一种检测苯氧乙酸类药物的试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品药品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种苯氧乙酸类药物的微孔侧流免疫层析试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

苯氧乙酸类药物主要有2,4-二氯苯氧乙酸和4-氯苯氧乙酸。主要作为高效、内吸、具高度选择性的除草剂和植物生长调节剂，被广泛用于禾科类作用的除草剂、生长调节剂和水果保鲜剂。

近期浙江、江苏等地监管部门在水果、豆芽中仍检测出超标的2,4-二氯苯氧乙酸。相关毒理实验研究表明，作为作物的除草剂和蔬果保鲜剂，其过高的残留会对人的神经系统、内分泌系统和免疫系统造成影响，具有潜在致癌性和致突变性。在国家标准GB 2763-2019《食品中农药残留最大限量》中规定谷物、蔬菜和水果中2,4-D的最高残留限量分别为2.0、0.5、1.0mg/kg。

苯氧乙酸类激素的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)、分子印迹传感器法、拉曼光谱检测法和免疫检测法。色谱类仪器检测方法准确率高、灵敏度好等优点，同时也存在设备昂贵、需专业人员、前处理要求高等不足。传感器和拉曼光谱分析方法研究层析居多，使用率低。而基于抗原抗体特异性识别为基础的免疫快速筛选方法，已经成为食品安全检测方法的主流检测方法，与仪器方法互补使用。微孔侧流免疫层析法(Micro well lateral flowimmune-chromatography,mwLFIA)是一种类似于胶体金层析卡，但又存在差别的检测方法。其主要原理是：将待测物与标记免疫金抗体在微孔中充分结合，通过层析作用，固相载体的包被抗原会捕获金标抗体而聚集显色，待测物越多，结合的抗体越多，固相载体上的包被抗原结合的少，显色不明显，表明阳性，反之则阴。微孔测流免疫层析法已经用于食品中抗生素类残留的检测，但检测苯氧乙酸类激素的mwLFIA还未见报道。可见此方法的建立对水果和蔬菜的安全检测具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测苯氧乙酸类药物的免疫检测方法检测对象少，灵敏度低，无法实现苯氧乙酸类药物的多残留免疫分析检测的缺陷和不足，提供一种苯氧乙酸类药物的微孔侧流免疫层析试纸条，能够快速的实现苯氧乙酸类药物的多残留免疫分析检测。

本发明的提供了一种2,4-二氯苯氧乙酸的完全抗原，和一种2,4-二氯苯氧乙酸的特异性抗体，以及一种2,4-二氯苯氧乙酸完全抗原和特异性抗体在检测苯氧乙酸类药物或制备苯氧乙酸类药物微孔侧流免疫层析试纸条的应用。

本发明的试剂盒包括微孔、试纸条、样品提取液和复溶液。所述的微孔为为聚苯乙烯(Polystyrene)材质的包被金标抗体的12孔或8孔的板条，所述试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中硝酸纤维素膜表面包被检测线和质控线，所述检测线上包被苯氧乙酸类药物包被原，所述质控线上包被IgG抗体。

所述的包被原为一种苯氧乙酸类药物的完全抗原，其特征在于，由2,4-二氯苯氧乙酸与载体蛋白偶联得到，其结构式如式(Ⅰ)所示：

其中Pretein表示牛血清白蛋白、卵清蛋白、乳铁蛋白、匙孔血蓝蛋白、伴刀豆球蛋白A、植物凝集素、人甲状腺球蛋白、牛甲状腺球蛋白或藻蓝素中的任意一种或几种。

优选地，本发明试剂盒所述包被抗原偶联的载体蛋白卵清蛋白(OVA)，其结构式如式II所示，所述的免疫原偶联的载体牛血清蛋白(BSA)，其结构式如式Ⅲ所示。

本发明所述的一种苯氧乙酸类特异性抗体，其特征在于，由上述的完全抗原免疫得到。优选地，所述特异性抗体为多克隆抗体、鼠单克隆抗体或基因工程抗体中的任意一种或几种。

本发明试剂盒的样品提取液为分析纯的乙腈溶液，复溶液为0.05mol/L pH7.3的PB溶液。其中试剂盒制备过程中使用纳米金标记溶液为pH 9.6，0.1mol/L碳酸盐缓冲液；封闭液为10％BSA溶液(10％BSA，0.01％叠氮钠)；PB溶液为0.1M pH 7.5PB缓冲液；PBS溶液为0.05mol/L pH 7.4；

优选地，苯氧乙酸类药物为2,4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、2,4,5-三氯苯氧乙酸中的一种或几种。所述的苯氧乙酸类药物的结构式如下：

本发明的检测原理：先将待测物与标记免疫金的抗体在微孔中充分结合，把试纸条放在微孔中，通过层析作用，固相载体的包被抗原会捕获金标抗体而聚集显色，待测物越多，结合的抗体越多，固相载体上的包被抗原结合的少，显色不明显，表明阳性，反之则阴。

本发明还提供了一种应用上述微孔侧流层析试剂盒检测苯氧乙酸类药物的方法，它包括步骤：(1)样品前处理；(2)用试剂盒进行检测；(3)分析检测结果。

本发明采用微孔侧流免疫层析技术实现对苯氧乙酸类药物的半定量检测。该试剂盒的准确率高、特异性强、广谱性好，检测方法前处理简单、快速灵敏，携带方便，且能够同时检测2,4-二氯苯氧乙酸，4-氯苯氧乙酸和2,4,5-三氯苯氧乙酸，适用于水果蔬菜中苯氧乙酸类药物残留的快速筛选。

为使本发明具体实施方式的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明的具体实施方式的实施实例，对本发明具体实施方式的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的具体实施方式是本发明的一部分具体实施方式，而不是全部的具体实施方式。基于所描述的本发明的具体实施方式，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所制备的所有其它具体实施方式，都属于本发明保护的范围。

附图说明

图1抗原的紫外鉴定扫描曲线

图2试剂盒实际样品检测结果

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1半抗原的制备

取2,4-二氯苯氧乙酸标准品220mg和160mg甘氨酸乙酯溶于20mL二氯甲烷中，再加入20mg 1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC：1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide)和20mg的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，在冰浴中混合均匀。室温下反应12h后，将混合物溶液用饱和柠檬酸水溶液洗涤三次，无水硫酸钠脱水后过滤，最后旋转蒸发二氯甲烷得到固体反应物。将得到的反应物用30mL的乙醇溶解，缓慢加入10％的NaOH溶液，加热回流，酯键水解，得到2,4-二氯苯氧乙酸的半抗原，用硅胶柱纯化后待用。

抗原制备

采用活泼酯法将2,4-二氯苯氧乙酸半抗原与载体蛋白BSA偶联作为免疫原，载体蛋白OVA偶联得到包被原。具体的，所示的半抗原与DMF、DCC和NHS混合得A液，将载体蛋白溶于PBS缓冲液中得D液，然后在低温磁力搅拌下，将C液逐滴加入D液，搅拌24h，用0.05mol/L的PBS透析2天，即可得到所述的包被原，采用紫外扫描法进行鉴定，分装-20℃冻存。

实施例2抗体制备

将上述步骤得到的免疫原注入到新西兰大白兔体内，免疫剂量为200μg/只，连续加强免疫4次，时间间隔为3周、2周、2周，使其产生抗血清。最后取血清，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，分装，-20℃保存。

实施例3金标抗体的制备

纳米金的制备

采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金。取99mL蒸馏水置于500mL烧瓶中，加入1mL 1％的氯金酸，加热至沸腾并持续1min后，迅速加入1.5mL1％柠檬酸三钠，观察溶液颜色，当溶液变为红色并逐步稳定后，再继续加热3min后冷却、备用。

抗体标记纳米金

在pH＝8.5的纳米金溶液中加入适量抗体(1.0mg/mL)，使终浓度为2.8.0μg/mL，振荡孵育10min后，加入1％BSA封闭10min，离心后弃上清液，PBS复溶。

实施例4检测线和质控线的制备

将羊抗兔IgG稀释浓度为0.5mg/mL，使用划膜机划膜于质控线(C线)，用胶体金免疫层析读数仪读数为1.0左右；同时将包被抗原稀释浓度为0.2mg/mL，划膜于T线上烘干。使读数T线与C线相当，制备T线和C线。

实施例5试剂盒的组装

试纸条由金标微孔、样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸和PVC底板四部分组成，NC膜上T线为包被原，C线为羊抗兔IgG抗体，将样品垫、NC膜和吸水纸依次衔接粘贴在PVC底板上，切成3.05mm宽试纸条，密封干燥保存。

金标微孔的制备：吸取制备的金标抗体10μL溶液置于96微孔板中，振荡均匀，37℃烘干过夜，密封干燥保存。

实施例6样品前处理

将待测的蔬菜瓜果样品切成碎片，置于打碎机中打碎，分析天平称取10g样品置于50mL离心管中,加入20mL的提取液(乙腈),漩涡震荡涡旋3-5min充分混合，涡旋仪将固液混合物充分混匀,室温10000r/min离心5min；取1mL上清液至10mL洁净干燥玻璃管中，水浴氮气流下吹干；加入1mL复溶工作液(0.05mol/L pH7.3的PB溶液)，涡旋振荡1min，待测。

实施例7试剂盒检测

吸取100μL处理好的样品提取液，加于金标微孔内，使用移液器反复吹打均匀后，室温孵育5min；然后将试纸条垂直插入微孔，反应6min后取出，观察试纸条颜色变化。裸眼观察判断：T线和C线显色相近或T线大于C线时时，结果均判定为阴性；T线不显色或颜色稍浅于C线时，结果判定阳性或弱阳性；C线无色,试纸条判定为失效。

实施例8试剂盒灵敏度

把经HPLC确定的阴性的水果样品溶液，稀释1mg/mL的2,4-二氯苯氧乙酸，使终浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5μg/mL，按照最优条件进行层析卡检测。通过观察T线和C线，判定结果的阴阳性。同时检测2,4-二氯苯氧乙酸结构类似物，计算交叉反应率，判断mwLFIA方法的特异性。结果如下表所示，mwLFIA方法的检测限(消线值)为0.05μg/mL，其结构类似物4-氯苯氧乙酸为0.2μg/mL，2,4,5-三氯苯氧乙酸为0.5μg/mL。

实施例9实际样品分析

分别向阴性的蔬菜和水果中，添加2,4-二氯苯氧乙酸，使添加浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.25μg/mL，按照确定好的样品前处理方法处理，使用微孔侧流免疫层析试纸条和HPLC同时测定。结果表明微孔侧流免疫层析试纸条的样品阴阳性结果与HPLC的结果一致，准确率为100％，说明本研究建立的针对2,4-二氯苯氧乙酸的mwLFIA方法能够用于实际样品的检测。

其中，S1-S4表示蔬菜样品；S5-S8表示水果样品。

实施实例10试剂盒的稳定性实验

将试纸条和金标微孔放入铝箔袋中,37℃干燥保存,分别于第1、3、5、7天取出,采用本方法进行检查,几次检测结果相近,C、T线的颜色变化不大,灵敏度不变,表明本试剂盒的试纸条稳定性良好。

以上结合具体实施例，对本发明技术方案的具体实施方式进行了进一步描述，此具体实施方案是为了对本技术方案的详细描述，而不是为了限制本技术方案。以上所述的具体实施方案，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的技术构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通技术人员对本技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。