一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物、探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及恙虫病东方体的分子生物学检测领域，特别是一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

恙虫病又称为丛林斑疹伤寒，是由恙虫病东方体(Ot)经恙螨幼虫叮咬传播的一种人兽共患传染病。恙虫病患者主要临床表现发热、皮疹、焦痂或溃疡、头痛、肌肉酸痛、淋巴结肿大等。研究报道全世界每年大约有100万人感染恙虫病，近10亿人处于感染恙虫病威胁之中。2006-2016年，中国恙虫病的发病人数和发病率逐年升高，多发生于我国南方地区。恙虫病与其他发热性疾病症状和体征相似，常常被误诊，病程耽误，最终引发其他并发症如急性呼吸窘迫综合征及肾衰竭，危及患者生命安全。

目前恙虫病实验室诊断方法主要包括病原分离培养，血清免疫学检测和分子生物学检测方法。病原分离培养是恙虫病临床诊断的金标准。主要是将恙虫病患者的血液通过腹腔注射老鼠，一般7-9天后发病。病原分离培养检测准确，但其检测所需时间长、需专业的操作人员进行腹腔注射和大量的小鼠以及标准饲养环境；血清学检查方法主要针对恙虫病患者血液中抗体进行测试，具有检测延迟性的缺点。同时抗体的出现具有一段“空窗期”；分子生物学检查主要是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)及其延伸相关检测方法。PCR检测虽然灵敏，但是其检测成本较高、需要特定设备、专业的技术人员等缺陷，限制其广泛的实际应用。建立一种快速、灵敏及适合现场应用的恙虫病的检测方法意义非凡。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物、探针及试剂盒，检测时间短、不需要大型昂贵的仪器及变温系统、在37℃、30分钟可完成核酸扩增、易于现场快速核酸检测及推广。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物，所述引物筛选自Ot1序列，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有SEQ ID NO.1序列特征，所述下游引物具有SEQID NO.2序列特征：

SEQ ID NO.1(7-38)：5′-AGATATATAGTGATATAAAGCCATTCGCTGAT-3′

SEQ ID NO.2(135-103)：5′-CTTCCAATAGATCGTTTAATTCTTGCATTTTAT-3′。

一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增探针，所述探针筛选自Ot1序列，所述探针具有SEQ ID NO.3序列特征，所述SEQ ID NO.3序列为：

SEQ ID NO.3：5′-AGCTGGTATTGATGTTCCTGATACTAGTT/iFAMdT/G/idSp/C/

iBHQ1dT/AATAGTGCATCTG-C3spacer-3′

所述SEQ ID NO.3序列的第30位碱基T通过荧光染料修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第34位碱基T通过荧光淬灭基团修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第32位碱基为核酸类似物，所述SEQ ID NO.3序列的3′最后一个碱基采用阻断延伸基团修饰。

进一步，所述荧光染料为FAM、FITC、CY3、CY5、CY5.5、ROX、HEX、SYBR、JOE、VIC或TAMRA中的一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1或BHQ2或BHQ3中的一种，所述核酸类似物为四氢呋喃，所述阻断延伸基团为C3spacer或其他如磷酸基团阻断基团。

一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针；

所述引物筛选自Ot1序列，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有SEQ ID NO.1序列特征，所述下游引物具有SEQ ID NO.2序列特征：

SEQ ID NO.1(7-38)：5′-AGATATATAGTGATATAAAGCCATTCGCTGAT-3′

SEQ ID NO.2(135-103)：5′-CTTCCAATAGATCGTTTAATTCTTGCATTTTAT-3′

所述探针筛选自Ot1序列，所述探针具有SEQ ID NO.3序列特征，所述SEQ ID NO.3序列为：

SEQ ID NO.3：5′-AGCTGGTATTGATGTTCCTGATACTAGTT/iFAMdT/G/idSp/C/

iBHQ1dT/AATAGTGCATCTG-C3spacer-3′

所述SEQ ID NO.3序列的第30位碱基T通过荧光染料修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第34位碱基T通过荧光淬灭基团修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第32位碱基为核酸类似物，所述SEQ ID NO.3序列的3′最后一个碱基采用阻断延伸基团修饰。

进一步，所述试剂盒还包括冻干酶粉以及激活剂。

进一步，所述冻干酶粉包括重组酶、聚合酶、核酸酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及盐离子。

进一步，所述引物以及探针的体积份数分别为：

引物 1.1-3.5体积份数；

探针 0.9-1.5体积份数。

进一步，所述引物的体积份数为2.8体积份数，所述探针的体积份数为1.2体积份数。

进一步，所述引物中上游引物和下游引物浓度均为10μmol/L；所述探针的浓度为5μmol/L。

应用一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

S1：处理模板；

S2：将模板、冻干酶粉、引物、探针、超纯水以及激活剂进行处理并在35-41℃下反应20-40分钟。

进一步，所述步骤S2中引物以及探针的体积份数分别为：

引物 1.1-3.5体积份数；

探针 0.9-1.5体积份数。

进一步，所述引物的体积份数为2.8体积份数，所述探针的体积份数为1.2体积份数。

进一步，所述引物中上游引物和下游引物浓度均为10μmol/L；所述探针的浓度为5μmol/L。

本发明的有益效果是：

近些年来，等温核酸扩增技术得到了快速发展，被誉为是可替代PCR的核酸检测技术。苏州先达基因科技有限公司开发的酶促重组等温扩增(Enzymatic RecombinaseAmplification，ERA)基于重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，模拟体内DNA复制，对DNA模板进行扩增，反应温度不需要变温系统，37-43℃可进行扩增。该检测技术对实验硬件要求很低，且扩增时间短，样本处理简单，非常适合病原快速检测方面。

本发明提供用于恙虫病东方体的专一性引物和探针，以及一种能特异、快速和灵敏的检测恙虫病东方体的检测试剂盒。引物和探针特异性强、敏感性高；检测时间短、不需要大型昂贵的仪器及变温系统、在37℃、30分钟可完成核酸扩增、易于现场快速核酸检测及推广。

附图说明

图1为恙虫病东方体基于重组酶聚合酶扩增(RPA)荧光核酸检测方法，不同引物浓度检测结果：1、2和3代表添加引物(10μM/L)体积为1.1，2.1和2.8μL，加样模板质粒(1.0×10

图2为恙虫病东方体基于重组酶聚合酶扩增(RPA)荧光核酸检测方法，不同探针浓度检测结果：1、2和3代表添加探针(5μM/L)的体积为1.5，1.2和0.9μL，加样模板质粒(1.0×10

图3为恙虫病东方体基于重组酶聚合酶扩增(RPA)荧光核酸检测方法灵敏度测试结果10

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

下述所涉及的实施方案如若无特殊指明，均为常规方法。

下述实施例中涉及分子生物学实验方法均按照Sambrook等人所编《分子克隆实验指南》实验方法进行，或者参照涉及的试剂盒说明书进行。

下述实施方案所涉及的材料、试剂等，若无特殊说明，可从商业途径获取。

实施例一：

一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物，所述引物筛选自Ot1序列，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有SEQ ID NO.1序列特征，所述下游引物具有SEQID NO.2序列特征：

SEQ ID NO.1(7-38)：5′-AGATATATAGTGATATAAAGCCATTCGCTGAT-3′

SEQ ID NO.2(135-103)：5′-CTTCCAATAGATCGTTTAATTCTTGCATTTTAT-3′

引物的长度为30bp以上。

一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增探针，所述探针筛选自Ot1序列，所述探针具有SEQ ID NO.3序列特征，所述SEQ ID NO.3序列为：

SEQ ID NO.3：5′-AGCTGGTATTGATGTTCCTGATACTAGTT/iFAMdT/G/idSp/C/

iBHQ1dT/AATAGTGCATCTG-C3spacer-3′

所述SEQ ID NO.3序列的第30位碱基T通过荧光染料修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第34位碱基T通过荧光淬灭基团修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第32位碱基为核酸类似物，所述SEQ ID NO.3序列的3′最后一个碱基采用阻断延伸基团修饰，阻止DNA聚合酶延伸。

SEQ ID NO.3序列中，iFAMdT表示荧光素染料FAM(6-Carboxyfluorescein)修饰的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；idSp表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)核酸类似物；iBHQ1dT代表荧光淬灭基团BHQ 1(black hole quencher 1)修饰的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；C3spacer代表聚合酶延伸阻断基团。

所述探针包括5’端序列、荧光染料、idSp、荧光染料相应淬灭基团、3’端序列及阻断延伸基团。

所述荧光染料为FAM、FITC、CY3、CY5、CY5.5、ROX、HEX、SYBR、JOE、VIC或TAMRA中的一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1或BHQ2或BHQ3中的一种，所述核酸类似物为四氢呋喃(THF或idSp)，所述阻断延伸基团为C3spacer或其他如磷酸基团阻断基团。

探针长度为47个碱基。

FAM代表羧基荧光素，FITC代表异硫氰酸荧光素，BHQ1代表黑洞淬灭剂1(BlackHole Quencher 1)，C3spacer为3个-CH

所述探针的长度为47bp，其中5’端31bp，中间(第32位)为idSp、3’端15bp。

引物和探针的序列见表1。

表1筛选得到的引物和探针序列

针对恙虫病东方体的特异保守区域为扩增靶标区域，设计特异性扩增引物及RPA荧光探针，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

恙虫病东方体荧光等温扩增引物和探针是根据恙虫病东方体外膜蛋白Sta56保守序列设计的，恙虫病东方体外膜蛋白Sta56基因保守序列具有Ot1序列，Ot1序列(SEQ IDNO.4)如下，其中黑色加粗为引物序列，下划线部分为探针序列：

引物针对恙虫病东方体常见保守基因，具体为保守性强的外膜蛋白Sta56作为试剂盒扩增靶标，将其构建至载体puc57中，制备成恙虫病东方体的阳性质粒，质粒由南京金唯智生物科技有限公司合成。

一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针；

所述引物筛选自Ot1序列，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有SEQ ID NO.1序列特征，所述下游引物具有SEQ ID NO.2序列特征：

SEQ ID NO.1(7-38)：5′-AGATATATAGTGATATAAAGCCATTCGCTGAT-3′

SEQ ID NO.2(135-103)：5′-CTTCCAATAGATCGTTTAATTCTTGCATTTTAT-3′

所述探针筛选自Ot1序列，所述探针具有SEQ ID NO.3序列特征，所述SEQ ID NO.3序列为：

SEQ ID NO.3：5′-AGCTGGTATTGATGTTCCTGATACTAGTT/iFAMdT/G/idSp/C/

iBHQ1dT/AATAGTGCATCTG-C3spacer-3′

所述SEQ ID NO.3序列的第30位碱基T通过荧光染料修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第34位碱基T通过荧光淬灭基团修饰，所述SEQ ID NO.3序列的第32位碱基为核酸类似物，所述SEQ ID NO.3序列的3′最后一个碱基采用阻断延伸基团修饰。

所述试剂盒还包括冻干酶粉以及激活剂。

所述冻干酶粉包括重组酶、聚合酶、核酸酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及盐离子。

实施例二：

应用实施例一的一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

S1：处理模板：用TE缓冲液将质粒稀释至100μM/L按质粒拷贝数计算公式，稀释到1.0×10

质粒为恙虫病东方体的阳性质粒，其获得方式为：从NCBI网址获得恙虫病东方体Sta56基因保守区域，选取Sta56部分区域作为靶标扩增区段，将其构建于载体puc57-Amp中，制备成恙虫病东方体的阳性质粒质控品，质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

考虑实验室生物安全，病原微生物的核酸提取没有开展相关实验。

S2：将模板、溶解剂、冻干酶粉、引物、探针、超纯水以及激活剂进行处理并在35-41℃下反应20-40分钟。

所述步骤S2中模板、溶解剂、冻干酶粉、引物、探针、超纯水以及激活剂的体积份数分别为：

所述引物中上游引物和下游引物浓度均为10μmol/L；所述探针的浓度为5μmol/L。

本实施例中采用50μL反应体系，具体包括

0.2mL的反应管内加入：模板的加样量2μL；先达基因荧光型核酸扩增冻干酶粉20μL；上游引物和下游引物浓度均为10μmol/L，上样量2.8μL；荧光探针的浓度为5μmol/L，上样量1.2μL；超纯水22μL；然后加入2μL的激活剂加到反应管盖子上；反应管内还加入20μL溶解剂。

之后进行顺离，充分混匀，再离心，在金属浴37℃恒温扩增反应30min。

具体地，顺离时2000rpm/min顺离15s，通过震荡充分混匀。

通过苏州先达基因科技有限公司的GS8荧光恒温扩增仪或其他可以收集荧光信号的PCR仪或其他等温荧光扩增仪检测收集信号。

本实施例具体操作参照苏州先达基因科技有限公司荧光型核酸扩增试剂盒。

实施例三

应用实施例一的一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

S1：处理模板：用TE缓冲液将质粒稀释至100μM/L按质粒拷贝数计算公式，稀释到1.0×10

S2：将模板、溶解剂、冻干酶粉(冻干酶粉本身就在反应管内)、引物、探针、超纯水以及激活剂进行处理并在35-41℃下反应20-40分钟。

本实施例中应用RPA荧光检测体系扩增恙虫病东方体特异序列，各试剂加入体积如表2：

表2实施例三的试剂表

充分震荡和2000rpm/min短暂离心15s后，打开反应管，在反应管盖上加入2μL激活剂，2000rpm/min短暂离心15s，充分震荡，2000rpm/min短暂离心15s。

将上述反应管放置于荧光恒温扩增仪GS8(苏州先达基因科技有限公司)，扩增条件为37℃30分钟。扩增时阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效。

结果判定标准：荧光检测仪器在30分钟明显检测到FAM荧光扩增信号，且有明显的“S”型增趋势，判定为阳性；荧光检测仪器在30分钟内，FAM荧光信号无增加，无扩增趋势，基本为比较平缓直线，判定为阴性。

结果判定：

阴性对照：FAM通道无扩增曲线，基本为平滑直线；

阳性对照：FAM通道有明显S型扩增曲线。

实施例四：

应用实施例一的一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒的检测方法，本实施例采用3组实验：

检测方法包括以下步骤：

S1：处理模板：用TE缓冲液将质粒稀释至100μM/L按质粒拷贝数计算公式，稀释到10

S2：将模板、溶解剂、冻干酶粉(冻干酶粉本身就在反应管内)、引物、探针、超纯水以及激活剂进行处理并在35-41℃下反应20-40分钟。

本实施例中应用RPA荧光检测体系扩增恙虫病东方体特异序列，各试剂加入体积如表3：

表3实施例四的试剂表

3组实验中引物，即Ot-F1和Ot-R1混合液(10μM/L)分别加入2.8μL、2.1μL、1.1μL，其余不足最终反应体积(即体积和)的以超纯水补齐。

充分震荡和2000rpm/min短暂离心15s后，打开反应管，在反应管盖上加入2μL激活剂，2000rpm/min短暂离心15s，充分震荡，2000rpm/min短暂离心15s。

将上述反应管放置于荧光恒温扩增仪GS8(苏州先达基因科技有限公司)，扩增条件为37℃30分钟。扩增时阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效。

结果如图1显示，引物混合液的加入量为2.8μL有更好的扩增效果。

实施例五

应用实施例一的一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒的检测方法，本实施例采用3组实验：

检测方法包括以下步骤：

S1：处理模板：用TE缓冲液将质粒稀释至100μM/L按质粒拷贝数计算公式，稀释到10

S2：将模板、溶解剂、冻干酶粉(冻干酶粉本身就在反应管内)、引物、探针、超纯水以及激活剂进行处理并在35-41℃下反应20-40分钟。

本实施例中应用RPA荧光检测体系扩增恙虫病东方体特异序列，各试剂加入体积如表4：

表4实施例五的试剂表

3组实验中探针(5μM/L)的体积分别为0.9μL,1.2μL和1.5μL，其余不足最终反应体积(即体积和)的以超纯水补齐。

充分震荡和2000rpm/min短暂离心15s后，打开反应管，在反应管盖上加入2μL激活剂，2000rpm/min短暂离心15s，充分震荡，2000rpm/min短暂离心15s。

将上述反应管放置于荧光恒温扩增仪GS8(苏州先达基因科技有限公司)，扩增条件为37℃30分钟。扩增时阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效。

结果如图2显示，探针加入量为1.2μL有更好的扩增效果。

实施例六

应用实施例一的一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增试剂盒的检测方法，本实施例采用几组实验(针对质粒的稀释浓度)：

检测方法包括以下步骤：

S1：处理模板：用TE缓冲液将质粒稀释至100μM/L按质粒拷贝数计算公式，稀释到1.0×10

S2：将模板、溶解剂、冻干酶粉(冻干酶粉本身就在反应管内)、引物、探针、超纯水以及激活剂进行处理并在35-41℃下反应20-40分钟。

本实施例中应用RPA荧光检测体系扩增恙虫病东方体特异序列，各试剂加入体积如表5：

表5实施例六的试剂表

充分震荡和2000rpm/min短暂离心15s后，打开反应管，在反应管盖上加入2μL激活剂，2000rpm/min短暂离心15s，充分震荡，2000rpm/min短暂离心15s。

将上述反应管放置于荧光恒温扩增仪GS8(苏州先达基因科技有限公司)，扩增条件为37℃30分钟。扩增时阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效。

结果如图3显示，本试剂盒的最低检出限可达到10copies/μL。

该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×10

图3中10

本发明为一种恙虫病东方体核酸荧光等温检测试剂盒(ERA检测体系)，提供用于恙虫病东方体的专一性引物和探针，以及一种能特异、快速和灵敏的检测恙虫病东方体的检测试剂盒。

本发明涉恙虫病东方体基于重组酶聚合酶扩增(RPA)荧光核酸检测方法，特别涉及核酸荧光检测引物和探针，检测靶标为海南省恙虫病东方体Karp株外膜蛋白Sta56，其中涉及基因保守序列Ot1、扩增引物Ot-F1、Ot-R1、扩增探针Ot-P。引物和探针特异性强、敏感性高；该检测技术可作为恙虫病感染的辅助诊断，具有检测时间短、不需要大型昂贵的仪器及变温系统、在37℃、30分钟可完成核酸扩增、易于现场快速核酸检测及推广。

本发明是一种荧光检测恙虫病东方体核酸等温扩增体系，大大缩短恙虫病东方体检测时间，反应条件为37℃，30min，整个检测过程可在1小时内完成，与实时荧光定量PCR的数小时扩增相比，大大缩短时间。

本发明是一种荧光检测恙虫病东方体核酸等温扩增体系，相对于荧光定量PCR的50-95℃变温体系和其它等温核酸扩展的60℃左右，该发明只需要恒温37℃即可完成实验，该温度容易获取且不需要昂贵仪器的变温系统。

本发明一种荧光检测恙虫病东方体核酸等温扩增体系，操作简单，也有小型便携扩增设备；扩增所需的酶及其它产品都可冻干保存，扩增时只需要加入酶扩增缓冲液、模板、引物、探针、水及镁离子激活剂。

本发明是一种荧光检测恙虫病东方体核酸等温扩增体系，灵敏度高、特异性好。可用于野外现场或床旁检测，应用市场潜力巨大。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南医学院

<120> 一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物、探针及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatatatag tgatataaag ccattcgctg at 32

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttccaatag atcgtttaat tcttgcattt tat 33

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctggtatt gatgttcctg atactagttt gctaatagtg catctg 46

<210> 4

<211> 634

<212> DNA

<213> Orientia tsutsugamushi

<400> 4

ttactcagat atatagtgat ataaagccat tcgctgatat agctggtatt gatgttcctg 60

atactagttt gcctaatagt gcatctgtcg aacagataca gaataaaatg caagaattaa 120

acgatctatt ggaagagctc agagaatctt ttgatgggta tcttggtggt aatgcttttg 180

ctaatcagat acagttgaat tttgtcatgc cgcagcaagc acagcagcag gggcaagggc 240

agcaacagca agctcaagct acagcgcaag aagcagtagc agcagcagct gttaggcttt 300

taaatggcaa tgatcagatt gcgcagttat ataaagatct tgttaaattg cagcgtcatg 360

caggaattaa gaaagcgatg gaaaaattag ctgcccaaca agaagaagat gcaaagaatc 420

aaggtgaagg tgactgcaag cagcaacaag gaacatctga aaaatctaaa aaaggaaaag 480

acaaagaggc agagtttgat ctgagtatga ttgtcggcca agttaaactc tatgctgacg 540

taatgataac tgaatcagtc tcaatatatg ctggtgttgg tgcagggtta gcttatactt 600

ctggaaaaat agataataag gatattaaag ggca 634