一种新型的拉曼光谱检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及免疫组化技术领域，尤其涉及一种新型的拉曼光谱检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

宫颈癌居于全球女性癌症发病率的第二位，是重要的公共健康问题。全球每年新增宫颈癌病例约50万，有27.3万人死于宫颈癌，其中约85％死亡病例发生在发展中国家，中国每年新增宫颈癌病例约有13.5万，占全球新发病例的1/3，因此中国也是宫颈癌高发国之一。目前，宫颈癌筛查普遍采用的是宫颈病变三阶梯诊断(液基细胞学、阴道镜和组织病理学诊断)联合HPV检测，但早期诊断宫颈癌仍然比较困难，存在取材困难，假阴性高，特异性低等问题。

表面增强拉曼光谱(SERS)技术具有简便、快速、干扰少、无损和成本低的特点，已经在分析化学、检验医学、食品安全和表面科学等领域进行了广泛和深入的研究。现有技术中，人们已经采用纳米SERS探针处理活细胞，进行SERS检测，但活性纳米粒子的导入是一种繁琐、高成本的过程，电穿孔导入纳米材料可能对细胞带来破坏，导致细胞信息的丢失，对细胞的鉴别和检测带来不可控的因素，同时由于生物细胞体系自身的复杂性，而且纳米材料与细胞生物体系的相互作用始终处于动态变化中，使得SERS检测结果的重现性和可靠性都相对较差。因此研究特异性高，同时不会对细胞造成破坏的宫颈癌检测方法尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种不破坏细胞、检测结果重现性和准确性高的一种新型的拉曼光谱检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种新型的拉曼光谱检测试剂盒，包括单克隆或多克隆抗体组、拉曼活性物质标记的二抗、拉曼表面增强剂、磷酸缓冲液和抗原修复液。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述单克隆或多克隆抗体组为兔抗人CD3抗体、兔抗人CK20抗体、兔抗人p53抗体、NapsinA抗体、鼠抗人CEA抗体、MUC-4抗体、p16抗体、CK10抗体、CK14抗体、CK17抗体和Bax抗体中的两种或多种组合，所述二抗为拉曼活性化合物标记的Polymer-酶标二抗。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述拉曼活性化合物为2,4-二硝基苯酚、氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素和氨基吖啶中的一种或多种组合。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述拉曼表面增强剂为金属纳米粒子和金属氧化物纳米粒子中的一种或多种组合。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述金属纳米粒子为银纳米粒子、金纳米粒子、铂纳米粒子、锂纳米粒子或铜纳米粒子中的一种或多种组合，粒径为100-200nm。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述金属氧化物为纳米粒子为氧化钛纳米粒子、氧化铁纳米粒子、氧化银纳米粒子、氧化锂纳米粒子、氧化铜纳米粒子、氧化金纳米粒子中的一种或多种组合。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述抗原修复液为EDTA缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。

在以上技术方案的基础上，优选的，还包括一种新型的拉曼光谱检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1，烤片、脱蜡和复水：将组织切片置于60-65℃的烘箱中60min；将经过烤片后的组织切片置于二甲苯中浸洗2次，每次10分钟，然后依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别浸洗2次，每次5分钟；

S2，抗原修复：用抗原修复液对上述经过烤片、脱蜡和复水后的肿瘤细胞切片进行95-100℃水浴加热修复15-30min或2450MHZ/秒微波修复10-30min；

S3，一抗孵育：将肿瘤组织石蜡切片用内源性过氧化物酶阻断10min后，用磷酸缓冲液清洗，滴加100μl单克隆抗体在石蜡切片上，在37℃条件下孵育50-90min，然后用磷酸缓冲液清洗3-4次；

S4，二抗标记：按照拉曼活性化合物∶二抗的体积比为(5-7)∶(8-10)的比例，将拉曼活性化合物加入到二抗溶液中，在37℃条件下进行化学配位耦合反应，得到标记有拉曼活性化合物的二抗；

S5，二抗偶联：将拉曼表面增强剂分散于金属化合物和磷酸缓冲液中，得到金属纳米粒子溶液；经过二抗标记后的肿瘤组织切片放入金属纳米粒子溶液，得到金属-抗体复合物；

S6，二抗孵育：将经过一抗孵育的肿瘤细胞切片与100μl金属-抗体复合物混合，在37℃条件下孵育30-40min，然后用磷酸缓冲液清洗2-3次；

S7，封片，检测：载玻片用吹风机吹干，然后在载玻片上滴加中性树胶，盖上盖玻片，待干片后放入拉曼光谱分析仪进行检测。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5所述的金属化合物为HAuCl

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S7所述共焦拉曼光谱仪检测，检测范围600-1800cm

本发明的一种新型的拉曼光谱检测试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明试剂盒引入抗体和抗原，将拉曼活性物质标记在二抗上，并且将金属纳米粒子偶联至二抗，利用抗体和抗原的特异性结合，将金属纳米粒子导入到肿瘤组织上，不破坏组织细胞，同时也提高了检测结果的重复性和准确性。

(2)本发明试剂盒用于癌症肿瘤细胞的鉴定，癌症的早期筛查，患者疗效评估以及抗癌药物的开发等技术领域。

(3)本发明将基于金属纳米粒子表面增强拉曼散射特性的生物检测技术和免疫组化诊断相结合，金属纳米粒子与抗体、抗原结合，解决了宫颈癌液基细胞学、阴道镜和组织病理学诊断的存在的假阴性率高，极易漏诊误诊的问题，病理标本难以取得的问题，提高了检测准确性和特异性。

(4)本发明试剂盒不限于宫颈癌的肿瘤组织细胞的检测，还可应用于乳腺癌、皮肤癌、骨骼癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、直肠癌、甲状腺癌和胃癌等肿瘤细胞的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的实施例一的拉曼光谱检测图；

图2为本发明的实施例二的拉曼光谱检测图；

图3为本发明的实施例三的拉曼光谱检测图；

图4为本发明的实施例四的拉曼光谱检测图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例一

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒，包括与宫颈癌阳性肿瘤组织抗原连接的兔抗人CD3抗体、兔抗人CK20抗体和兔抗人p53抗体，氨基苯甲酸和赤藓红标记的羊抗鼠IgG二抗，粒径为100nm的银纳米粒子和氧化钛纳米粒子，磷酸缓冲液和抗原修复液。

磷酸缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠81g，磷酸二氢钠4g，氯化钠220g，加入至25L蒸馏水中)。

抗原修复液为柠檬酸盐缓冲液为浓度为0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液(0.51g柠檬酸钠+0.095g柠檬酸+250ml蒸馏水)。

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1，烤片、脱蜡和复水：将宫颈癌阳性肿瘤组织切片置于60℃的烘箱中60min；将经过烤片后的组织切片置于二甲苯中浸洗2次，每次10分钟，然后依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别浸洗2次，每次5分钟；

S2，抗原修复：用抗原修复液对上述经过烤片、脱蜡和复水后的宫颈癌阳性肿瘤细胞切片进行95℃水浴加热修复15min；

S3，一抗孵育：将肿瘤组织石蜡切片用内源性过氧化物酶阻断10min后，用磷酸缓冲液清洗，滴加100μl兔抗人CD3抗体、兔抗人CK20抗体和兔抗人p53抗体混合液在石蜡切片上，在37℃条件下孵育50min，然后用磷酸缓冲液清洗3次；

S4，二抗标记：按照氨基苯甲酸∶赤藓红∶羊抗鼠IgG的体积比为2∶3∶8的比例，将氨基苯甲酸和赤藓红加入到羊抗鼠IgG溶液中，在37℃条件下进行化学配位耦合反应，得到氨基苯甲酸和赤藓红标记的Polymer-酶标二抗。

S5，二抗偶联：将银纳米粒子和氧化钛纳米粒子分散于HAuCl

金属纳米粒子溶液制备方法：将银纳米粒子和氧化钛纳米粒子分散在pH7.4的磷酸缓冲液中，加入1mol/L的NaAuCl

偶联方法：将金属纳米粒子溶液稀释1000倍，即1μl金属纳米粒子溶液需加入10ml抗体稀释液，抗体稀释液配方为100ml PBS中加入1g牛血清白蛋白、TritonX-1000.5ml和Proclin3000.5ml。经过二抗孵育后的切片放入100ml金属纳米粒子溶液，得到金属-抗原抗体复合物。

S6，二抗孵育：将经过一抗孵育的3张宫颈癌阳性肿瘤细胞切片分别与100μl金属-抗体复合物混合，在37℃条件下孵育30min，然后用磷酸缓冲液清洗2次；

S7，封片，检测：载玻片用吹风机吹干，然后在载玻片上滴加中性树胶，盖上盖玻片，待干片后放入拉曼光谱分析仪进行检测，检测范围600-1800cm

实施例二

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒，包括与宫颈癌阳性肿瘤组织抗原连接的NapsinA抗体、鼠抗人CEA抗体和MUC-4抗体，生物素和地高辛标记的二抗羊抗鼠IgG，粒径为200nm的金纳米粒子和氧化铁纳米粒子，磷酸缓冲液和抗原修复液。

磷酸缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠81g，磷酸二氢钠4g，氯化钠220g，加入至25L蒸馏水中)。

抗原修复液为柠檬酸盐缓冲液为浓度为0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液(0.51g柠檬酸钠+0.095g柠檬酸+250ml蒸馏水)。

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1，烤片、脱蜡和复水：将宫颈癌阳性肿瘤组织切片置于65℃的烘箱中60min；将经过烤片后的宫颈癌阳性肿瘤组织切片置于二甲苯中浸洗2次，每次10分钟，然后依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别浸洗2次，每次5分钟；

S2，抗原修复：用抗原修复液对上述经过烤片、脱蜡和复水后的肿瘤细胞切片进行100℃水浴加热修复30min；

S3，一抗孵育：将肿瘤组织石蜡切片用内源性过氧化物酶阻断10min后，用磷酸缓冲液清洗，滴加100μl NapsinA抗体、鼠抗人CEA抗体和MUC-4抗体混合液在石蜡切片上，在37℃条件下孵育90min，然后用磷酸缓冲液清洗4次；

S4，二抗标记：按照生物素∶地高辛∶羊抗鼠IgG的体积比为3∶4∶10的比例，将生物素和地高辛加入到羊抗鼠IgG溶液中，在37℃条件下进行化学配位耦合反应，得到生物素和地高辛标记的Polymer-酶标二抗；

S5，二抗偶联：将金纳米粒子和氧化铁纳米粒子分散于AgNO

金属纳米粒子溶液制备方法：将金纳米粒子和氧化铁纳米粒子分散在pH7.4的磷酸缓冲液中，加入1mol/L的AgNO

偶联方法：将金属纳米粒子溶液稀释1000倍，即1μl金属纳米粒子溶液需加入10ml抗体稀释液，抗体稀释液配方为100ml PBS中加入1g牛血清白蛋白、TritonX-1000.5ml和Proclin3000.5ml。经过二抗孵育后的切片放入100ml金属纳米粒子溶液，得到金属-抗原抗体复合物。

S6，二抗孵育：将经过一抗孵育的3张宫颈癌阳性肿瘤细胞切片分别与100μl金属-抗体复合物混合，在37℃条件下孵育40min，然后用磷酸缓冲液清洗3次；

S7，封片，检测：载玻片用吹风机吹干，然后在载玻片上滴加中性树胶，盖上盖玻片，待干片后放入拉曼光谱分析仪进行检测，检测范围600-1800cm

实施例三

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒，包括与宫颈癌阳性肿瘤组织抗原连接的p16抗体、CK10抗体和CK14抗体，偶氮甲碱和花青标记的二抗羊抗鼠IgG，粒径为150nm的铂纳米粒子和氧化锂纳米粒子，磷酸缓冲液和抗原修复液。

磷酸缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠81g，磷酸二氢钠4g，氯化钠220g，加入至25L蒸馏水中)。

抗原修复液为柠檬酸盐缓冲液为浓度为0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液(0.51g柠檬酸钠+0.095g柠檬酸+250ml蒸馏水)。

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1，烤片、脱蜡和复水：将宫颈癌阳性肿瘤组织切片置于60-65℃的烘箱中60min；将经过烤片后的宫颈癌阳性肿瘤组织切片置于二甲苯中浸洗2次，每次10分钟，然后依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别浸洗2次，每次5分钟；

S2，抗原修复：用抗原修复液对上述经过烤片、脱蜡和复水后的肿瘤细胞切片2450MHZ/秒微波修复20min；

S3，一抗孵育：将肿瘤组织石蜡切片用内源性过氧化物酶阻断10min后，用磷酸缓冲液清洗，分别滴加100μl的100μl p16抗体、CK10抗体和CK14抗体溶液，在37℃条件下孵育80min，然后用磷酸缓冲液清洗3次；

S4，二抗标记：按照偶氮甲碱∶花青∶羊抗鼠IgG的体积比为3∶3∶8的比例，将偶氮甲碱和花青加入到羊抗鼠IgG溶液中，在37℃条件下进行化学配位耦合反应，得到偶氮甲碱和花青标记的Polymer-酶标二抗；

S5，二抗偶联：将锂纳米粒子和氧化铜纳米粒子分散于CuCl

金属纳米粒子溶液制备方法：将锂纳米粒子和氧化铜纳米粒子分散在pH7.4的磷酸缓冲液中，加入1mol/L的CuCl

偶联方法：将金属纳米粒子溶液稀释1000倍，即1μl金属纳米粒子溶液需加入10ml抗体稀释液，抗体稀释液配方为100ml PBS中加入1g牛血清白蛋白、TritonX-1000.5ml和Proclin3000.5ml。经过二抗孵育后的切片放入100ml金属纳米粒子溶液，得到金属-抗原抗体复合物。

S6，二抗孵育：将经过一抗孵育的3张肿瘤细胞切片分别与100μl金属-抗体复合物混合，在37℃条件下孵育33min，然后用磷酸缓冲液清洗3次；

S7，封片，检测：载玻片用吹风机吹干，然后在载玻片上滴加中性树胶，盖上盖玻片，待干片后放入拉曼光谱分析仪进行检测，检测范围600-1800cm

实施例四

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒，包括与宫颈癌阳性肿瘤组织抗原连接的CK17抗体和Bax抗体，琥珀酰荧光素和氨基吖啶标记的二抗羊抗鼠IgG，粒径为110nm的铜纳米粒子和氧化铜纳米粒子，磷酸缓冲液和抗原修复液。

磷酸缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠81g，磷酸二氢钠4g，氯化钠220g，加入至25L蒸馏水中)。

抗原修复液为柠檬酸盐缓冲液为浓度为0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液(0.51g柠檬酸钠+0.095g柠檬酸+250ml蒸馏水)。

一种新型的拉曼光谱检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1，烤片、脱蜡和复水：将宫颈癌阳性肿瘤组织切片置于61℃的烘箱中60min；将经过烤片后的组织切片置于二甲苯中浸洗2次，每次10分钟，然后依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别浸洗2次，每次5分钟；

S2，抗原修复：用抗原修复液对上述经过烤片、脱蜡和复水后的宫颈癌阳性肿瘤细胞切片进行98℃水浴加热修复20min；

S3，一抗孵育：将肿瘤组织石蜡切片用内源性过氧化物酶阻断10min后，用磷酸缓冲液清洗，分别滴加100μl的CK17抗体和Bax抗体溶液，在37℃条件下孵育70min，然后用磷酸缓冲液清洗4次；

S4，二抗标记：按照琥珀酰荧光素∶氨基吖啶∶羊抗鼠IgG的体积比为2∶3∶9的比例，将琥珀酰荧光素和氨基吖啶加入到羊抗鼠IgG溶液中，在37℃条件下进行化学配位耦合反应，得到琥珀酰荧光素和氨基吖啶标记的Polymer-酶标二抗；

S5，二抗偶联：将铜纳米粒子和氧化铜分散于CuCl

金属纳米粒子溶液制备方法：将铜纳米粒子和氧化铜纳米粒子分散在pH7.4的磷酸缓冲液中，加入1mol/L的CuCl

偶联方法：将金属纳米粒子溶液稀释1000倍，即1μl金属纳米粒子溶液需加入10ml抗体稀释液，抗体稀释液配方为100ml PBS中加入1g牛血清白蛋白、TritonX-1000.5ml和Proclin3000.5ml。经过二抗孵育后的切片放入100ml金属纳米粒子溶液，得到金属-抗原抗体复合物。

S6，二抗孵育：将经过一抗孵育的2张宫颈癌阳性肿瘤细胞切片分别与100μl金属-抗体复合物混合，在37℃条件下孵育37min，然后用磷酸缓冲液清洗2次；

S7，封片，检测：载玻片用吹风机吹干，然后在载玻片上滴加中性树胶，盖上盖玻片，待干片后放入拉曼光谱分析仪进行检测，检测范围600-1800cm-1，激发波长785mm，采样时间20s，激发光功率为30mw。

以电穿孔导入银纳米粒子方法做对比，将银纳米离子导入宫颈癌阳性肿瘤组织切片，进而观察实施例与对比例的拉曼光谱图。

利用共焦拉曼光谱仪检测实施例1-4的拉曼光谱，所得光谱如图1-4所示，根据峰值可看到，拉曼试剂和拉曼表面增强剂通过抗原抗体导入肿瘤组织优于拉曼探针导入，具有信号强，特异性高的特点。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。