诊断阿尔茨海默病的用途及诊断阿尔茨海默病的装置

技术领域

本发明属于诊断医学领域，具体涉及β-淀粉样蛋白和硫黄素T在制备诊断阿尔茨海默病的试剂盒或装置中的用途，还涉及诊断阿尔茨海默病的装置。

背景技术

阿尔茨海默病是常见的痴呆疾病。老龄化社会中，阿尔茨海默病对社会、医疗和经济造成的负担正在日益加重；全国流行病学研究表明，我国65岁以上老年人中痴呆患病率约为6.05％，据此推算，我国老年人中有1500余万痴呆患者；经济调查显示，2015年我国防治阿尔茨海默病的经济费用已超过一万亿人民币，预计至2050年将达到十二万亿元人民币。阿尔茨海默病的诊断和防治已成为当前亟需解决的重大社会问题。

自神经病理学家Alois Alzheimer在20世纪早期首次描述该病的组织病理学以来，人们逐渐认识到，异常蛋白积聚在阿尔茨海默病病理发生机制中有重要作用。阿尔茨海默病的典型病理特征包括神经炎性斑和神经原纤维缠结，神经炎性斑主要是Aβ的细胞外聚集导致。越来越多证据表明，脑内Aβ的错误折叠、寡聚化和积聚是阿尔茨海默病病理改变的触发因素。可在脑内错误折叠、寡聚化和积聚的Aβ称为Aβ种蛋白。脑内Aβ的错误折叠、寡聚化和积聚过程遵循接种—成核机制，即Aβ可自我组装形成小的聚集核心，然后在脑内诱发蛋白错误折叠和聚集的连锁反应，其间将形成几种中间产物如可溶性Aβ寡聚体和Aβ原纤维等。

近年来，针对阿尔茨海默病的新药临床试验屡屡宣告失败，其原因之一可能是受试人群主要集中于痴呆阶段患者，这类患者的脑内神经元已大量死亡，药物治疗难以逆转疾病进程。鉴于此，将阿尔茨海默病诊治研究从痴呆阶段移至痴呆前阶段或临床前阶段已成业内共识。以往研究证据表明，Aβ错误折叠、寡聚化和积聚过程在临床症状出现前的数年或数十年已开始，其中间产物例如Aβ寡聚体在患者的血液或脑脊液中被发现。

现有的蛋白定量分析技术多基于抗原抗体的免疫反应原理，其检测下限仅能达到皮摩尔水平，但是，阿尔茨海默病患者体液中的Aβ种蛋白含量通常低于皮摩尔水平且本身有较大的异质性，采用免疫化学方法难以准确检测阿尔茨海默病患者体液中的Aβ种蛋白含量，也就无法通过检测Aβ种蛋白含量来进行阿尔茨海默病的诊断。

目前亟需一种通过准确测定Aβ种蛋白来诊断阿尔茨海默病的方法。

发明内容

本发明提供了β-淀粉样蛋白和硫黄素T在制备诊断阿尔茨海默病的试剂盒或装置中的用途。本发明利用待测者的外周血血浆进行诊断，创伤性小，速度快，诊断结果准确、可靠，适于广泛推广。在此基础上，本发明还提供了诊断阿尔茨海默病的装置。

本发明第一方面涉及β-淀粉样蛋白和硫黄素T在制备诊断阿尔茨海默病的试剂盒或装置中的用途；其中，通过如下的步骤诊断阿尔茨海默病：

(1)获得待诊断者的血浆；

(2)将β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液、血浆及可选的溶剂相混合，得到混合物；

(3)将混合物先在25℃～40℃(例如30℃、35℃、37℃)孵育15～45分钟(例如20分钟、26分钟、29.5分钟、30分钟、33分钟、37分钟、40分钟、43分钟)，再在超声下处理5秒～2分钟(例如10秒、30秒、1分钟、1.5分钟)或振荡下处理40秒～3分钟(例如50秒、1分钟、1.5分钟、2分钟)，前述的孵育-处理过程可选择重复至少一次(例如10次、30次、50次、59次、60次、70次、80次、100次、150次、200次、250次、300次)，得到待测产物；优选超声的功率为100～600W(例如120W、160W、240W、300W、400W、500W)；优选振荡的速率为300～700rpm(例如350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm)；

(4)采用435～445nm(例如435nm、440nm)激发光及475～485nm(例如480nm、485nm)发射光检测待测产物的荧光值及空白对照的荧光值；

(5)计算待测产物的荧光值和空白对照的荧光值的比值，如果比值≥阈值，则诊断为患有阿尔茨海默病，否则诊断为不患有阿尔茨海默病；

其中，步骤(3)中孵育-处理过程的次数和步骤(5)中的阈值通过ROC曲线分析法获得。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(3)中孵育-处理的次数以及步骤(5)中的阈值通过包括如下步骤的ROC曲线分析法获得：

1)获得样本人群的血浆；

2)将样本人群的血浆与β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液及可选的溶剂相混合，得到混合物；

3)将步骤2)的混合物先在25℃～40℃(例如30℃、35℃、37℃)孵育15～45分钟(例如20分钟、26分钟、29.5分钟、30分钟、33分钟、37分钟、40分钟、43分钟)，再在超声下处理5秒～2分钟(例如10秒、30秒、1分钟、1.5分钟)或振荡下处理40秒～3分钟(例如50秒、1分钟、1.5分钟、2分钟)，重复前述的孵育-处理过程多次(例如10次、30次、50次、59次、60次、70次、80次、100次、150次、200次、250次、300次)；优选超声的功率为100～600W(例如120W、160W、200W、240W、300W、400W、500W)；优选振荡的速率为300～700rpm(例如350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm)；

4)以435～445nm(例如435nm、440nm)激发光及475～485nm(例如480nm、485nm)发射光检测步骤3)中每次孵育-处理过程所得产物的荧光值以及空白对照的荧光值；

5)计算步骤3)中每次孵育-处理过程所得产物的荧光值与空白对照荧光值的比值，根据所述比值及样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果绘制出多条ROC曲线；

6)选择曲线下面积最大的ROC曲线或者最佳临界点最靠近(0,1)点的ROC曲线，此ROC曲线对应的步骤3)中孵育-处理过程的次数即为步骤(3)中孵育-处理的次数，根据此ROC曲线上的最佳临界点确定步骤(5)中的阈值。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(3)和/或步骤3)中，超声的功率为100～600W，例如200W。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(3)和/或步骤3)中，振荡的模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(2)和/或步骤2)中，β-淀粉样蛋白与血浆的比例为25～500μmol/L，例如80μmol/L、100μmol/L、150μmol/L。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(2)和/或步骤2)中，β-淀粉样蛋白与硫黄素T的摩尔比为(0.1～3):1，例如1:4、1:2、4:5、1:1、5:4、2:1。

本发明第一方面的一些实施方式中，所述用途具有如下(A)至(L)中的一项或多项特征：

(A)步骤(1)和/或步骤1)中，所述血浆为外周血血浆；

(B)步骤(2)和/或步骤2)中，混合物的pH值为7～8，例如7.4；

(C)步骤(2)和/或步骤2)中，β-淀粉样蛋白选自Aβ40、Aβ42、Aβ42氨基端缩短肽(例如Aβ5-42)和Aβ42氨基端延长肽，优选为Aβ40；

(D)步骤(2)和/或步骤2)中，β-淀粉样蛋白溶液的浓度为50～200μmol/L，例如70μmol/L、100μmol/L、150μmol/L；

优选地，β-淀粉样蛋白溶液的溶剂选自氨水、氢氧化钠水溶液或DMSO水溶液，更优选为重量含量为0.05％～1％(例如0.1％)的氨水；

(E)步骤(2)和/或步骤2)中，硫黄素T溶液的浓度为50～200μmol/L，例如70μmol/L、100μmol/L、150μmol/L；

优选地，硫黄素T溶液的溶剂选自碳酸氢盐缓冲液、HEPES缓冲液和PBS缓冲液，更优选为PBS缓冲液；

(F)步骤(2)和/或步骤2)中，所述溶剂选自碳酸氢盐缓冲液、HEPES缓冲液和PBS缓冲液，优选为PBS缓冲液；

(G)步骤(2)和/或步骤2)中，血浆与溶剂的体积比为1:(4～40)，例如1:10、1:15、1:20、1:25、1:30；

(H)步骤(3)和/或步骤3)中，在避光条件下孵育和处理；

优选地，通过不透光微孔板提供避光条件；

(I)步骤(4)和/或步骤4)中，采用荧光检测器检测荧光值；

(J)步骤5)中样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果通过如下的步骤获得：

如被测者符合2011年国家老龄化研究所和阿尔茨海默病协会的阿尔茨海默病诊断标准且存在阿尔茨海默病病理生理过程的证据，则诊断为患有阿尔茨海默病；

如被测者的简易精神状态量表评分＞26分及临床痴呆量表整体评分为0，并且，被测者脑脊液中Aβ42/Aβ40和Aβ42/p-tau比值正常或淀粉样蛋白PET阴性显像，则诊断为不患阿尔茨海默病；

(K)步骤(4)中的空白对照按照步骤(2)制备且不添加待诊断者的血浆；

(L)步骤3)中的空白对照按照步骤2)制备且不添加样本人群的血浆。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)和/或步骤1)中，通过如下的步骤获得血浆：

空腹采血收集在抗凝管中，采血后2小时内离心处理，吸取上层血浆，低温(例如-80℃)保存；优选离心处理的转速为3000rpm；优选离心处理的时间为15分钟。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(2)和/或步骤2)中，在避光条件下混合，优选在常温避光条件下混合。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤5)中，采用SPSS软件绘制ROC曲线；优选地，以每次孵育-处理过程所得产物的荧光值与空白对照荧光值的比值作为SPSS中的检验变量，以样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果作为SPSS中的状态变量。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤6)可通过SPSS软件执行。

本发明第一方面的一些实施方式中，步骤5)中，在计算之前，对每次孵育-处理过程所得产物的荧光值与空白对照荧光值进行增益处理。

本发明第二方面涉及一种诊断阿尔茨海默病的装置，包括：

混合模块，用于将β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液、待诊断者的血浆及可选的溶剂相混合以得到混合物；

孵育及处理模块，用于将混合物先在25℃～40℃(例如30℃、35℃、37℃)孵育15～45分钟(例如20分钟、26分钟、29.5分钟、30分钟、33分钟、37分钟、40分钟、43分钟)，再在超声下处理5秒～2分钟(例如10秒、30秒、1分钟、1.5分钟)或振荡下处理40秒～3分钟(例如50秒、1分钟、1.5分钟、2分钟)，前述的孵育-处理过程可选择重复至少一次(例如10次、50次、60次、70次、100次、200次、250次)，以获得待测产物；优选超声的功率为100～600W(例如120W、160W、240W、300W、400W、500W)；优选振荡的速率为300～700rpm(例如350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm)；

检测模块，用于采用435～445nm(例如435nm、440nm)激发光及475～485nm(例如480nm、485nm)发射光检测待测产物的荧光值及空白对照的荧光值；

诊断模块，用于计算待测产物的荧光值和空白对照的荧光值的比值，如果比值≥阈值，则诊断为患有阿尔茨海默病，否则诊断为不患有阿尔茨海默病；

其中，孵育及处理模块中孵育-处理过程的次数和诊断模块中所设的阈值通过ROC曲线分析装置或本发明第一方面中的ROC曲线分析法获得。

本发明第二方面的一些实施方式中，诊断阿尔茨海默病的装置还包括第一输出模块，用于输出诊断结果。

本发明第二方面的一些实施方式中，诊断阿尔茨海默病的装置还包括采集模块，用于采集待诊断者的血浆。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块中，振荡模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块中，超声的功率为100～600W，例如200W。

本发明第二方面的一些实施方式中，ROC曲线分析装置包括：

样本混合模块，用于将样本人群的血浆与β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液、可选的溶剂相混合以得到混合物；

样本孵育及处理模块，用于将混合物先在25℃～40℃(例如30℃、35℃、37℃)孵育15～45分钟(例如20分钟、26分钟、29.5分钟、30分钟、33分钟、37分钟、40分钟、43分钟)，再在超声下处理5秒～2分钟(例如10秒、30秒、1分钟、1.5分钟)或振荡下处理40秒～3分钟(例如50秒、1分钟、1.5分钟、2分钟)，重复前述的孵育-处理过程多次(例如10次、50次、60次、70次、100次、200次、250次)；优选超声的功率为100～600W(例如120W、160W、240W、300W、400W、500W)；优选振荡的速率为300～700rpm(例如350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm)；

样本检测模块，用于以435～445nm(例如435nm、440nm)激发光及475～485nm(例如480nm、485nm)发射光检测样本孵育及处理模块中每次孵育-处理过程所得产物的荧光值以及空白对照的荧光值；

ROC曲线绘制模块，用于计算每次孵育-处理过程所得产物的荧光值与空白对照荧光值的比值，根据所述比值及样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果绘制出多条ROC曲线；

ROC曲线分析模块，用于选择曲线下面积最大的ROC曲线或者最佳临界点最靠近(0,1)点的ROC曲线，根据此ROC曲线对应的孵育-处理过程的次数确定所述孵育及处理模块中的孵育-处理过程次数，根据此ROC曲线上的最佳临界点确定所述诊断模块中的阈值。

本发明第二方面的一些实施方式中，ROC曲线分析装置还包括样本采集模块，用于采集样本人群的血浆。

本发明第二方面的一些实施方式中，样本孵育及处理模块中，超声的功率为100～600W，例如200W。

本发明第二方面的一些实施方式中，样本孵育及处理模块中，振荡模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块、和/或样本孵育及处理模块中，β-淀粉样蛋白与血浆的比例、β-淀粉样蛋白与硫黄素T的摩尔比如本发明第一方面中所述。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块、和/或样本孵育及处理模块中，β-淀粉样蛋白选自Aβ40、Aβ42、Aβ42氨基端缩短肽(例如Aβ5-42)和Aβ42氨基端延长肽，优选为Aβ40。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块、和/或样本孵育及处理模块中，β-淀粉样蛋白溶液的溶剂选自氨水、氢氧化钠水溶液或DMSO水溶液，优选为0.1％氨水。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块、和/或样本孵育及处理模块中，硫黄素T溶液的溶剂选自碳酸氢盐缓冲液、HEPES缓冲液和PBS缓冲液，优选为PBS缓冲液。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块、和/或样本孵育及处理模块中，所述溶剂选自碳酸氢盐缓冲液、HEPES缓冲液和PBS缓冲液，优选为PBS缓冲液。

本发明第二方面的一些实施方式中，所述血浆为外周血血浆。

本发明第二方面的一些实施方式中，孵育及处理模块、和/或样本孵育及处理模块提供避光条件，优选通过不透光的微孔板提供避光条件。

本发明第二方面的一些实施方式中，所述检测模块和/或样本检测模块包括荧光检测器，用于检测荧光值。

本发明第二方面的一些实施方式中，样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果的获取方法如本发明第一方面中所述。

本发明第二方面的一些实施方式中，检测模块中，空白对照按照本发明第一方面中步骤(2)制备且不添加待诊断者的血浆。

本发明第二方面的一些实施方式中，样本检测模块中，空白对照按照本发明第一方面中步骤2)制备且不添加样本人群的血浆。

本发明第二方面的一些实施方式中，ROC曲线绘制模块中，采用SPSS软件绘制ROC曲线；优选地，以每次孵育-处理过程所得产物的荧光值与空白对照荧光值的比值作为SPSS中的检验变量，以样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果作为SPSS中的状态变量绘制曲线。

本发明第三方面涉及一种诊断阿尔茨海默病的方法，包括本发明第一方面所述的步骤(1)至(5)；

其中，步骤(3)中孵育-处理过程的次数以及步骤(5)中的阈值通过ROC曲线分析法获得。

本发明第三方面的一些实施方式中，所述ROC曲线分析法包括本发明第一方面所述的步骤1)至6)。

本发明第四方面涉及一种诊断阿尔茨海默病的装置，其包括：

存储器，用于存储指令；

处理器，耦合到所述存储器，处理器被配置为基于所述存储器存储的指令执行如本发明第三方面所述的诊断阿尔茨海默病的方法。

本发明第五方面涉及一种计算机可读存储介质，其中，所述可读存储介质存储有计算机指令，所述指令被处理器执行时实现如本发明第三方面所述的诊断阿尔茨海默病的方法。

本发明第六方面涉及β-淀粉样蛋白和硫黄素T，用于诊断阿尔茨海默病。

本发明第六方面的一些实施方式中，诊断阿尔茨海默病的方法如本发明第三方面中所述。

本发明第七方面涉及一种诊断阿尔茨海默病的装置，包括：控制模块、孵育模块、处理模块、荧光检测模块和分析模块，所述控制模块分别与孵育模块、处理模块、荧光检测模块和分析模块信号连接，所述荧光检测模块与分析模块信号连接；其中，

控制模块，用于向各模块发送指令以控制模块运行，接收各模块完成工作的反馈信号以控制装置的工作流程；

孵育模块，用于根据控制模块发送的指令，将β-淀粉样蛋白或其溶液与硫黄素T或其溶液、待诊断者的血浆及可选的溶剂形成的混合物在25℃～40℃(例如30℃、35℃、37℃)孵育15～45分钟(例如20分钟、26分钟、29.5分钟、30分钟、33分钟、37分钟、40分钟、43分钟)以获得孵育产物，完成工作后向控制模块发送反馈信号；

处理模块，用于根据控制模块发送的指令，将所述孵育产物在超声下处理5秒～2分钟(例如10秒、30秒、1分钟、1.5分钟)或振荡下处理40秒～3分钟(例如50秒、1分钟、1.5分钟、2分钟)，完成工作后向控制模块发送反馈信号；并且，所述控制模块可选择按照孵育模块和处理模块的次序循环调用多次(例如50次、60次、70次、100次、200次、250次)，以获得待测产物；优选超声的功率为100～600W(例如120W、160W、240W、300W、400W、500W)；优选振荡的速率为300～700rpm(例如350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm)；

荧光检测模块，用于根据控制模块发送的指令，采用435～445nm(例如435nm、440nm)激发光及475～485nm(例如480nm、485nm)发射光检测待测产物的荧光值和空白对照的荧光值，然后将检测数据发送给分析模块，完成工作后向控制模块发送反馈信号；

分析模块，用于根据控制模块发送的指令，接收荧光检测模块发送的数据，然后计算待测产物的荧光值和空白对照的荧光值的比值，如果比值≥阈值，则诊断为患有阿尔茨海默病，否则诊断为不患有阿尔茨海默病；

其中，按照孵育模块和处理模块次序循环调用的次数以及所述阈值通过ROC曲线分析法获得。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述ROC曲线分析为本发明第一方面中所述的ROC曲线分析法。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述装置还包括样品递送模块，其与控制模块信号连接，用于接收控制模块发送的指令，按照指令向各模块递送样品或者在模块之间递送样品，每次完成递送工作后向控制模块发送反馈信号。

本发明第七方面的一些实施方式中，样品递送模块用于将β-淀粉样蛋白或其溶液与硫黄素T或其溶液、待诊断者的血浆及可选的溶剂形成的混合物递送至孵育模块、在孵育模块与处理模块之间递送样品、或者在处理模块与荧光检测模块之间递送样品。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述孵育模块包括至少一个(例如两个)控温加热板，用于提供孵育所需的温度；优选地，两个控温加热板用于分别设置在样品的顶部和底部；优选地，控温加热板包括金属板体和设置在金属板体四角的温度传感器。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述处理模块包括超声处理设备、上盖板和下盖板，所述上盖板和下盖板用于各自设置在孵育产物的顶部和底部；处理模块工作时，上盖板和下盖板保持恒温且上盖板比下盖板的温度高0.5℃～30℃，例如2℃、20℃。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述超声处理设备为本领域常规的超声处理器。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述处理模块包括振荡处理设备，优选其振荡模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述振荡处理设备为本领域常规的振荡处理器。

本发明第七方面的一些实施方式中，所述装置还包括第二输出模块，所述第二输出模块分别与控制模块、分析模块信号连接，用于根据控制模块发送的指令，接收分析模块发送的诊断结果，之后输出诊断结果。

本发明中，如无特别说明，其中：

术语“β-淀粉样蛋白”是指由淀粉样前体蛋白依次经β-分泌酶和γ-分泌酶水解的代谢产物，具有可溶性单体、可溶性寡聚体和不可溶的纤维聚集体等多种形式。可溶性的寡聚体被认为是最强的神经毒性物质，与阿尔茨海默病患者认知功能障碍和突触损伤显著相关，在阿尔茨海默病的病理生理过程中起到很关键的作用。

术语“硫黄素T”又称碱性黄1；2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓氯化物，属于化工染料，CAS号2390-54-7。

术语“ROC曲线”也称“受试者工作特征曲线”，反映敏感性与特异性之间关系的曲线。横坐标X轴为1–特异性，也称为假阳性率(误报率)；纵坐标Y轴称为敏感性，也称为真阳性率(敏感度)。

术语“最佳临界点”是指ROC曲线上最靠近左上角的一点。

术语“PBS缓冲液”是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。

本发明取得的有益效果：

本发明方法通过采集外周血诊断阿尔茨海默病，创伤性小，速度快，诊断结果准确、可靠，适于广泛推广。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1本发明用途中诊断阿尔茨海默病方法的一个实施例的示意图；

图2为本发明ROC曲线分析法的一个实施例的示意图；

图3为本发明诊断阿尔茨海默病的装置的一个实施例的示意图；

图4为本发明ROC曲线分析装置的一个实施例的示意图；

图5为本发明诊断阿尔茨海默病的装置的另一实施例的示意图；

图6为实施例中孵育44.5小时的ROC曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图1为本发明用途中诊断阿尔茨海默病方法的一个实施例的示意图。

所述方法包括如下步骤：

步骤101：获得待诊断者的血浆；

步骤102：将β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液、血浆及可选的溶剂相混合，得到混合物；

步骤103：将混合物先在35℃～38℃孵育25～30分钟，再在超声下处理5秒～2分钟或振荡下处理40秒～3分钟，前述的孵育-处理过程可选择重复至少一次，得到待测产物；超声的功率为100～600W；振荡的速率为500rpm；

步骤104：采用440nm激发光及480nm发射光检测待测产物的荧光值及空白对照的荧光值；

步骤105：计算待测产物的荧光值和空白对照的荧光值的比值，如果比值≥阈值，则诊断为患有阿尔茨海默病，否则诊断为不患有阿尔茨海默病；

其中，步骤103中孵育-处理过程的次数和步骤105中的阈值通过ROC曲线分析法获得。

本实施例中，步骤103中，超声的功率为100～600W。

本实施例中，步骤102中，血浆的样本量为20μL。

本实施例中，步骤102中，β-淀粉样蛋白与硫黄素T的摩尔比为1:4。

本实施例中，血浆为外周血血浆。

本实施例中，步骤103中，在避光条件下孵育和处理，通过不透光微孔板提供避光条件。

本实施例中，步骤102中，混合物的pH值为7.4。

本实施例中，步骤102中，血浆与溶剂的体积比为1:6.5。

本实施例中，步骤102中，β-淀粉样蛋白为Aβ40。

本实施例中，步骤102中，β-淀粉样蛋白溶液的浓度为100μmol/L。

本实施例中，步骤102中，β-淀粉样蛋白溶液中的溶剂为重量含量为0.1％的氨水。

本实施例中，步骤102中，硫黄素T溶液的浓度为100μmol/L。

本实施例中，步骤102中，硫黄素T溶液中的溶剂为PBS缓冲液。

本实施例中，步骤102中，所述溶剂为PBS缓冲液。

本实施例中，步骤104中的空白对照按照步骤102制备且不添加血浆。

图2为本发明ROC曲线分析法的一个实施例的示意图。

所述方法包括如下步骤：

步骤201：获得样本人群的血浆；

步骤202：将样本人群的血浆与β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液及可选的溶剂相混合，得到混合物；

步骤203：将混合物先在35℃～38℃孵育25～30分钟，再在超声下处理5秒～2分钟或振荡下处理40秒～3分钟，重复前述的孵育-处理过程多次(例如10～300次)；超声的功率为100～600W；振荡的速率为500rpm；

步骤204：以440nm激发光和480nm发射光检测步骤203中每次孵育-处理过程所得产物的荧光值以及空白对照的荧光值；

步骤205：计算步骤203中每次孵育-处理过程所得产物的荧光值与空白对照荧光值的比值，根据所述比值及样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果绘制出多条ROC曲线；

步骤206：选择曲线下面积最大的ROC曲线或者最佳临界点最靠近(0,1)点的ROC曲线，此ROC曲线对应的步骤203中孵育-处理过程的次数即为步骤103中孵育-处理的次数，根据此ROC曲线上的最佳临界点确定步骤105中的阈值。

本实施例中，步骤203中，超声的功率为100～600W。本实施例中，步骤203中，振荡模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

本实施例中，步骤202中，血浆的样本量为20μL。

本实施例中，步骤202中，β-淀粉样蛋白与血浆的比例为50μmol/L。

本实施例中，步骤202中，β-淀粉样蛋白与硫黄素T的摩尔比为1:4。

本实施例中，血浆为外周血血浆。

本实施例中，步骤203中，在避光条件下孵育和处理，通过不透光微孔板提供避光条件。

本实施例中，步骤202中，混合物的pH值为7.4。

本实施例中，步骤202中，血浆与溶剂的比例为1:6.5。

本实施例中，步骤202中，β-淀粉样蛋白为Aβ40。

本实施例中，步骤202中，β-淀粉样蛋白溶液的浓度为100μmol/L。

本实施例中，步骤202中，β-淀粉样蛋白溶液中的溶剂为重量含量为0.1％的氨水。

本实施例中，步骤202中，硫黄素T溶液的浓度为100μmol/L。

本实施例中，步骤202中，硫黄素T溶液中的溶剂为PBS缓冲液。

本实施例中，步骤202中，所述溶剂为PBS缓冲液。

本实施例中，步骤205中，样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果通过如下的步骤获得：

如被测者符合2011年国家老龄化研究所和阿尔茨海默病协会的阿尔茨海默病诊断标准且存在阿尔茨海默病病理生理过程的证据，则诊断为患有阿尔茨海默病；

如被测者的简易精神状态量表评分＞26分及临床痴呆量表整体评分为0，并且，被测者脑脊液中Aβ42/Aβ40和Aβ42/p-tau比值正常或淀粉样蛋白PET阴性显像，则诊断为不患阿尔茨海默病。

本实施例中，步骤204中的空白对照按照步骤202制备且不添加血浆。

图3为本发明诊断阿尔茨海默病的装置的一个实施例的示意图。

所述装置包括：

采集模块11，用于采集待诊断者的血浆；

混合模块12，用于将β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液、待诊断者的血浆及可选的溶剂相混合以得到混合物；

孵育及处理模块13，用于将混合物先在35℃～38℃孵育25～30分钟，再在超声下处理5秒～2分钟或振荡下处理40秒～3分钟，前述的孵育-处理过程可选择重复至少一次，以获得待测产物；超声的功率为100～600W；振荡的速率为500rpm；

检测模块14，用于采用440nm激发光及480nm发射光检测待测产物的荧光值及空白对照的荧光值；

诊断模块15，用于计算待测产物的荧光值和空白对照的荧光值的比值，如果比值≥阈值，则诊断为患有阿尔茨海默病，否则诊断为不患有阿尔茨海默病；

第一输出模块16，用于输出诊断结果；

其中，孵育及处理模块中孵育-处理过程的次数和诊断模块中所设的阈值通过ROC曲线分析装置或图2中所述的ROC曲线分析法获得。

本实施例中，所述血浆为外周血血浆。

本实施例中，孵育及处理模块中，振荡模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

本实施例中，孵育及处理模块中，超声的功率为100～600W。

本实施例中，孵育及处理模块通过不透光的微孔板避光培养。

图4为本发明ROC曲线分析装置的一个实施例的示意图；

所述ROC曲线分析装置，包括：

样本采集模块21，用于采集样本人群的血浆；

样本混合模块22，用于将样本人群的血浆、β-淀粉样蛋白或其溶液、硫黄素T或其溶液、可选的溶剂相混合以得到混合物；

样本孵育及处理模块23，用于将混合物先在35℃～38℃孵育25～30分钟，再在超声下处理5秒～2分钟或振荡下处理40秒～3分钟，重复前述的孵育-处理过程多次(例如10～300次)；超声的功率为100～600W；振荡的速率为500rpm；

样本检测模块24，用于以440nm激发光和480nm发射光检测样本孵育及处理模块23中每次孵育-处理过程所得产物的荧光值以及空白对照的荧光值；

ROC曲线绘制模块25，用于计算每次孵育-处理过程所得产物的荧光值与空白对照荧光值的比值，根据所述比值及样本人群的阿尔茨海默病实际患病结果绘制出多条ROC曲线；

ROC曲线分析模块26，用于选择曲线下面积最大的ROC曲线或者最佳临界点最靠近(0,1)点的ROC曲线，根据此ROC曲线对应的孵育-处理过程的次数确定孵育及处理模块13中的孵育-处理过程次数，根据此ROC曲线上的最佳临界点确定诊断模块15中的阈值。

本实施例中，血浆为外周血血浆。

本实施例中，振荡模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

本实施例中，样本孵育及处理模块23中，在避光条件下孵育和处理，通过不透光微孔板提供避光条件。

本发明还涉及一种诊断阿尔茨海默病的装置，其包括：

存储器，用于存储指令；

处理器，耦合到所述存储器，处理器被配置为基于所述存储器存储的指令执行如图1中所述的方法。

本发明还涉及一种计算机可读存储介质，其中，所述可读存储介质存储有计算机指令，所述指令被处理器执行时实现如图1或2所述的方法。

存储器可以包括高速RAM存储器，也可包括非易失性存储器(non-volatilememory)，例如至少一个磁盘存储器。存储器也可以是存储器阵列。存储器还可能被分块，并且可按一定的规则组合成虚拟卷。

处理器可以是一个中央处理器CPU，或者GPU，或者可以是专用集成电路ASIC(Application Specific Integrated Circuit)，或者是被配置成实施本发明实施例的一个或多个集成电路。

上面描述的装置可以实现为用于执行本申请所描述功能的通用处理器、可编程逻辑控制器(PLC)、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件或者其任意适当组合。

图5为本发明诊断阿尔茨海默病的装置的另一实施例的示意图；

所述装置包括：控制模块31、孵育模块32、处理模块33、荧光检测模块34、分析模块35、第二输出模块36和样品递送模块37，所述控制模块31分别与孵育模块32、处理模块33、荧光检测模块34、分析模块35、第二输出模块36和样品递送模块37信号连接，所述荧光检测模块34与分析模块35信号连接，所述分析模块35与第二输出模块36信号连接；其中，

控制模块31，用于向各模块发送指令以控制模块运行，接收各模块完成工作的反馈信号以控制装置的工作流程；

孵育模块32，用于根据控制模块发送的指令，将β-淀粉样蛋白或其溶液与硫黄素T或其溶液、待诊断者的血浆及可选的溶剂形成的混合物在35℃～38℃孵育25～30分钟以获得孵育产物，完成工作后向控制模块发送反馈信号；

处理模块33，用于根据控制模块发送的指令，将所述孵育产物在超声下处理5秒～2分钟或振荡下处理40秒～3分钟，完成工作后向控制模块发送反馈信号；并且，所述控制模块可选择按照孵育模块和处理模块的次序循环调用多次，以获得待测产物；超声的功率为100～600W；振荡的速率为500rpm；

荧光检测模块34，用于根据控制模块发送的指令，采用440nm激发光及480nm发射光检测待测产物的荧光值和空白对照的荧光值，然后将检测数据发送给分析模块，完成工作后向控制模块发送反馈信号；

分析模块35，用于根据控制模块发送的指令，接收荧光检测模块发送的数据，然后计算待测产物的荧光值和空白对照的荧光值的比值，如果比值≥阈值，则诊断为患有阿尔茨海默病，否则诊断为不患有阿尔茨海默病，将诊断结果发送给第二输出模块，完成工作后向控制模块发送反馈信号；

第二输出模块36，用于根据控制模块发送的指令，接收分析模块发送的诊断结果，之后输出诊断结果；

样品递送模块37，用于接收控制模块发送的指令，按照指令向各模块递送样品或者在模块之间递送样品，每次完成递送工作后向控制模块发送反馈信号；

其中，按照孵育模块32和处理模块33的次序循环调用的次数以及所述阈值通过图2中的ROC曲线分析法获得。

本实施例中，所述孵育模块包括两个控温加热板，用于分别设置在样品的顶部和底部以提供孵育所需温度；其中，控温加热板包括金属板体和设置在金属板体四角的温度传感器。

本实施例中，所述处理模块包括振荡处理设备，优选其振荡模式选自线性振荡、圆周振荡和双圆周振荡。

另一实施例中，所述处理模块包括超声处理设备、上盖板和下盖板，所述上盖板和下盖板用于各自设置在孵育产物的顶部和底部；处理模块工作时，上盖板和下盖板保持恒温且上盖板比下盖板的温度高0.5～30℃。

本实施例中，超声处理设备和震荡处理设备均为本领域常规的设备。

采用图1-5所示的方法或装置进行诊断。

1.诊断方法的建立

本研究经首都医科大学宣武医院伦理委员会批准，每位受试者或其法定监护人签署书面知情同意书。实验及分析部分采用盲法进行。

1.1受试人群

阿尔茨海默病患者35人，性别、年龄和受教育程度与之相匹配的正常对照受试者34人。

1.1.1入组标准

阿尔茨海默病患者同时满足以下条件：

①符合2011年国家老龄化研究所和阿尔茨海默病协会的阿尔茨海默病诊断标准；

②存在阿尔茨海默病病理生理过程证据，包括脑脊液中Aβ42/Aβ40和Aβ42/p-tau比值降低或淀粉样蛋白PET阳性显像。

正常对照受试者同时满足以下条件：

①简易精神状态检查评分＞26分，并且，临床痴呆评定量表整体评分为0分；

②脑脊液中Aβ42/Aβ40和Aβ42/p-tau比值正常或淀粉样蛋白PET阴性显像。

1.1.2排除标准

阿尔茨海默病患者和正常对照受试者均需排除如下因素：

①存在可能引起认知功能障碍的系统性疾病；

②存在精神和神经发育迟滞；

③罹患无法配合完成认知检查的疾病；

④拒绝抽血。

1.2血液标本采集

早上空腹采血。每位受试者抽取外周血5ml注入紫头抗凝管内，2h内离心，3000转/分钟×15分钟离心，吸出上层血浆，进行分装，立即储存于-80℃冰箱中。

1.3血浆Aβ40错误折叠循环扩增及实时荧光定量分析

1.3.1材料

化学合成的Aβ40：分子量4329.86，纯度＞95％，批号GR3247209，美国Abcam公司；

硫黄素T：Thioflavin T(ThT)，批号MKCF7876，美国Sigma公司；

0.1％氨水：批号20160712，北京化学试剂总厂；

磷酸盐缓冲液：Phosphate Buffered Saline(PBS缓冲液)，批号20180828，北京索莱宝科技有限公司；

磷酸二氢钠：NaH

磷酸氢二钠：Na

氯化钠：NaCl，纯度≥99.5％，批号20140428，国药集团化学试剂有限公司；

六氟异丙醇：1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2propanol(HFIP)，批号WXBC6255V，纯度≥99.0％，美国Sigma公司；

全黑色不透明无菌96孔板：简称全黑板，批号14318020，美国Costar公司。

1.3.2硫黄素T母液制备

准确称取一定量的硫黄素T粉末，以PBS缓冲液为溶剂，配置成硫黄素T母液，避光冷冻保存。试验时，对硫黄素T母液用同样的溶剂进行稀释。

1.3.3Aβ40溶液制备

将冻干的Aβ40溶解于0.1％氨水中，得到Aβ40溶液。试验时，对Aβ40溶液用PBS缓冲液进行稀释。

1.3.4扩增及硫黄素T荧光分析

将10μL Aβ40溶液(浓度100μmol/L)、40μL硫黄素T溶液(浓度100μmol/L)、20μL血浆样品与PBS缓冲液溶液混合，得到混合物，其pH为7.4、总体积为200μL；将混合物加入不透明96孔板中在37℃恒温下孵育29分钟；再在37℃恒温下震荡或超声裂解1分钟，然后继续在37℃恒温下孵育29分钟，之后重复上述裂解过程；整个过程共处理85小时；每次裂解后以440nm激发光波长和480nm发射光波长对裂解产物进行硫黄素T荧光检测。

将10μL Aβ40溶液(浓度100μmol/L)、40μL硫黄素T溶液(浓度100μmol/L)与PBS缓冲液溶液混合，得到pH为7.4、总体积为200μL的液体作为空白对照，每次检测裂解产物荧光值的同时也对空白对照进行同样的硫黄素T荧光检测。

1.4数据处理及诊断方法的建立

将每次检测的裂解产物荧光值与空白对照荧光值同步增益处理，然后计算每次检测的裂解产物荧光值与空白对照荧光值的比值，称为标准比，以反映淀粉样蛋白聚集程度。

针对每次荧光检测，以受试人群的实际阿尔茨海默病患病状况作为状态变量(1为患病，0为不患病)，以受试人群的裂解产物荧光值与空白对照荧光值的比值作为检验变量，利用SPSS软件绘制ROC曲线，共获得多条ROC曲线。

选出左上角的最佳临界点最靠近(0,1)点的ROC曲线，其对应诊断方法为选取的方法，并根据ROC曲线的左上角的最佳临界点确定选取的诊断方法所采用的阈值。

经上述处理，本实施例选取的诊断方法是以处理44.5小时测到的孵育产物荧光值与空白对照荧光值的比值作为诊断参数，其ROC曲线如图6所示，阈值为0.5250，即，如果比值≥0.5250，诊断结果为患有阿尔茨海默病。

2.诊断方法的验证：

经首都医科大学宣武医院伦理委员会批准，每位待诊断者或其法定监护人签署书面知情同意书。实验及分析部分均采用盲法进行。

2.1入选标准：

共选取101位待诊断者，待诊断者均需排除如下因素：

①存在可能引起认知功能障碍的其它系统性疾病

②存在精神和神经发育迟滞；

③罹患无法配合完成认知检查的疾病；

④拒绝抽血。

2.2血液标本采集：同1.2。

2.3血浆Aβ40错误折叠循环扩增及实时荧光定量分析：

2.3.1至2.3.3分别同1.3.1至1.3.3。

2.3.4扩增及硫黄素T荧光分析：处理44.5小时，其余与1.3.4相同。

2.4诊断结果

按照1.4中方法进行诊断，结果如表1所示。

2.5采用1.1.1节中的方法获得待诊断者的正常、阿尔茨海默病高风险及阿尔茨海默病患病诊断结果，其中，临床上正常但诊断结果为患病的待诊断者被认为是阿尔茨海默病高风险者，结果如表1-2中所示。

表1

表2

由表1-2可知，本发明对53例认知障碍受试者的样本(53例样本均为经临床和PET或脑脊液证实的阿尔茨海默病患者)进行检测，诊断出阿尔茨海默病患者48例，与临床符合率达到90.6％，该诊断操作简单，适合在大规模队列中进行筛查。同时，本发明对48例认知正常受试者的样本进行检测，检测出阿尔茨海默病高风险者15例，有助于在正常人群中对阿尔茨海默病高发病风险者进行早期预警。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。