纯度检测方法参见关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016。

通过本发明的两步阳离子交换层析的工艺组合并且适当组合每一步阳离子交换层析的工艺参数如层析介质粒径、上样流速(或保留时间)和洗杂盐浓度，实现了乳铁蛋白产品中的乳铁蛋白纯度大于95％，同时乳铁蛋白回收率为62.5％以上。

其中，第一步阳离子交换层析的特征、工艺参数和优势如下表1所示：

表1.第一步阳离子交换层析的特征、工艺参数和优势

第二步阳离子交换层析的特征、工艺参数和优势如下表2所示：

表2.第二步阳离子交换层析的特征、工艺参数和优势

实施例

下面将结合实施例来描述本发明。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为限制本发明。

实施例1.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

收集脂肪含量小于0.1％、含乳铁蛋白(乳铁蛋白含量为0.1g/L)的脱脂液体乳1000L，使用阿法拉伐离心泵作为液体乳输送的动力，使液体乳通过孔径为10～50微米的高通量滤芯，所述高通量滤芯购自杭州科百特公司。过滤工作流速为200L/h，控制滤器前的压力不超过0.2MPa。过滤后的液体乳样品收集到储罐中，作为层析样品待用。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Big Beads(平均粒径200微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为550cm/h。平衡结束后，将如上制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为550cm/h(样品柱上保留时间2.7分钟，其中保留时间＝(柱床高度/上样流速)×60；该保留时间与上样流速的换算关系均适用于本文中)，1000L样品总上样时间12h。上样结束后，使用浓度为0.35M NaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜对层析样品进行10～20倍浓缩并脱盐至样品电导率小于30ms/cm。此时得到乳铁蛋白粗提液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为100cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为100cm/h(样品柱上保留时间15分钟)。上样结束后，使用浓度为0.4M NaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度(浓度按10克/100毫升计，适用于下文)，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为97.1％(如图2所示)，超过国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；乳铁蛋白回收率为73.1％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

实施例2.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Big Beads(平均粒径200微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为1000cm/h。平衡结束后，将如上制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为1000cm/h(样品柱上保留时间1.5分钟)，1000L样品总上样时间6.5h。上样结束后，使用浓度为0.35MNaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜对层析样品进行10～20倍浓缩并脱盐至样品电导率小于30ms/cm。此时得到乳铁蛋白粗提液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为100cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为100cm/h(样品柱上保留时间15分钟)。上样结束后，使用浓度为0.4M NaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl或者KCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为95.3％，超过国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；乳铁蛋白回收率为64.9％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

实施例3.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose extro Beads(平均粒径300微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为550cm/h。平衡结束后，将如上制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为550cm/h(样品柱上保留时间2.7分钟)，1000L样品总上样时间12h。上样结束后，使用浓度为0.35MNaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜对层析样品进行10～20倍浓缩并脱盐至样品电导率小于30ms/cm。此时得到乳铁蛋白粗提液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为100cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为100cm/h(样品柱上保留时间15分钟)。上样结束后，使用浓度为0.4M NaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为96.7％，超过国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；乳铁蛋白回收率为71.5％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

实施例4.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose extro Beads(平均粒径300微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为1000cm/h。平衡结束后，将如上制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为1000cm/h(样品柱上保留时间1.5分钟)，1000L样品总上样时间6.5h。上样结束后，使用浓度为0.35MNaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。将层析收集样品使用纯化水稀释2～5倍，至电导率小于30ms/cm。此时得到乳铁蛋白粗提液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为100cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为100cm/h(样品柱上保留时间15分钟)。上样结束后，使用浓度为0.4M NaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl或者KCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为95.1％，超过国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；乳铁蛋白回收率为62.8％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

实施例5.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Big Beads(平均粒径200微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为550cm/h。平衡结束后，将如上制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为550cm/h(样品柱上保留时间2.7分钟)，1000L样品总上样时间12h。上样结束后，使用浓度为0.35MNaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。将层析收集样品使用纯化水稀释2～5倍，至电导率小于30ms/cm。此时得到乳铁蛋白粗提液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为300cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为300cm/h(样品柱上保留时间5分钟)。上样结束后，使用浓度为0.4M NaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为97.4％，超过国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；乳铁蛋白回收率为68.6％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

实施例6.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Big Beads(平均粒径200微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为700cm/h。平衡结束后，将实施例1制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为700cm/h(样品柱上保留时间2分钟)，1000L样品总上样时间8.9h。上样结束后，使用浓度为0.35MKCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M KCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。将层析收集样品使用纯化水稀释2～5倍，至电导率小于30ms/cm。此时得到乳铁蛋白粗提液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为100cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为100cm/h(样品柱上保留时间15分钟)。上样结束后，使用浓度为0.4M KCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M KCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为97.5％，超过国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；乳铁蛋白回收率为74.4％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

实施例7.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Big Beads(平均粒径200微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为550cm/h。平衡结束后，将如上制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为550cm/h(样品柱上保留时间2.7分钟)，1000L样品总上样时间12h。上样结束后，使用浓度为0.35MKCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M KCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为150cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为150cm/h(样品柱上保留时间10分钟)。上样结束后，使用浓度为0.4M KCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M KCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为98.1％，超过国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；乳铁蛋白回收率为72.8％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

实施例8.高纯度乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备高纯度乳铁蛋白

第一步，粗提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Big Beads(平均粒径200微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为550cm/h。平衡结束后，将实施例1制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为550cm/h(样品柱上保留时间2.7分钟)，1000L样品总上样时间12h。上样结束后，使用浓度为0.35MNaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。将层析收集样品使用纯化水稀释2～5倍，至电导率小于30ms/cm。此时得到乳铁蛋白粗提液。

第二步，精细提取。使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Fast Flow(平均粒径90微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为75cm/h。平衡结束后，将上一步得到的乳铁蛋白粗提液上样到层析柱上，上样流速为75cm/h(样品柱上保留时间20分钟)，18.8L样品总上样时间1.7h。上样结束后，使用浓度为0.4M NaCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为100cm/h，去除少量残留的过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用国家标准GB1903.17-2016要求的高效液相色谱法配合反相C4分析柱，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为97.4％；由于第二步层析速度很慢，乳铁蛋白结合到柱的能力强，乳铁蛋白总回收率为74.5％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

其中，分别以与实施例1相同的方式测定实施例2-8中的乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)。

对比例1.乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备乳铁蛋白

除了第一步中的平衡流速为1500cm/h、上样流速为1500cm/h(样品柱上保留时间1分钟)和1000L样品总上样时间4.3h之外，对比例1的第一步(粗提取)和第二步(精细提取)与实施例1的相应第一步和第二步的操作相同。最终得到乳铁蛋白原液。

使用与实施例1相同的检测方法，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为94.2％，不能满足国家标准GB1903.17-2016中规定的95％的要求；由于第一步层析速度过快，乳铁蛋白不能有效结合到柱上，乳铁蛋白总回收率仅为52.3％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

对比例2.乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如对比例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备乳铁蛋白

除了第一步中的平衡流速为300cm/h、上样流速为300cm/h(样品柱上保留时间5分钟)和1000L样品总上样时间21.6h之外，对比例2的第一步(粗提取)和第二步(精细提取)与实施例1的相应第一步和第二步的操作相同。由于上样时间过长，样品在储罐中发生酸化变质。无法实现工业化生产。

对比例3.乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

两步阳离子交换层析制备乳铁蛋白

除了第二步中的平衡流速为500cm/h和上样流速为500cm/h(样品柱上保留时间3分钟)之外，对比例3的第一步(粗提取)和第二步(精细提取)与实施例1的相应第一步和第二步的操作相同。最终得到乳铁蛋白原液。

使用与实施例1相同的检测方法，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为96.8％；由于第二步层析速度过快，乳铁蛋白不能有效结合到柱上，乳铁蛋白总回收率仅为62.1％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

对比例4.乳铁蛋白的制备

脱脂液体乳的预处理

如实施例1所述进行脱脂液体乳的预处理。

一步阳离子交换层析制备乳铁蛋白

使用直径14cm的层析柱装填SP Sepharose Big Beads(平均粒径200微米)阳离子交换层析填料，装床高度25cm。使用反渗透水平衡层析柱，平衡流速为550cm/h。平衡结束后，将实施例1制备得到的层析样品上样到层析柱上，上样流速为550cm/h(样品柱上保留时间2.7分钟)，1000L样品总上样时间12h。上样结束后，使用浓度为0.35M NaCl或者KCl溶液进行层析柱洗杂，洗杂流速为250cm/h，去除大多数过氧化物酶。层析柱流出样品UV检测曲线回到基线后，使用1M NaCl或者KCl溶液从层析柱上洗脱乳铁蛋白，并收集至样品罐中。使用截留分子量30KD的超滤膜将层析样品浓缩至10％浓度，并进一步脱盐至样品电导率小于2ms/cm。此时得到乳铁蛋白原液。

使用与实施例1相同的检测方法，对乳铁蛋白原液质量进行检测，乳铁蛋白占总蛋白含量(纯度)为89.3％，乳铁蛋白总回收率为91％。

此乳铁蛋白原液可以通过冷冻干燥、低温喷雾干燥制备乳铁蛋白干粉或者以液体的形式直接应用于后续的产品开发之中。

上述实施例1-8和对比例1-4的层析参数和产物指标如下表3所示：

表3.实施例1-8和对比例1-4的层析参数和产物指标

由上表3可知，与实施例1相比，实施例6的第一步层析的上样流速由550cm/h提高至700cm/h，所得乳铁蛋白纯度由97.1％增至97.5％，乳铁蛋白回收率由73.1％增至74.4％；与实施例1相比，实施例2的第一步层析的上样流速由550cm/h提高至1000cm/h，所得乳铁蛋白纯度由97.1％降至95.3％，乳铁蛋白回收率由73.1％降至64.9％。另外，与实施例1相比，实施例3的第一步层析的填料粒径由200μm增至300μm，所得乳铁蛋白纯度由97.1％降至96.7％，乳铁蛋白回收率由73.1％降至71.5％，这说明随着填料粒径变大，乳铁蛋白与层析介质的结合能力变弱，但更有利于快速处理；同理，与实施例2相比，实施例4的第一步层析的填料粒径由200μm增至300μm，所得乳铁蛋白纯度由95.3％降至95.1％，乳铁蛋白回收率由64.9％降至62.8％，这同样说明随着填料粒径变大，乳铁蛋白与层析介质的结合能力变弱，但更有利于快速处理。另外，与实施例1相比，实施例7的第二步层析的上样流速由100cm/h提高至150cm/h，所得乳铁蛋白纯度由97.1％增至98.1％，乳铁蛋白回收率由73.1％降至72.8％；与实施例1相比，实施例5的第二步层析的上样流速由100cm/h提高至300cm/h，所得乳铁蛋白纯度由97.1％增至97.4％，乳铁蛋白回收率由73.1％降至68.6％；与实施例1相比，实施例8的第二步层析的上样流速由100cm/h降低至75cm/h，所得乳铁蛋白纯度由97.1％增至97.4％，乳铁蛋白回收率由73.1％增至74.5％。

然而，与实施例1相比，对比例1的第一步层析的上样流速由550cm/h提高至1500cm/h，所得乳铁蛋白纯度由97.1％降至94.2％(其不满足国家标准GB1903.17-2016规定的不低于95％)，乳铁蛋白回收率由73.1％降至52.3％(其低于本发明要求的不低于62.5％)。与实施例1相比，对比例2的第一步层析的上样流速由550cm/h降低至300cm/h，最终导致牛奶酸化，工艺失败。与实施例1相比，对比例3的第二步层析的上样流速由100cm/h提高至500cm/h，所得乳铁蛋白纯度由97.1％降至96.8％，而乳铁蛋白回收率由73.1％降至62.1％(与实施例1相比，乳铁蛋白回收率降低11％；这是因为第二步层析的上样流速过快，使得蛋白与层析介质的结合较差，导致回收率下降；对比例3的乳铁蛋白回收率低于本发明要求的不低于62.5％)。与实施例1相比，对比例4仅采用实施例1的第一步层析分离，不进行实施例1的第二步层析分离，所得乳铁蛋白纯度由97.1％降至89.3％(其不满足国家标准GB1903.17-2016规定的不低于95％)，乳铁蛋白回收率由73.1％增至91.0％。简言之，对比例1不满足食品安全国家标准GB1903.17-2016质量要求的乳铁蛋白纯度不低于95％和乳铁蛋白回收率不低于62.5％的要求；对比例2的分离工艺失败；对比例3和4不能同时满足食品安全国家标准GB1903.17-2016质量要求的乳铁蛋白纯度不低于95％和乳铁蛋白回收率不低于62.5％的要求。

上面通过具体实施例描述了本发明。然而，在不脱离本发明的宗旨和精神的前提下，可对本发明的实施例进行各种修改、修饰、变化和变型。并且，对本发明的实施方式的各种修改、修饰、变化和变型并不影响本发明权利要求的保护范围，相反均落入本发明权利要求的保护范围内。