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用于O-连接的糖基化的修饰的载体蛋白

文献发布时间：2023-06-19 12:07:15

对序列表的引用

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发明领域

本发明的领域总体涉及包含一个或多个GlycoTag的修饰的载体蛋白以及此类修饰的载体蛋白在例如使用PglL的有效O-连接的糖基化中的用途。

发明背景

蛋白糖基化是细菌中常见的翻译后修饰，通过该修饰，聚糖共价附接至表面蛋白例如鞭毛或菌毛。[1]。糖蛋白在粘附、蛋白针对蛋白水解的稳定以及逃避宿主免疫应答中发挥作用。[1]。两种蛋白糖基化机制的区别在于其中聚糖转移至蛋白的模式：一种机制涉及将碳水化合物直接从核苷酸-活化的糖转移至受体蛋白(用于例如，真核细胞的高尔基体中的蛋白O-糖基化和一些细菌中的鞭毛蛋白O-糖基化)。第二种机制涉及将多糖预组装至脂质-载体上(通过糖基转移酶)，其然后通过寡糖基转移酶(OTase)转移至蛋白受体。[1]。该第二种机制用于例如真核细胞的内质网中的N-糖基化，充分表征的空肠弯曲杆菌的N-连接的糖基化系统，以及更近来表征的脑膜炎奈瑟氏菌、淋球奈瑟氏菌和铜绿假单胞菌的O-糖基化系统。[1]。对于O-连接的糖基化(O-糖基化)，通常将聚糖附接至蛋白受体上的丝氨酸或苏氨酸残基。对于N-连接的糖基化(N-糖基化)，通常将聚糖附接至蛋白受体上的天冬酰胺残基。通常参见[2]。

两种最佳理解的糖基化系统是空肠弯曲杆菌N-连接的糖基化系统和奈瑟氏菌O-连接的糖基化系统。[1]，[3]。在这两种系统中，与十一异戊烯基焦磷酸酯(UndPP)脂质-载体连接的多糖(聚糖供体)通过翻转酶转移(翻转)至周质。[2]，[3]。在周质中，寡糖基转移酶(OTase)将聚糖转移至蛋白受体(菌毛蛋白)。[2]，[3]。空肠弯曲杆菌的OTase (PglB)将聚糖转移至保守的菌毛蛋白五肽基序D/E-X

缀合物疫苗(包含与免疫原性聚糖共价连接的载体蛋白)已经成为针对各种细菌感染进行疫苗接种的成功方法。然而，常规生产它们的化学方法复杂且相对低效(图1中的[4])。为了增加缀合物疫苗生产效率，已经开发了体内方法(因此为“生物缀合物疫苗”)。这些体内方法利用了上面讨论的N-糖基化和O-糖基化系统，特别是OTase序列子，使得未以其他方式被OTase糖基化的蛋白(载体蛋白)在体内被糖基化。

例如，使用作为聚糖供体的异源多糖和空肠弯曲菌PglB，使载体蛋白AcrA和EPA在大肠杆菌中被N-糖基化，因为首先将AcrA和EPA修饰以并入适当的周质信号序列和至少一个拷贝的PglB序列子序列D/E-X

为了克服基于PglB的系统的这种限制，并且由于奈瑟氏菌PglL相对于糖底物是“混杂的”([3])，使用来自脑膜炎奈瑟氏菌的PglL OTase的O-糖基化系统一直是近期工作的焦点。([1]，[14]，[15]，[16]；还参见[6])。

例如，使用对于弗氏志贺氏菌宿主细胞是内源的多糖(“内源性多糖”)作为聚糖供体，通过脑膜炎奈瑟氏菌PglL使载体蛋白EPA、TTc和CTB在弗氏志贺氏菌中被O-糖基化，因为每种载体蛋白被修饰以并入周质信号序列和一个拷贝的脑膜炎奈瑟氏菌PilE序列子序列(N)-SAVTEYYLNHGEWPGNNTSAGVATSSEIK-(C) (SEQ ID NO:140) (EPA和TTc在其N-末端修饰，CTB在C-末端修饰)。[3]。使用

但是，像其前体一样，该

需要一系列的PglL OTase和菌毛蛋白序列子，其可以是最佳配对的，用于各种载体蛋白、特别是EPA和在内部糖基化位点处进行有效的O-糖基化。

在一个方面，本发明首次描述某些菌毛蛋白序列和包含它们的修饰载体蛋白，任选地，其中菌毛蛋白序列被来自

本发明的实施方案包括但不限于：

1. 修饰的载体蛋白，其含有包含至少一个GlycoTag的载体蛋白，其中所述至少一个GlycoTag是淋病奈瑟氏菌PglL GlycoTag (

2. 实施方案1的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个GlycoTag位于所述载体蛋白的N-末端、C-末端和/或内部。

3. 实施方案1或2的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

4. 实施方案1、2或3的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

5. 实施方案4的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

6. 实施方案1、2或3的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

7. 实施方案6的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

8. 实施方案3的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:101、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133之一的氨基酸序列。

9. 实施方案1或2的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

10.实施方案9的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

11. 实施方案9或10的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

12. 实施方案9的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:103。

13. 实施方案1或2的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

14. 实施方案13的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

15. 实施方案13或14的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

16. 实施方案13的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

17. 实施方案1至16中任一项的修饰的载体蛋白，其进一步包含至少一种脑膜炎奈瑟氏菌PglL GlycoTag (NmGlycoTag)。

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:111。

18. 修饰的载体蛋白，其含有包含至少一个GlycoTag的载体蛋白，其中所述至少一个GlycoTag是脑膜炎奈瑟氏菌PglL GlycoTag (

19. 实施方案18的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

20. 实施方案18或19的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

21. 实施方案18的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

- 提供了某些实施方案，条件是所述

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ IDNO:51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202和204。

22. 实施方案1-21中任一项的修饰的载体蛋白，其中所述载体蛋白选自霍乱毒素b亚基(CTB)、破伤风类毒素(TT)、破伤风毒素C片段(TTc)、白喉类毒素(DT)、CRM197、铜绿假单胞菌外毒素A (EPA)、空肠弯曲杆菌吖啶黄抗性蛋白A (CjAcrA)、大肠杆菌吖啶黄抗性蛋白A (EcAcrA)和铜绿假单胞菌PcrV (PcrV)。

23. 实施方案1-22中任一项的修饰的载体蛋白，其中所述载体蛋白是EPA。

24. 实施方案23的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个GlycoTag位于关于SEQ IDNO:1编号的残基A14、D36、Q92、G123、E157、A177、Y208、N231、E252、R274、A301、Q307、A365、S408、T418、A464、A519、G525、A533、S585、K240或A375或其组合处。在一个实施方案中，残基A14、D36、Q92、G123、E157、A177、Y208、N231、E252、R274、A301、Q307、A365、S408、T418、A464、A519、G525、A533、S585、K240或A375或其组合被至少一个GlycoTag取代。

25. 修饰的载体蛋白，其特征在于包含至少一个脑膜炎奈瑟氏菌PglL GlycoTag(NmGlycoTag)的铜绿假单胞菌外毒素A (EPA)载体蛋白，其中所述至少一个

26. 实施方案25的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个NmGlycoTag由12至29个氨基酸长的肽序列组成，并且在其中包含序列SEQ ID NO:142。

27. 实施方案25或26的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个NmGlycoTag由29个氨基酸长的肽序列组成，并且在其中包含序列SEQ ID NO:142。

28. 实施方案25、26或27的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个NmGlycoTag由作为SEQ ID NO:140的肽序列组成。

29. 实施方案25或26的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个NmGlycoTag由19个氨基酸长的肽序列组成，并且在其中包含序列SEQ ID NO:142。

30. 实施方案25-29中任一项的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个NmGlycoTag由作为SEQ ID NO:141的肽序列组成。

31. 实施方案25或26的修饰的载体蛋白，其中所述至少一个

32. 实施方案25的修饰的载体蛋白，其包含位于所述载体蛋白的N-末端、C-末端和/或内部的至少第二GlycoTag。

33. 实施方案32的修饰的载体蛋白，其包含两个或更多个GlycoTag，且其中至少第二GlycoTag是

- 提供了某些实施方案，条件是所述

34. 实施方案1-33之一的修饰的载体蛋白，其进一步包含一个或多个GlycoTag-侧接肽(G-f肽)。

35. 实施方案1-34之一的修饰的载体蛋白，其中所述一个或多个G-f肽位于GlycoTag的N-末端、C-末端或其组合处。

36. 实施方案1-34之一的修饰的载体蛋白，其中所述一个或多个G-f肽与GlycoTag相邻。

- 实施方案1-36中任一项的修饰的载体蛋白，其中所述修饰的载体蛋白偶联至(任选地共价偶联至)在所述GlycoTag中的一个或多个处的聚糖。

- 上述的修饰的载体蛋白，其中所述聚糖是PglL聚糖底物。

- 上述的修饰的载体蛋白，其中所述聚糖具有以下的还原末端结构：

(i) 葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构；

(ii) DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖或葡萄糖的还原末端结构；

(iii) GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构；或

(iv) 半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构。

- 上述的修饰的载体蛋白，其中所述聚糖是

志贺氏菌聚糖(例如宋内志贺氏菌聚糖(诸如宋内志贺氏菌O-抗原)，或弗氏志贺氏菌聚糖(诸如弗氏志贺氏菌2a CPS)，或痢疾志贺氏菌聚糖)

或链球菌聚糖(例如肺炎链球菌(诸如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种23A CPS，肺炎链球菌物种33F CPS，或肺炎链球菌物种22A CPS)。

- 上述的修饰的载体蛋白，其中(a) 所述聚糖是

志贺氏菌聚糖(例如宋内志贺氏菌聚糖(诸如宋内志贺氏菌O-抗原)，或弗氏志贺氏菌聚糖(诸如弗氏志贺氏菌2a CPS)，或痢疾志贺氏菌聚糖)

或链球菌聚糖(例如肺炎链球菌(诸如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种23A CPS，肺炎链球菌物种33F CPS，或肺炎链球菌物种22A CPS)；且

(b) 所述聚糖具有以下的还原末端结构：

(i) 葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构；

(ii) DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖或葡萄糖的还原末端结构；

(iii) GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构；或

- 上述的修饰的载体蛋白，其中(a)所述聚糖是链球菌聚糖(例如肺炎链球菌(诸如肺炎链球菌物种8 CPS，肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种22A CPS，肺炎链球菌物种23A CPS，或肺炎链球菌物种33F CPS)；且(b)所述聚糖具有葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖、N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺、半乳糖-β1,4-葡萄糖、鼠李糖-β1,4-葡萄糖或呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖的S-2至S-1还原末端结构。

37. 核酸分子，其包含编码上述实施方案中任一项或实施方案1-36中任一项的修饰的载体蛋白的核苷酸序列。

38. 实施方案37的核酸分子，其中所述核苷酸序列经密码子优化用于在奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞中表达。

39. 载体，其包含实施方案37或38的核酸分子，且其中所述修饰的载体蛋白核苷酸序列可操作连接至编码周质信号序列的多核苷酸序列。

40. 实施方案39的载体，其进一步包含核酸分子，所述核酸分子包含编码脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

- 在某些实施方案中，所述载体是表达载体。

- 在某些实施方案中，所述载体进一步包含核酸分子，所述核酸分子包含编码以下的核苷酸序列：脑膜炎奈瑟氏菌PglL，淋病奈瑟氏菌PglL，乳糖奈瑟氏菌020-06 PglL，乳糖奈瑟氏菌ATCC 23970 PglL，淋病奈瑟氏菌F62 PglL，灰色奈瑟氏菌ATCC 14685 PglL，粘液奈瑟氏菌PglL，浅黄奈瑟氏菌NRL30031/H210 PglL，粘液奈瑟氏菌ATCC 25996 PglL，奈瑟氏菌属物种口腔分类单元014菌株F0314 PglL，

- 在某些实施方案中，所述载体进一步包含核酸分子，所述核酸分子包含以下之一的核苷酸序列：SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48。

- 在某些实施方案中，所述载体进一步包含核酸分子，所述核酸分子包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49。

41. 革兰氏阴性细菌宿主细胞，其包含实施方案39或40的载体。

42. 实施方案41的宿主细胞，其为奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、埃希氏菌、假单胞菌或耶尔森氏菌细胞。

43. 革兰氏阴性细菌细胞，其包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子编码

(a) PglL聚糖底物；

(b) 能够将PglL聚糖底物组装至脂质载体上的糖基转移酶；

(d) PglL Otase。

44. 实施方案43的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细胞在核DNA中包含一个或多个核酸分子。

45. 实施方案43或44的革兰氏阴性细菌细胞，其为奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、埃希氏菌、假单胞菌或耶尔森氏菌细胞。

46. 实施方案43、44或45的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述PglL OTase是内源性PglL同源物。

47. 实施方案43、44或45的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述PglL OTase与所述细胞是异源的，并且与对照相比，所述细胞的内源性PglL同源物减少。

48. 革兰氏阴性细菌细胞，其在周质中包含：

(a) 脂质-载体-连接的PglL聚糖底物，

(b) 如实施方案1-36中任一项中的修饰的载体蛋白，和

49. 实施方案48的革兰氏阴性细菌细胞，其为奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、埃希氏菌、假单胞菌或耶尔森氏菌细胞。

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物对于奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞是内源的。

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构。在进一步实施方案中，所述脂质-连接的PglL聚糖底物具有DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖或葡萄糖的还原末端结构。在进一步实施方案中，所述脂质-连接的PglL聚糖底物具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原，例如宋内志贺氏菌O-抗原，弗氏志贺氏菌聚糖抗原，例如弗氏志贺氏菌2a CPS，痢疾志贺氏菌聚糖抗原，肺炎链球菌聚糖抗原，例如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8 CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种15A CPS，肺炎链球菌物种33F CPS或肺炎链球菌物种22A CPS。

- 在某些实施方案中，所述PglL OTase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL，淋病奈瑟氏菌PglL，乳糖奈瑟氏菌020-06 PglL，乳糖奈瑟氏菌ATCC 23970 PglL，淋病奈瑟氏菌F62PglL，灰色奈瑟氏菌ATCC 14685 PglL，粘液奈瑟氏菌PglL，浅黄奈瑟氏菌NRL30031/H210PglL，粘液奈瑟氏菌ATCC 25996 PglL，奈瑟氏菌属物种口腔分类单元014菌株F0314 PglL，

- 在某些实施方案中，所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:51、53和55之一的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-岩藻糖胺(FucNAc)的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、53或55。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的S-2至S-1还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、53或55。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:134或135的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GalNAc、FucNAc或GlcNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronicacid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构的志贺氏菌(例如，宋内志贺氏菌或弗氏志贺氏菌)或链球菌(例如，肺炎链球菌)抗原，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原，弗氏志贺氏菌2a CPS，或肺炎链球菌物种12F CPS。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构；且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原(例如宋内志贺氏菌O-抗原)，弗氏志贺氏菌聚糖抗原(例如弗氏志贺氏菌2aCPS)，痢疾志贺氏菌聚糖抗原，肺炎链球菌聚糖抗原(例如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8 CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种15A CPS，或肺炎链球菌物种33FCPS)。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-岩藻糖胺(FucNAc)的还原末端结构，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-岩藻糖胺(FucNAc)的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、108、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204。在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、108、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204，且所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:101、103、105、107、109和111。在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQID NO:101的氨基酸序列，且所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:101、113、115、117、121、123、125、127、129、131和133。在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:101、113、115、117、121、123、125、127、129、131和133，且所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

50. 组合物，其包含：

(a) PglL聚糖底物，

(b) 如实施方案1-36中任一项中的修饰的载体蛋白，和

51. 缀合物，其包含实施方案1-36中任一项的修饰的载体蛋白和一种或多种其他分子。

52. 实施方案51的缀合物，其中所述一种或多种其他分子是聚糖，并且各自共价附接至GlycoTag的丝氨酸或苏氨酸残基。

53. 实施方案52的缀合物，其中所述一种或多种聚糖对于奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞是内源的。

54. 实施方案52或53的缀合物，其中所述一种或多种聚糖各自具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构。

55. 组合物，其包含实施方案51-54中任一项的缀合物。

- 在某些实施方案中，所述聚糖对于奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞是内源的。

- 在某些实施方案中，所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:51、53和55之一的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、53或55。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的S-2至S-1还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、53或55。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglLOtase是

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:134或135的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GalNAc、FucNAc或GlcNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronicacid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构的志贺氏菌(例如，宋内志贺氏菌或弗氏志贺氏菌)或链球菌(例如，肺炎链球菌)抗原，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原，弗氏志贺氏菌2aCPS，或肺炎链球菌物种12F CPS。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原(例如宋内志贺氏菌O-抗原)，弗氏志贺氏菌聚糖抗原(例如弗氏志贺氏菌2a CPS)，痢疾志贺氏菌聚糖抗原，或肺炎链球菌聚糖抗原(例如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8 CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种15ACPS，或肺炎链球菌物种33F CPS)，其具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL(

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的S-2至S-1还原末端。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204。在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204，且所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

56. 产生O-糖基化的修饰的载体蛋白的方法，其包括培养革兰氏阴性细菌宿主细胞，其中所述革兰氏阴性细菌宿主细胞：

(a) 产生脂质-载体-连接的PglL聚糖，

(b) 表达编码如实施方案1-36中任一项中的修饰的载体蛋白的核苷酸序列，其可操作连接至编码周质信号序列的多核苷酸序列，和

由此产生O-糖基化的修饰的载体蛋白。

- 产生O-糖基化的修饰的载体蛋白的方法，其包括培养革兰氏阴性细菌宿主细胞，其中所述革兰氏阴性细菌宿主细胞：

(a) 表达编码PglL聚糖的核苷酸序列，

(b) 表达一种或多种编码糖基转移酶的核苷酸序列，所述糖基转移酶能够组装脂质-载体-连接的PglL聚糖；

(d) 表达编码PglL OTase的核苷酸序列，

由此产生O-糖基化的修饰的载体蛋白。

57. 实施方案56的方法，其中所述PglL聚糖与对于奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞内源的聚糖基本上相同。

58. 实施方案56或57的方法，其中所述PglL聚糖的特征在于在还原末端具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse。

59. 实施方案56、57或58的方法，其中所述PglL聚糖对于所述宿主细胞是内源的。

60. 实施方案56、57、58或59的方法，其进一步包括从所述细胞分离O-糖基化的修饰的载体蛋白。

61. 组合物，其包含通过实施方案56-60之一的方法产生的O-糖基化的修饰的载体蛋白。

- 在某些实施方案中，所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:134或135的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GalNAc、FucNAc或GlcNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronicacid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构的志贺氏菌(例如，宋内志贺氏菌或弗氏志贺氏菌)或链球菌(例如，肺炎链球菌)抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原，弗氏志贺氏菌2a CPS，或肺炎链球菌物种12F CPS。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构；且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQID NO:51、199、202或204。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原(例如宋内志贺氏菌O-抗原)，弗氏志贺氏菌聚糖抗原(例如弗氏志贺氏菌2a CPS)，痢疾志贺氏菌聚糖抗原，肺炎链球菌聚糖抗原(例如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种15A CPS，或肺炎链球菌物种33F CPS)，其具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构；且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL(

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:101、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133。在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:101、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131和133，且所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

62. 产生O-糖基化的修饰的载体蛋白的方法，其包括培养革兰氏阴性细菌宿主细胞，其中所述革兰氏阴性细菌宿主细胞：

(a) 包含脂质-载体-连接的PglL聚糖底物，

(b) 在周质中包含修饰的载体蛋白，

所述修饰的载体蛋白的特征在于包含至少一个

63. 实施方案62的方法，其中所述脂质-载体-连接的PglL聚糖底物在还原末端包含葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse。

64. 实施方案62或63的方法，其中所述脂质-载体-连接的PglL聚糖底物对于所述宿主细胞是内源的。

65. 实施方案62-64之一的方法，其进一步包括从所述细胞分离O-糖基化的修饰的载体蛋白。

- 在某些实施方案中，所述方法包括从所述细胞的周质分离的O-糖基化的修饰的载体蛋白。

- 在某些实施方案中，所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:51、53和55之一的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、53或55。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的S-2至S-1还原末端结构。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:134或135的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GalNAc、FucNAc或GlcNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:134或135。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronicacid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是具有N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的还原末端结构的志贺氏菌或链球菌抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原，弗氏志贺氏菌2a CPS，或肺炎链球菌物种12F CPS。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构；且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构的志贺氏菌或链球菌抗原；且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原(例如宋内志贺氏菌O-抗原)，弗氏志贺氏菌聚糖抗原(例如弗氏志贺氏菌2a CPS)，痢疾志贺氏菌聚糖抗原，肺炎链球菌聚糖抗原(例如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8 CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种15A CPS，或肺炎链球菌物种33F CPS)。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL(

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的S-2至S-1还原末端结构。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204。在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204，且所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

66. 制备缀合物的方法，其包括在如实施方案1至36中任一项中的修饰的载体蛋白存在的情况下使PglL OTase和PglL聚糖底物接触；由此制备所述缀合物，然后任选地分离所述缀合物。

67. 实施方案66的方法，其中所述缀合物是生物缀合物，并且接触发生在革兰氏阴性细菌细胞的周质中。

68. 组合物，其包含通过实施方案66或67的方法产生的O-糖基化的修饰的载体蛋白。

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白的特征在于选自以下的载体蛋白：霍乱毒素b亚基(CTB)、破伤风类毒素(TT)、破伤风毒素C片段(TTc)、白喉类毒素(DT)、CRM197、铜绿假单胞菌外毒素A (EPA)、空肠弯曲杆菌吖啶黄抗性蛋白A (

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构。

- 在某些实施方案中，所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

- 在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有SEQ ID NO:51、53和55之一的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、53或55。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的S-2至S-1还原末端结构。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、199、202或204。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原(例如宋内志贺氏菌O-抗原)，弗氏志贺氏菌聚糖抗原(例如弗氏志贺氏菌2a CPS)，痢疾志贺氏菌聚糖抗原，肺炎链球菌聚糖抗原(例如肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8 CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种15A CPS，或肺炎链球菌物种33F CPS)。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL(

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个特定实施方案中，所述PglL聚糖底物具有FucNAc的还原末端结构，且所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的S-2至S-1还原末端结构。在一个进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原。在一个进一步实施方案中，所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204。在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO: 51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204，且所述PglL Otase是

- 在一个特定实施方案中，所述修饰的载体蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，且所述PglL Otase是脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

69. 免疫原性组合物，其包含共价附接至一种或多种免疫原性聚糖的如实施方案1至36中任一项中的修饰的载体蛋白。

- 免疫原性组合物，其包含共价附接至一种或多种免疫原性PglL聚糖底物的如实施方案1至36中任一项中的修饰的载体蛋白。

- 在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构。在进一步实施方案中，所述脂质-连接的PglL聚糖底物具有DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖或葡萄糖的还原末端结构。在进一步实施方案中，所述脂质-连接的PglL聚糖底物具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是志贺氏菌(例如，宋内志贺氏菌或弗氏志贺氏菌)或链球菌(例如，肺炎链球菌)抗原。在进一步实施方案中，所述PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌O-抗原，弗氏志贺氏菌2a CPS，肺炎链球菌物种12F CPS，肺炎链球菌物种8 CPS，肺炎链球菌物种14 CPS，肺炎链球菌物种15A CPS，肺炎链球菌物种33F CPS，肺炎链球菌物种22A CPS或弗氏志贺氏菌物种2a CPS。

70. 诱导哺乳动物中的抗体应答的方法，其包括向所述哺乳动物施用免疫有效量的实施方案69的免疫原性组合物。

71. 如实施方案69中的免疫原性组合物，其用于诱导哺乳动物中的抗体应答。

- 如实施方案69中的免疫原性组合物，其用于诱导哺乳动物中的免疫应答。

72. 实施方案69的免疫原性组合物用于诱导哺乳动物中的抗体应答的用途。

- 实施方案69的免疫原性组合物用于诱导哺乳动物中的免疫应答的用途。

73. 实施方案69的免疫原性组合物用于制备用于诱导哺乳动物中的抗体应答的药物的用途。

- 实施方案69的免疫原性组合物用于制备用于诱导哺乳动物中的免疫应答的药物的用途。

74. 如实施方案69中的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病。

- 实施方案74的免疫原性组合物，其中所述由肺炎链球菌感染引起的疾病是肺炎、侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)、慢性阻塞性肺病(COPD)的恶化、中耳炎、脑膜炎、菌血症、肺炎和/或结膜炎。

- 如实施方案69中的免疫原性组合物，其用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的免疫应答。

75.实施方案69的免疫原性组合物用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的抗体应答的用途。

- 实施方案69的免疫原性组合物用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的免疫应答的用途。

76. 实施方案69的免疫原性组合物用于制备用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的抗体应答的药物的用途。

- 实施方案69的免疫原性组合物用于制备用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的免疫应答的药物的用途。

图1 - 奈瑟氏菌O-连接的、寡糖基转移酶介导的糖基化途径的概览。改编自[2]的图3(b)。

图2 – 来自测定宋内志贺氏菌 O-抗原向rEPA1 (第#1和#4列)、rEPA2 (第#2列)和rEPA3 (第#3列)的

图3 - 在三种不同的温度(-80℃、2-8℃和室温(RT) 20-25℃)下，经六个月的时间研究rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原生物缀合物的稳定性。另外，对纯化的rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原进行五个冷冻/解冻循环(5 FT)。图3描绘了在零个月、两周、一个月、三个月和六个月时采集的样品的SEC-HPLC读出值。

图4 – 探测在零天、二十一天和二十八天从新西兰白兔采集的采血血清的Western印迹结果(使用针对宋内志贺氏菌 O-抗原和EPA的抗体)，所述新西兰白兔在零天、七天、十天和十八天用rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原生物缀合物组合物皮下注射，所述rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原生物缀合物组合物包含(图4A) 2 µg糖、40 µg蛋白和非弗氏佐剂或(图4B) 10 µg糖、200 µg蛋白和非弗氏佐剂。

图5 - 来自测定宋内志贺氏菌O-抗原、弗氏志贺氏菌2a O-抗原和肺炎链球菌12FCPS向rEPA1或rEPA43上的

图6 – 来自测定宋内志贺氏菌O-抗原向mAcrA、mPcrV、mCrm197(第“3.1”列)或m2Crm197(第“3.2”列)的

图7 - 经修饰以产生rEPA4-rEPA23 (图7A)和rEPA24-rEPA25 (图7B)的表面暴露的假单胞菌外毒素A (EPA)残基的描绘。残基相对于SEQ ID NO:1编号，结构采用ProteinData Bank (PDB) ID 1IKQ。

图8 – 来自体内测定脂质-载体-连接的宋内志贺氏菌O-抗原向rEPA4-rEPA15、rEPA24-rEPA25 (图8A)和rEPA16-rEPA25 (图8B)的

图9 – 来自测定

图10 – 来自测定脂质-载体-连接的宋内志贺氏菌O-抗原向rEPA332-rEPA39的

图11 – 来自体内测定脂质-载体-连接的宋内志贺氏菌O-抗原向rEPA32、rEPA34、rEPA36、rEPA38、rEPA40、rEPA41和rEPA42的

图12 – 来自测定肺炎球菌Sp.8 CPS聚糖向rEPA1上的

图13 – 来自测定肺炎球菌Sp.22A CPS聚糖向rEPA1上的

发明详述

本发明提供了并入一个或多个GlycoTag的修饰的载体蛋白及其在体内或体外生物缀合中的用途。

定义

为了促进对本发明的理解，下面定义了许多术语和短语。本文中也涵盖这些术语和短语的替代形式(时态)。除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可以在Benjamin Lewin, Genes V, 由Oxford University Press出版,1994 (ISBN 0‐19‐854287‐9); Kendrew等人(编), The Encyclopedia of MolecularBiology, 由Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0‐632‐02182‐9); 和Robert A.Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference, 由VCR Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1‐56081‐569‐8)中找到。

如本文所用的“包含(Comprise)”(“包含(comprising)”或“包含(comprises)”)是开放式的，并且意指“包括但不限于”。“具有”在本文中用作包含的同义词。应理解的是，无论在何处用语言“包含”描述实施方案，此类实施方案涵盖在“由...组成”和/或“基本上由...组成”的方面描述的那些。“在其中包含(Comprises therein)”或“在其中包含(comprising therein)”意指所引用的分子、氨基酸序列或核苷酸序列在其中已经分别并入GlycoTag分子、氨基酸序列或核苷酸序列。关于例如“其中包含GlycoTag的载体蛋白”，编码该载体蛋白的核苷酸序列在5'和3'末端之间具有编码GlycoTag的核苷酸序列，同样，该载体蛋白氨基酸序列在N-末端和C-末端之间具有GlycoTag氨基酸序列。

如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“一个GlycoTag”的提及涵盖一个或多个GlycoTag。

“约”或“近似”意指大致的，周围的或在其区域中。术语“约”或“近似”进一步意指如本领域普通技术人员所确定的在特定值的可接受的上下文误差范围内，这将部分取决于如何测量该值，即测量系统的限制或特定目的所需的精确度。当术语“约”或“近似”与数值范围结合使用时，它通过在所阐述的数值之上和之下延伸边界来修改该范围。例如，“在约5.5至6.5 g/l之间”意指数值范围的边界在5.5以下和6.5以上延伸，使得所讨论的特定值达到与该范围内相同的功能结果。例如，根据本领域中的实践，“约”和“近似”可以意指在1个或大于1个标准偏差之内。或者，“约”或“近似”可以意指给定值的最高达20%、最高达10%、最高达5%或最高达1%的范围。

如在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意欲包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意欲涵盖每个以下实施方案：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非特别说明，否则包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。可以以任何顺序混合组分。在存在三种组分的情况下，则可以将两种组分与彼此组合，且然后可以将该组合与第三组分组合，依此类推。类似地，尽管可以将方法的步骤编号(诸如(1)、(2)、(3)等或(i)、(ii)、(iii))，但步骤的编号本身并不意味着必须以该顺序进行步骤(即，步骤1，然后步骤2，然后步骤3，等)。在某些实施方案中，单词“然后”用于指定方法的步骤的顺序。

本文中的“基本上相同”意指至少两个分子(包括结构或功能)或数值之间的高度相似性，使得本领域技术人员会认为该差异是不重要的，可忽略的和/或统计上无关紧要的。例如，第一多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子与本文的第二多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子“基本上相同”，如果第一者与第二者相比在结构和功能上仅具有非实质性的差异的话。本文中的“基本上相同”涵盖“相同”。

“有效量”意指足以引起所提及的作用或结果的量。相对于所述目的，“有效量”可以使用已知技术凭经验和以常规方式确定。在某些实施方案中，组合物包含免疫有效量的抗原、佐剂或两者。在某些实施方案中，在向受试者施用治疗(例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗)的背景中的"有效量"是指具有预防和/或治疗效应的治疗的量。在某些实施方案中，“有效量”是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效应的治疗的量：(i)降低或改善细菌感染或与其相关的症状的严重度；(ii)缩短细菌感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防细菌感染或与其相关的症状的进展；(iv)引起细菌感染或与其相关的症状的消退；(v)预防细菌感染或与其相关的症状的发生或发作；(vi)预防细菌感染或与其相关的症状的复发；(vii)减少与细菌感染相关的器官衰竭；(viii)减少具有细菌感染的受试者的住院；(ix)缩短具有细菌感染的受试者的住院长度；(x)提高具有细菌感染的受试者的存活；(xi)消除受试者的细菌感染；(xii)抑制或减少受试者中的细菌复制；和/或(xiii)增强或改善另一治疗的预防或治疗效应。

“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)。

如“基本上不含…(essentially free from)”或“基本上不含…(essentiallyfree of)”中的“基本上不含”意指包含低于可检测水平的所提及物质或仅包含不可避免水平的所提及物质(痕量)。

单词“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含” Y的组合物可以完全不含Y。“基本上纯”是指至少50%纯(即不含污染物)、至少90%纯、至少95%纯、至少98%纯或至少99%纯的物质。

如常规，名称“NH2”或“N-”是指氨基酸序列的N-末端，且名称“COOH”或“C-”是指氨基酸序列的C-末端。

就蛋白、残基或氨基酸序列而言，如本文所用的“内部(Internal)”、“内部(Interior)”意指位于N-末端和C-末端之间。

“片段”是分别包含参考序列的“n”个连续核酸或氨基酸的核苷酸或多肽，并且其中“n”是小于参考序列中的氨基酸总数的任何整数。在某些实施方案中，“n”是1和100之间的任何整数。以这种方式，假设的100个残基长的参考序列(SeqX)的“其片段”可以由SeqX的任何1至99个连续氨基酸组成。在某些实施方案中，片段由全长序列的10、20、30、40或50个连续氨基酸组成。通过从全长参考多肽序列的N-末端和C-末端中的一个或两个中除去“n”个连续氨基酸，可以容易地获得片段。通过从编码全长参考多肽序列的核苷酸序列的3'和5'末端中的一个或两个中除去“n”个连续核酸，可以容易地获得片段。如本文所用的“免疫原性片段”由抗原序列的“n”个连续氨基酸组成，并且能够在哺乳动物中引发抗体或免疫应答。多肽的片段例如可以使用本领域中已知的技术，例如重组，通过蛋白水解消化或通过化学合成来产生。多肽的内部或末端片段可以通过如下生成：从编码多肽的全长氨基酸序列的核苷酸序列的3'或5'末端除去一个或多个核酸(对于末端片段)，或者从编码多肽的全长氨基酸序列的核苷酸序列3'和5'末端除去一个或多个核酸(对于内部片段)。

“可操作地连接的(Operably linked)”或“可操作地连接的(operativelylinked)”意指被连接以便是“可操作的”，例如，用于重组蛋白表达的多核苷酸序列的配置。在某些实施方案中，“可操作地连接的”是指例如核酸组分的本领域公认的定位，使得实现预期的功能(例如，表达)。本领域普通技术人员将认识到，在某些情况下(例如切割位点或纯化标签)，“可操作地连接”在一起的两个或更多个组分在核酸或氨基酸序列中不一定与彼此相邻(连续链接的)。与“控制序列”(例如，启动子、增强子或IRES) “可操作地连接”的编码序列以使得编码序列的表达在控制序列的影响或控制下的方式连接。本领域普通技术人员将认识到，各种配置是功能性的并且被涵盖。

“重组的”意指人工的或合成的。在某些实施方案中，“重组的”指示所提及的氨基酸、多肽、缀合物、抗体、核酸、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子通过两个或更多个分子(例如，异源核酸或氨基酸序列)的人工组合来制备。这种人工组合包括但不限于化学合成和基因工程改造技术。在某些实施方案中，“重组多肽”是指已经使用重组核酸(引入宿主细胞的核酸)制备的多肽。在某些实施方案中，重组核酸不是异源的(例如，其中重组核酸是宿主细胞中固有存在的核酸的第二拷贝)。本文中的“转基因”意指引入细胞中的多核苷酸，因此转基因是重组的。

“突变的”和“修饰的”被给予其充分理解和惯用的含义，并且至少表示所提及的分子与对照(例如野生型分子或其天然存在)相比在相当的条件下被改变(结构和/或功能)或表示所提及的数值与对照的值相比在相当的条件下被改变(增加或减少)。

“保守”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的互换性，且因此通常涉及用相同或相似定义的氨基酸类别内的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，在某些实施方案中，保守突变不包括从亲水至亲水、从疏水至疏水、从含羟基至含羟基或从小残基至小残基的取代，如果保守突变可以反而是从脂族至脂族、从非极性至非极性、从极性至极性、从酸性至酸性、从碱性至碱性、从芳族至芳族或受约束至受约束残基的取代的话。此外，如本文所用，A、V、L或I可以被保守地突变为另一个脂族残基或另一个非极性残基。下表显示了示例性的保守替代。

本文中的“分离的”或“纯化的”意指呈自然界中未发现的形式的多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子。这包括例如已经从宿主细胞或生物体(包括粗提物)分离或以其他方式从其天然环境中移取的多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子。在某些实施方案中，分离或纯化的蛋白是基本上不含该蛋白与其先天缔合(或与其先天接触)的所有其他多肽的蛋白。例如，“分离的PglL”或“纯化的PglL”包括基本上不含其他周质多肽的重组PglL蛋白，否则该PglL蛋白将与宿主细胞内部与所述其他周质多肽缔合(接触)。例如，“分离的O-糖基化的修饰的载体蛋白”或“纯化的O-糖基化的修饰的载体蛋白”可能已经与

“药物级”或“药学上可接受的”多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子被分离、纯化或以其他方式配制为基本上不含杂质(例如，基本上不含组分(例如，天然存在的组分)，所述组分(例如，天然存在的组分)对于可向其施用多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子的受试者具有不可接受的毒性)。药物级多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子

如本文所用的“同源物”意指尽管源自不同的生物体的属或物种和/或具有不同的结构但具有基本上相同的功能的两个或更多个分子。为了表示在本文中类似的功能性，即使在本领域中使用替代名称，“PglL”或“PilE”也可以分别用于指寡糖基转移酶或菌毛蛋白(例如，本文中的“

如本文所用的“内源的”意指源自相同生物体物种的两种或更多种多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子，或者在例如合成或重组多肽的情况下，基本上由与源自相同生物体物种的结构和功能组成。关于PglL，例如，“内源的”是指受试PglL与受试菌毛蛋白(或来自其的GlycoTag)的关系，并且意味着它们源自相同生物体物种，或者基本上由作为源自相同生物体物种的那些的结构和功能组成。作为一个实例，脑膜炎奈瑟氏菌PglL对于脑膜炎奈瑟氏菌PilE是“内源的”(并且以该方式，PglL可以被称为对于所提及的菌毛蛋白是“内源的”)。作为一个进一步实例，脑膜炎奈瑟氏菌PglL对于脑膜炎奈瑟氏菌细胞(特别是对照或野生型脑膜炎奈瑟氏菌细胞)是“内源的”。

如本文所用的“异源的”意味着所提及的两个或更多个事物本质上彼此不相关。在某些实施方案中，如果可比较的天然存在的细胞(例如在可比较的条件下的野生型细胞)不会产生蛋白，则该蛋白对于细胞是“异源的”。在某些实施方案中，周质信号序列对于蛋白(或对于蛋白的氨基酸序列)是“异源的”，因为可比较的天然存在的蛋白(例如，野生型蛋白)不会与该信号序列可操作地连接。

“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”用于指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、多核糖核酸分子或多脱氧核糖核酸分子，无论是否修饰、未修饰或合成。因此，如本文所定义的多核苷酸可以包括单链和双链DNA，包括单链和双链区域的DNA，单链和双链RNA，以及包括单链和双链区域的RNA，包含可以是单链或更通常是双链或包括单链和双链区域的DNA和DNA的杂合分子。因此，具有出于稳定性或出于其他原因而修饰的主链的DNA或RNA是该术语在本文中意指的“多核苷酸”。DNA或RNA可以是合成的(包括但不限于一起形成多核苷酸的核酸亚基)。此外，如本文所定义的术语“多核苷酸”内包括包含不寻常的碱基、诸如肌苷或修饰的碱基、诸如氚化碱基的DNA或RNA。通常，术语“多核苷酸”包括未修饰的多核苷酸的所有化学、酶促和/或代谢修饰的形式。可以通过各种方法，包括体外重组DNA介导的技术以及通过DNA在细胞和生物体中的表达，来制备多核苷酸。多核苷酸包括基因组和质粒核酸。DNA包括但不限于具有例如内含子的基因组(核)DNA，以及重组DNA，诸如cDNA (例如，除去内含子)。RNA包括但不限于mRNA和tRNA。预见的是，密码子优化用于本发明的多核苷酸分子的任何重组表达。

“载体”是指核酸分子由其包含并从一种环境转移至另一种环境或促进核酸分子的操作的媒介物。媒介物可以是例如克隆载体、表达载体或质粒。载体包括例如BAC或YAC载体。术语“表达载体”包括但不限于含有适合于由细胞表达的编码序列的任何载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体) (例如，其中编码序列与转录控制元件、诸如启动子可操作地连接)。载体可以包含两个或更多个核酸分子，在某些实施方案中，那两个或更多个核酸分子各自均包含编码蛋白的核苷酸序列。

“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。“肽”可以用于指由1至50个氨基酸组成的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然修饰或通过干预(例如，二硫键形成，糖基化(除了修饰的载体蛋白的O-糖基化)，脂化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白水解切割，通过非天然存在的氨基酸修饰或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合)修饰的氨基酸聚合物。该定义内还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。

“聚糖”是含有小糖分子的大碳水化合物分子，并且在本文的某些实施方案中，是指“糖蛋白”(包含共价附接至氨基酸侧链的聚糖的蛋白)的寡糖链。“O-聚糖”或“ O-连接的聚糖”在本文中用于指共价附接至另一分子的丝氨酸或苏氨酸残基的聚糖(即，该聚糖参与o-连接的糖基化)。聚糖可以是免疫原性的。[3]。

寡糖或多糖的“还原末端”是具有游离异头碳的单糖，所述游离异头碳不参与糖苷键，且因此能够转化为开链形式。本文中的第一糖(“S-1”)是包含还原末端的糖，且第二糖(“S-2”)是与S-1相邻的糖。S-2糖可以通过例如α-(1→3)、β-(1→3)、β-(1→4)或α-(1→ 6)连接附接至S-1糖(参见[3])。

本文中的“抗原”或“免疫原”是指能够诱导受试者中的免疫应答的物质，通常是蛋白或聚糖。在某些实施方案中，抗原是具有“免疫学活性”的蛋白(例如，糖蛋白)，意味着一旦施用于受试者(直接或通过向受试者施用编码该蛋白的核苷酸序列或载体)，其能够引发针对该蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。“O-抗原”由寡糖单元(O-单元)的重复组成，所述寡糖单元(O-单元)通常具有两个至六个糖残基。[20]。O-抗原是革兰氏阴性细菌的外膜的组分。[20]。在某些实施方案中，所述聚糖是O-抗原。

“佐剂”是增强抗原的免疫学作用的诱导、幅度和/或寿命的非抗原物质。

“缀合”是指载体蛋白与糖的偶联(例如，通过共价键)。

本文的“缀合物”意指与彼此连接的两个或更多个分子(例如，蛋白)。所述两个或更多个分子任选地是重组分子和/或与彼此异源。在某些实施方案中，所述缀合物包含两个或更多个分子，第一个是载体蛋白，例如修饰的载体蛋白，且剩余的一个或多个分子是共价附接至载体蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基的聚糖。在某些实施方案中，缀合物包含糖基化的载体蛋白，诸如O-糖基化的载体蛋白，包括O-糖基化的修饰的载体蛋白。结合物可以是化学缀合或体外缀合(生物缀合)的结果。

“抗体”意指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标、诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体，完整的单克隆抗体，多特异性抗体，诸如由至少两种完整的抗体生成的双特异性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包含抗体的融合蛋白和任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出期望的生物学活性即可。基于其重链恒定结构域的身份(分别称为α、δ、ε、γ和μ)，抗体可以是免疫球蛋白的五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)中的任一种。不同类别的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其他分子(诸如毒素、放射性同位素等)缀合。术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”是指完整抗体的结合抗原的部分。抗原结合片段可以含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。

“抗体应答”意指抗抗原抗体的产生。“诱导抗体应答”或“产生抗体应答”意指在体内刺激抗抗原抗体、例如抗O-抗原抗体或抗聚糖抗体的产生。

如在两个或更多个序列的上下文中所用的“相同的”或百分比“同一性”是指在比对序列的整个长度上相同的核苷酸或氨基酸的数目(为了清楚起见，在该上下文中的保守氨基酸取代将

可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量百分比同一性。本领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件。序列比对算法的一种这种非限制性实例是在[22]中描述、如在[23]中修改且并入NBLAST和XBLAST程序中的算法([24])。在某些实施方案中，可以如[24]中所述使用Gapped BLAST。BLAST-2，WU-BLAST-2([25]，ALIGN，ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的额外公开可得的软件程序。在某些实施方案中，使用GCG软件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或90的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重)确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。在某些替代实施方案中，可以使用并入Needleman和Wunsch ([26])的算法的GCG软件包中的GAP程序来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5的长度权重)。或者，在某些实施方案中，使用Myers和Miller([27])的算法确定核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性。例如，可以使用ALIGN程序(2.0版)并使用具有残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分的PAM120来确定百分比同一性。通过特定的比对软件，用于最大比对的合适参数可以由本领域技术人员确定。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。

作为非限制性实例，任何特定的多核苷酸或多肽是否具有特定百分比序列同一性(例如，至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，并且在一些实施方案中，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性)可以使用已知方法、诸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics ComputerGroup, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)来确定。Bestfit使用Smith和Waterman (

在一些实施方案中，本发明的两种核酸或多肽是基本上相同的，意味着当如使用序列比较算法或通过目视检查和比较以获得最大对应性时，它们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、并且在一些实施方案中至少95%，96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸残基同一性。同一性可以存在于长度为至少约10、约20、约40-60个残基或它们之间的任何整数值的序列区域上，并且可以在比60-80个残基更长的区域上，例如，在至少约90-100个残基，并且在一些实施方案中，序列在所比较的序列(诸如核苷酸序列的编码区)的“全长”上基本上相同。

“相对于...编号”、“与...相比”、“根据...编号”在本文中用于指氨基酸序列中的

如本文所用的“宿主细胞”是指向其中引入、已经引入或将引入分子(通常是异源或非天然核酸分子)的细胞。本文的宿主细胞不涵盖整个人生物体(即，“分离的宿主细胞”)。

PglL

寡糖基转移酶(OST或OTase)是膜嵌入的酶，其将寡糖从脂质载体转移至新生的蛋白(与胞质中的糖基转移酶不同，所述糖基转移酶通过依次作用组装寡糖，OTase将聚糖总体转移至蛋白[2])。O-连接的糖基化由糖分子(聚糖)与蛋白靶标(例如，菌毛蛋白)中氨基酸残基(例如丝氨酸或苏氨酸)的侧链羟基共价附接组成。来自例如脑膜炎奈瑟氏菌的菌毛蛋白-糖基化基因L(PglL)蛋白是参与O-连接的糖基化的OTase。在革兰氏阴性细菌的周质中，PglL将聚糖从Und-PP-聚糖转移至菌毛蛋白([1])。与PglB (N-糖基化)不同，PglL不需要还原末端的位置C-2处的2-乙酰氨基基团或前两个糖之间的β1,4键才具有活性，并且因此能够将几乎任何聚糖(脑膜炎奈瑟氏菌PglL将例如空肠弯曲杆菌七糖、大肠杆菌O7抗原、大肠杆菌K30荚膜结构、肠炎沙门氏菌O-抗原和大肠杆菌O16肽聚糖亚基转移至大肠杆菌和沙门氏菌细胞两者中的菌毛蛋白) ([1], [3], [14], [16])。

本文的“PglL OTase”涵盖脑膜炎奈瑟氏菌PglL OTase以及

如本文所用的“PglL聚糖底物”、“PglL底物”是指可通过PglL Otase转移的聚糖(即，作为PglL的底物的聚糖)。参见[1], [14], [29], [3], [16]。在某些实施方案中，PglL聚糖底物附接至脂质-载体(“脂质-载体-连接的PglL聚糖底物”)。在某些实施方案中，所述脂质-载体是十一异戊烯醇-焦磷酸酯(UndPP)、多萜醇-焦磷酸酯或其合成等同物。在某些实施方案中，所述脂质-载体是UndPP。在某些实施方案中，所述聚糖是“UndPP-连接的PglL底物”。预见的是，脂质-载体-连接的聚糖在革兰氏阴性宿主细胞内是膜结合的。膜结合的脂质-载体-连接的PglL聚糖底物可以说是位于“周质处”。在某些实施方案中，指定

奈瑟氏菌PglL在异源宿主细胞内的重组表达描述于本文中，并且是本领域已知的(参见[10], [8], [9], [29](例如，表1)，[11], [1], [14], [5], [3], [31]；其全部通过引用以其整体并入本文)。

载体蛋白

如本文所用的“载体蛋白”意指适合于在生物缀合物疫苗的生产中用作载体蛋白的蛋白(例如，[32])。如本文所用的“载体蛋白”不同于“脂质载体”(或“脂质-连接的-载体”)，其后者包括但不限于十一异戊烯基焦磷酸酯(UndPP)。

如本文所用的“修饰的载体蛋白”意指与野生型相比被改变(以一种或多种方式)的载体蛋白(即，“修饰的载体蛋白”不包括野生型菌毛蛋白)。修饰的载体蛋白包括但不限于并入一个或多个GlycoTag、纯化标签、缺失(例如，跨膜结构域的至少一部分的缺失)、插入和/或突变(例如，AcrA突变)的载体蛋白([33])。在某些实施方案中，修饰的载体蛋白与对照载体蛋白(例如，野生型)相比被改变，使得修饰的载体蛋白可以是PglL聚糖底物的“受体”(即，从没有菌毛蛋白中间体的PglL直接接受PglL聚糖底物)。在某些实施方案中，一种此类修饰的载体蛋白通过包含一个或多个GlycoTag而改变。在某些实施方案中，一种此类修饰的载体蛋白在其N-末端、C-末端和/或内部残基包含一个或多个GlycoTag。为了清楚起见，“包含在其N-末端和/或C-末端具有一个或多个GlycoTag的载体蛋白的修饰的载体蛋白”意指“其N-末端和/或C-末端与一个或多个GlycoTag可操作地连接的载体蛋白的修饰的载体蛋白”。

在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白直接(例如，经由O-连接的糖苷键)或间接(例如，经由接头)共价偶联至聚糖，其中所述偶联是在GlycoTag中的一个或多个处。在进一步实施方案中，所述聚糖是PglL聚糖底物。在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白偶联至志贺氏菌聚糖(例如宋内志贺氏菌聚糖(诸如宋内志贺氏菌O-抗原)，或例如弗氏志贺氏菌聚糖(诸如弗氏志贺氏菌2a CPS)或痢疾志贺氏菌聚糖)。在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白偶联至链球菌聚糖(例如肺炎链球菌(诸如肺炎链球菌属物种12F CPS，肺炎链球菌属物种8 CPS，肺炎链球菌属物种14 CPS，肺炎链球菌属物种23A CPS，肺炎链球菌属物种33F CPS或肺炎链球菌属物种22A CPS))。

“O-糖基化的修饰的载体蛋白”意指修饰的载体蛋白被糖基化，并且具体地，参与O-连接的糖基化(例如，与PglL聚糖底物O-连接的修饰的载体蛋白)。

O-糖基化的修饰的载体蛋白可以直接或间接连接至两个或更多个不同的免疫原性聚糖，并且以该方式，可用于诱导对两个或更多个免疫原性聚糖(即多价)的免疫或抗体应答。

示例性载体蛋白包括但不限于铜绿假单胞菌的解毒外毒素A (“EPA”；参见，例如[4])，CRM197，麦芽糖结合蛋白(MBP)，白喉类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)，破伤风毒素C片段(TTc)，金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A，凝集因子A，凝集因子B，大肠杆菌FirmH，大肠杆菌FirmHC，大肠杆菌热不稳定肠毒素，大肠杆菌热不稳定肠毒素的解毒变体，霍乱毒素B亚基(CTB)，霍乱毒素，霍乱毒素的解毒变体，大肠杆菌Sat蛋白，大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域，肺炎链球菌肺炎球菌溶血素及其解毒变体，空肠弯曲杆菌吖啶黄抗性蛋白A (

在某些实施方案中，所述载体蛋白是来自流感嗜血杆菌的蛋白D (PD)，例如，来自[37]的图9的蛋白D序列(图9a和9b一起，364个氨基酸)。在免疫原性组合物中包含这种蛋白可以提供一定水平的针对流感嗜血杆菌相关中耳炎的保护([38])。蛋白D可以用作全长蛋白或片段(例如，蛋白D可以如[39]中所述)。例如，蛋白D序列可以包含如[37]中所述的蛋白D片段(或由其组成)，所述蛋白D片段缺乏来自[37]的图9的19个N-末端氨基酸，任选地具有来自NS1的三肽MDP，其融合至所述蛋白D片段(348个氨基酸)的N-末端。在一个方面，所述蛋白D或蛋白D的片段是未脂化的。

在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。CRM197是白喉毒素的一种无毒形式，但与白喉毒素(DT)在免疫学上没有区别。白喉毒素的遗传解毒类似物包括CRM197和在US4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827和US 5,917,017中描述的其他突变体。CRM197由白喉衣原体产生，所述白喉衣原体被通过毒原性衣原体噬菌体b的亚硝基胍诱变产生的非毒原性阶段β197tox-感染([40])。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但与其区别在于结构基因中的单碱基变化。这导致位置52处的氨基酸从甘氨酸变为谷氨酰胺，这使片段A无法结合NAD，且因此无毒([41]，[42])。

在一个实施方案中，所述载体蛋白是破伤风类毒素(TT)。破伤风毒素是近似150kDa的单一肽，其由1315个氨基酸残基组成。破伤风-毒素可以被木瓜蛋白酶切割，以产生两个片段；其中之一，片段C，为近似50 kDa。TT的片段C描述于[43]中。

在一个实施方案中，所述载体蛋白是dPly(解毒的肺炎球菌溶血素)。肺炎球菌溶血素(Ply)是一种多功能毒素，其具有独特的细胞裂解(溶血)和补体活化活性([44])。该毒素不是由肺炎球菌分泌的，而是其在自溶素的影响下在肺炎球菌裂解后释放的。其作用包括，例如，人单核细胞刺激炎性细胞因子的产生，抑制纤毛对人呼吸道上皮的跳动，降低杀细菌活性和嗜中性粒细胞的迁移以及红血细胞的裂解，这涉及与胆固醇结合。由于它是一种毒素，所以在体内施用它之前，需要将其解毒(即，当以适合于保护的剂量提供时对人无毒)。野生型或天然肺炎球菌溶血素的表达和克隆是本领域中已知的。参见，例如，[45]，[46]和[47]。Ply的解毒可以通过化学手段进行，例如，进行福尔马林或戊二醛处理或两者的组合([48]，[49])。此类方法对于各种毒素是本领域中已知的。或者，可以对Ply进行遗传解毒(改变，使得其在生物学上无活性，同时仍维持其免疫原性表位，例如[50], [51]和[52]。如本文所用，应理解术语“Ply”涵盖突变的肺炎球菌溶血素和解毒的肺炎球菌溶血素(dPly)，其适用于药物用途(即无毒)。

可以将编码载体蛋白的核酸引入宿主细胞中，用于产生包含载体蛋白的生物缀合物。为了在革兰氏阴性细菌内用于体内生物缀合，载体蛋白位于周质内。可以通过使用周质信号序列将载体蛋白靶向至周质。周质信号序列结构和用途(包括其切割、密码子优化和重组附接至异源蛋白)是本领域中已知的。参见例如[53]，[54]，[5]和[34]。通常，密码子优化也是本领域中众所周知的，并且除非另有说明(包括实施例)，否则预见密码子优化用于本发明的任何重组表达。参见例如[55]，[56]，[57]，[58]，[59] [60]。

信号序列，包括周质信号序列，通常在蛋白移位至例如周质中期间通过信号肽酶除去(即，成熟蛋白是已经从其除去至少信号序列的蛋白)。本文使用“靶向至周质”来确认通常除去信号序列。以该方式，“靶向至周质”的蛋白包括可操作地连接至周质信号序列的蛋白以及已经从其中除去周质信号序列的成熟蛋白两者。

周质信号序列是本领域中众所周知的。在某些实施方案中，所述周质信号是如下的周质信号：胡萝卜软腐欧文氏菌果胶裂解酶B (pelB)，大肠杆菌外膜孔蛋白A (OmpA)，大肠杆菌二硫化物氧化还原酶(DsbA)，大肠杆菌Tol-Pal细胞包膜复合物(TolB)，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白亚基(MalE)，大肠杆菌鞭毛蛋白(Flgl)，热不稳定的肠毒素(LtIIb)(例如，大肠杆菌LtIIb)，SipA(例如，化脓链球菌SipA，尿酸梭菌SipA，解淀粉芽孢杆菌SipA)，大肠杆菌镍结合蛋白NikA (NikA)，芽孢杆菌属物种内切木聚糖酶(XynA)，大肠杆菌热稳定肠毒素II (STII)或大肠杆菌碱性磷酸酶亚基(PhoA)。[5]。在某些实施方案中，所述周质信号序列是PelB、OmpA、DsbA、TolB或MalE。在某些实施方案中，周质信号序列是DsbA。

在某些实施方案中，所述载体蛋白包含"标签"，即允许检测、分离和/或鉴定所述载体蛋白的氨基酸序列。例如，向载体蛋白添加标签可用于纯化该蛋白且因此纯化包含标记的载体蛋白的生物缀合物。可用于本文中的示例性标签包括但不限于组氨酸(HIS)标签(例如，六组氨酸-标签或6XHis-标签)、FLAG-标签和HA标签，以及strep标签、myc标签或其组合。在某些实施方案中，本文使用的标签是可除去的，例如一旦不再需要它们(诸如在纯化蛋白之后)，就通过化学试剂或通过酶促方式除去。

如本文所用的“纯化标签”是指用例如大小排阻色谱、离子交换色谱和/或亲和色谱法帮助蛋白纯化的配体。纯化标签及其用途是本领域众所周知的(例如参见[61]，[62])，并且可以是例如聚组氨酸(HIS)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，c-Myc (Myc)，血凝素(HA)，FLAG或麦芽糖结合蛋白(MBP)。在某些实施方案中，纯化标签是表位标签(其包括例如组氨酸，FLAG，HA，Myc，V5，绿色荧光蛋白(GFP)，GSK，β-半乳糖苷酶(b-GAL)，萤光素酶，麦芽糖结合蛋白(MBP)或红色荧光蛋白(RFP)标签)。在某些实施方案中，多肽可操作地连接至一个或多个纯化标签(包括纯化标签的组合)。因此，纯化、收集、获得或分离蛋白的步骤可以包括大小排阻色谱、离子交换色谱或亲和色谱。在某些实施方案中，纯化修饰的载体蛋白(或包含其的缀合物)的步骤利用亲和色谱，例如，σ28亲和柱或包含结合修饰的载体蛋白或包含其的缀合物的抗体的亲和柱(任选地，通过结合聚糖(glycn))。在某些实施方案中，纯化包含至少一个可操作地连接至纯化标签的修饰的载体蛋白的融合蛋白的步骤利用亲和色谱和例如结合纯化标签的亲和柱。

GlycoTag

如本文所用的“GlycoTag”是重组的O-连接的糖基化位点，并且由菌毛蛋白氨基酸序列的片段组成。以该方式，术语“GlycoTag”用于指重组氨基酸序列(即，与野生型菌毛蛋白分离)，而“序列子”可以用于指位于野生型菌毛蛋白内(即不与野生型菌毛蛋白分开)的相同序列。

设想在一个载体蛋白内使用多个GlycoTag(参见实施例)，任选地，多个GlycoTag彼此相邻。两个或更多个GlycoTag可以被由一个或多个氨基酸(其可以是例如一个或多个甘氨酸([63])、一个或多个丝氨酸和/或其组合(参见[64]))组成的“氨基酸接头”隔开。本文的“氨基酸接头”是一种类型的“接头”。

位于载体蛋白的N-或C-末端的GlycoTag的O-糖基化效率可以通过用一个或多个“侧接肽”(包含亲水性氨基酸、诸如DPRNVGGDLD (SEQ ID NO:1的残基599-608)或QPGKPPR(SEQ ID NO:1的残基628-634)的肽)侧接GlycoTag (即，朝向GlycoTag的N-末端和/或朝向其C-末端放置)而增加。[3]。这种侧接肽可以与GlycoTag相邻(即，在GlycoTag和侧接肽之间没有氨基酸)，或者可以在其和GlycoTag之间具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。可以使用两个或更多个侧接肽的插入。侧接肽可用于增加较短的GlycoTag的O-糖基化效率，所述GlycoTag诸如具有序列SEQ ID NO:142、147、151或164的序列(全部12个氨基酸长)。

本文的亲水性氨基酸包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、组氨酸(H)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)和色氨酸(W)。

聚糖是可以转移(例如，共价连接)至载体蛋白的任何糖。聚糖包含单糖、寡糖和多糖。寡糖是具有2至10个单糖的聚糖。多糖是具有大于10个单糖的聚糖。多糖可以选自O-抗原、胶囊和胞外多糖。

本发明所用的聚糖是PglL Otase底物。[1]，[14]，[29]，[16]，[30]和[15]。在某些实施方案中，聚糖可操作地连接至脂质-载体。在某些实施方案中，所述聚糖可以是但不限于己糖、己糖的N-乙酰基衍生物、寡糖和多糖。在某些实施方案中，在聚糖的还原末端的单糖是己糖或己糖的N-乙酰基衍生物。在某些实施方案中，所述聚糖在其还原末端包含己糖单糖，诸如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖或甘露糖。在某些实施方案中，在还原末端的己糖单糖是葡萄糖或半乳糖。在某些实施方案中，所述聚糖的还原末端是己糖的N-乙酰基衍生物。通常，己糖的N-乙酰基衍生物(或“己糖单糖衍生物”)在位置2处包含乙酰氨基基团。在某些实施方案中，己糖的N-乙酰基衍生物选自N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基己糖胺(HexNAc)、脱氧HexNAc和2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧基己糖(DATDH)、N-乙酰基岩藻糖胺(FucNAc)和N-乙酰基quinovosamine (QuiNAc)。在某些实施方案中，己糖的N-乙酰基衍生物选自N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基岩藻糖胺(FucNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧基己糖(DATDH)、甘油酰氨基-乙酰氨基三脱氧己糖(GATDH)和N-乙酰基己糖胺(HexNAc)。在某些实施方案中，所述聚糖具有N,N-二乙酰基杆菌胺(diNAcBac)或伪氨基酸(Pse)的还原末端。在某些实施方案中，所述聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖、甘露糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、QuiNAc、diNAcBac或Pse的还原末端的聚糖。在某些实施方案中，所述聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc或diNAcBac的还原末端的聚糖。在某些实施方案中，所述聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH或diNAcBac的还原末端的聚糖。在某些实施方案中，所述聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH或diNAcBac的还原末端的聚糖。在某些实施方案中，所述聚糖是具有选自DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖和葡萄糖的还原末端的聚糖。在某些实施方案中，所述聚糖是具有还原末端GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的聚糖。在某些实施方案中，所述聚糖是具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰半乳糖胺的S-2至S-1还原末端的聚糖。

在某些实施方案中，所述聚糖对于奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞是内源的。在某些实施方案中，所述聚糖对于志贺氏菌、沙门氏菌、埃希氏菌或假单胞菌细胞是内源的。在某些实施方案中，所述聚糖对于弗氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌或大肠杆菌细胞是内源的。在某些实施方案中，所述聚糖来自空肠弯曲杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌LT2或大肠杆菌。参见[3]，[29]，[1]，[14]。

在某些实施方案中，所述聚糖是免疫原性聚糖(抗原)。在某些实施方案中，所述聚糖是O-抗原。在某些实施方案中，所述聚糖是对于奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞的内源的免疫原性O-抗原。在进一步实施方案中，PglL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原，例如宋内志贺氏菌O-抗原，弗氏志贺氏菌聚糖抗原，例如弗氏志贺氏菌2a CPS，痢疾志贺氏菌聚糖抗原，肺炎链球菌聚糖抗原，例如肺炎链球菌属物种12F CPS，肺炎链球菌属物种8 CPS，肺炎链球菌属物种14 CPS，肺炎链球菌属物种23A CPS，肺炎链球菌属物种33F CPS或肺炎链球菌属物种22A CPS。在某些实施方案中，所述聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖、甘露糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、QuiNAc、diNAcBac或Pse的还原末端的肺炎链球菌聚糖。在某些实施方案中，所述聚糖是肺炎链球菌聚糖，其为具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-岩藻糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端的聚糖。Sanger Institute (http://WorldWideWeb(www).sanger.ac.uk/Projects/S_pneumoniae/CPS/)已经对所有90种肺炎链球菌血清型的CP基因簇进行测序。序列在NCBI中作为Genbank CR931632–CR931722提供。肺炎链球菌的荚膜生物合成基因在来自肺炎链球菌菌株1196/45(血清型23a)的血清型23A中作为NCBI GenBank登录号CR931683.1进一步描述。来自肺炎链球菌菌株1039/41的血清型23B作为NCBIGenBank登录号：CR931684.1进行描述。来自肺炎链球菌菌株Dr. Melchior的血清型23F作为NCBI GenBank登录号：CR931685.1进行描述。

在某些实施方案中，所述聚糖是宋内志贺氏菌O-抗原。在某些实施方案中，所述宋内志贺氏菌O-抗原由wbgT蛋白、wbgU蛋白、wzx蛋白、wzy蛋白、wbgV蛋白、wbgW蛋白、wbgX蛋白、wbgY蛋白和wbgZ蛋白组成。在某些实施方案中，所述宋内志贺氏菌O-抗原由与SEQ IDNO:108具有至少90%同一性的wbgT蛋白、与SEQ ID NO:109具有至少90%同一性的wbgU蛋白、与SEQ ID NO:110具有至少90%同一性的wzx蛋白、与SEQ ID NO:111具有至少90%同一性的wzy蛋白、与SEQ ID NO:112具有至少90%同一性的wbgV蛋白、与SEQ ID NO:113具有90%同一性的wbgW蛋白、与SEQ ID NO:114具有至少90%同一性的wbgX蛋白、与SEQ ID NO:115具有至少90%同一性的wbgY蛋白和与SEQ ID NO:116具有至少90%同一性的wbgZ蛋白组成)。

其应用

如本文所提供，所述修饰的载体蛋白可用于生物缀合。在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白可用于革兰氏阴性细菌宿主细胞内的体内生物缀合。在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白可以用于通过将修饰的载体蛋白与奈瑟氏菌PglL和PglL聚糖底物一起孵育(任选地在合适的缓冲液中)而产生缀合物。

在某些实施方案中，使用体内方法和系统产生O-糖基化的修饰的载体蛋白。在某些实施方案中，制备O-糖基化的修饰的载体蛋白(或生物缀合物)，且然后从宿主细胞的周质中分离。本发明的体内缀合(“生物缀合”)利用已知的方法用于在革兰氏阴性细菌细胞内表达重组蛋白并从其中分离，包括序列选择和优化，载体设计，克隆质粒，培养参数和周质纯化技术。参见，例如，[65]，[3]，[5]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，[1]，[14]，[4]，[63 ]和[31]。使用宿主细胞产生生物缀合物的方法描述于例如[66]和[67]。生物缀合提供了优于体外化学缀合的优势，因为生物缀合需要较少的化学品用于制造，并且就生成的最终产品而言更加一致。

用于本发明使用的革兰氏阴性细菌细胞包括但不限于来自奈瑟氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、耶尔森氏菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、克雷伯氏菌属或螺杆菌属的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、埃希氏菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌和螺杆菌细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自志贺氏菌、沙门氏菌和埃希氏菌细胞。在一个实施方案中，所述革兰氏阴性细菌细胞被分类为奈瑟氏菌属物种、志贺氏菌属物种、沙门氏菌属物种、埃希氏菌属物种、假单胞菌属物种、耶尔森氏菌属物种、弯曲杆菌属物种、弧菌属物种、克雷伯氏菌属物种、或螺杆菌属物种细胞。所述革兰氏阴性细菌宿主细胞可以被分类为除了长奈瑟氏菌以外的奈瑟氏菌属物种细胞。在一个进一步实施方案中，所述革兰氏阴性细菌细胞是弗氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞选自弗氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌和大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是霍乱弧菌细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，所述革兰氏阴性细菌细胞源自大肠杆菌菌株K12、Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6或SCM7。在某些实施方案中，所述宿主细胞是弗氏志贺氏菌细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是肠炎沙门氏菌细胞。在一个实施方案中，所述革兰氏阴性细菌细胞源自肠炎链球菌菌株SL3261、SL3749、SL326iδwaaL或SL3749。在某些实施方案中，所述宿主细胞是副伤寒沙门氏菌细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是铜绿假单胞菌细胞。参见[10]，[8]，[9]，[29]，在例如表1和[11]；[3]，[31]，[5]，[1]，[14]。

在某些实施方案中，修饰革兰氏阴性细菌细胞，使得与对照(例如野生型)相比，细胞的内源性(周质) O-抗原连接酶(或“内源性PglL同源物”)的表达或功能减少(缺乏或“敲低”)或敲除(KO)。在某些实施方案中，“内源性PglL同源物的减少”或“内源性PglL同源物减少”用于意指内源性PglL同源物的表达或功能的减少(例如，敲除)。以该方式，本发明的革兰氏阴性细菌细胞可能缺乏其内源性PglL同源物。例如，大肠杆菌的

本发明的宿主细胞可以利用内源性或异源性糖基转移酶用于寡糖在胞质溶胶中的依次组装(胞质糖基转移酶)。此类糖基转移酶包括例如图1和[2]所示的奈瑟氏菌PglD、PglC、PglB/PglB2和PglA (还参见[103]，尤其是对于淋病奈瑟氏菌，且还参见[104]，尤其是对于长奈瑟氏菌)。术语“糖基转移酶”在本文中如其在本领域中所使用的那样被使用，以涵盖可以被称为“磷酸-糖基转移酶”的物质(例如，奈瑟氏菌PgIB [103])。革兰氏阴性细菌宿主细胞可以被修饰以包含异源(例如细菌或革兰氏阴性细菌)糖基转移酶，并且任选地被进一步修饰以包含与野生型相比减少的内源性糖基转移酶(例如，对应的内源性糖基转移酶的表达降低)。可以选择本发明的宿主细胞，因为其内源性糖基转移酶产生靶聚糖，

“O-糖基化机制”用于统称本领域众所周知的分子(例如，糖基转移酶、翻转酶、聚合酶、寡糖基转移酶，包括基因簇和细胞器)和O-糖基化的过程。参见例如[69]，[3]，[5]，[31]，[10]，[8]，[9]，[29]，[11]。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌宿主细胞包含对于宿主细胞内源、异源或其组合的O-糖基化机制。在一个进一步实施方案中，革兰氏阴性细菌宿主细胞包含O-糖基化机制，条件是与对照相比，该细胞的内源性PglL或PglL同源物减少。在一个进一步实施方案中，革兰氏阴性细菌宿主细胞包含内源性O-糖基化机制，条件是与对照相比，该细胞的内源性PglL或PglL同源物减少。在一个特定实施方案中，大肠杆菌或肠炎链球菌阴性宿主细胞包含内源性O-糖基化机制，其条件是与对照相比，该细胞的PglL同源物

再次，密码子优化是本领域中众所周知的，并且除非另有说明(包括实施例)，否则预见密码子优化用于本发明的任何重组表达。

本发明的转基因的表达可以在转录控制元件(TCE)(其包括例如启动子)的控制下。在某些实施方案中，转基因在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述诱导型启动子仅当暴露于一些特定的外部刺激(诸如但不限于抗生素、诸如四环素，激素、诸如蜕皮激素或重金属)时才起始转录。所述启动子也可以对于特定的细胞类型、组织或器官是特异性的。许多合适的启动子和增强子是本领域中已知的，并且任何这种合适的启动子或增强子均可用于表达本发明的转基因。本发明所使用的启动子是已知的，并且包括但不限于ParaBAD、阿拉伯糖、tac-启动子(Ptac)和组成型启动子(包括天然组成型启动子)([4]；还参见[10]，[8]，[9]，[29]，[11])。在某些实施方案中，所述启动子是ParaBAD或阿拉伯糖启动子。

可以使用本领中域已知的任何多种技术(包括用于将核酸分子或载体稳定转染或转化至宿主细胞中的那些)来进行将核酸分子并入革兰氏阴性细菌细胞。参见上面引用的参考文献以及[70]中列出和描述的技术。可使用方法(诸如电穿孔、通过热休克的化学转化、天然转化、噬菌体转导和接合)将重组核酸引入本发明的宿主细胞中。在某些实施方案中，使用质粒将重组核酸引入宿主细胞(例如，重组核酸通过质粒、诸如表达载体在宿主细胞中表达)。在另一个实施方案中，使用[71]中所述的插入方法将重组核酸引入宿主细胞。

并入本发明的糖基转移酶、修饰的载体蛋白、Pgl Otase或PglL聚糖底物的革兰氏阴性细菌细胞可以使用本领域中已知的各种方法来培养，例如，在液体培养液培养物中生长。由细胞产生的修饰的载体蛋白或O-糖基化的修饰的载体蛋白可以使用本领域中已知的各种方法(例如，凝集素亲和色谱法([1]))分离。

可以纯化O-糖基化的修饰的载体蛋白(以除去宿主细胞杂质和未糖基化的载体蛋白)，并且任选地通过本领域中已知的技术表征(参见例如[4]，[72]；还参见[10]，[8]，[9]，[29]和[11])。生物缀合物的纯化可以通过细胞裂解(包括例如一个或多个离心步骤)，随后为一个或多个分离步骤(包括例如一个或多个色谱步骤或分级分离、差异溶解、离心和/或色谱步骤的组合)。所述一个或多个色谱步骤可以包括离子交换、阴离子交换、亲和和/或施胶柱色谱(sizing column chromatography)，诸如Ni2+亲和色谱和/或大小排阻色谱。在一个特定实施方案中，一个或多个色谱步骤包括离子交换色谱。因此，可以将纯化的多肽中的一种或多种可操作地连接至标签(纯化标签)。例如，亲和柱IMAC(固定化金属离子亲和色谱)可用于结合可操作地连接至载体蛋白的聚组氨酸标签，随后进行阴离子交换色谱和大小排阻色谱(SEC)。例如，生物缀合物的纯化可以通过渗透压休克提取，随后进行阴离子和/或大小排阻色谱法([7])；或通过渗透压休克提取，随后进行Ni-NTA亲和和氟磷灰石色谱([4])。

为了在体外产生O-糖基化的修饰的载体蛋白，可以在例如缓冲液中将PglL OTase与修饰的载体蛋白和PglL聚糖底物一起孵育。在某些实施方案中，所述缓冲液具有近似6至近似8的pH。在一个方面，所述缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水。在另一个方面，所述缓冲液可以是具有7.5的pH的Tris-HCl 50 mM。

在某些实施方案中，使用利用已知方案的化学缀合(例如，[73]，[74]，[75])。由此，聚糖可以与修饰的载体蛋白的氨基酸残基共价连接(直接或通过接头)。本文的“直接连接”意指两个实体经由化学键(例如共价键)连接。本文的“间接连接”意指两个实体经由连接部分(“接头”)连接(与直接共价键相反)。在某些实施方案中，所述连接部分是己二酸二酰肼。在某些实施方案中，所述PglL聚糖底物通过可使用化学缀合方法获得的化学键共价连接至修饰的载体蛋白(直接或通过接头)，所述化学缀合方法选自碳二亚胺化学法、还原性胺化、氰化化学法(例如CDAP化学法)、马来酰亚胺化学法、酰肼化学法、酯化学法和N-羟基琥珀酰亚胺化学法。缀合物可以通过直接还原胺化方法进行制备，如[76]，[77]中所描述。其他方法描述于[78]，[79]，[80]。或者，缀合方法可以依赖使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)的聚糖活化，以形成氰酸酯。此类缀合物描述于[81]，[82]，[83]。还参见[84]。

然后可以通过本领域中已知的技术纯化和任选地表征糖基化的蛋白(即，缀合物)(参见例如[4]，[72]；还参见[8]，[9]，[ 10]，[11])。

本发明的O-糖基化的修饰的载体蛋白可以用作治疗剂用于治疗许多疾病，其中将有效量的O-糖基化的修饰的载体蛋白施用于需要这种治疗的受试者。当将有效量的O-糖基化的修饰载体蛋白施用于需要这种治疗的受试者时，本发明的O-糖基化的修饰的载体蛋白还可以用作疫苗或用于免疫原性组合物中以用于预防疾病。因此，本文所述的用于产生许多不同的O-糖基化的修饰的载体蛋白的方法将在疫苗学中被证明是非常有用的。

“同质性”意指聚糖长度的可变性和可能的糖基化位点的数目。上面列出的方法可用于此目的。SE-HPLC允许测量流体动力学半径。与具有较少糖基化位点的载体相比，载体中更高数目的糖基化位点导致流体动力学半径变化更大。然而，当分析单个聚糖链时，由于更受控的长度，它们可能更同质。聚糖长度通过肼解、SDS PAGE和CGE测量。此外，同质性也可能意味着某些糖基化位点的使用模式变为更宽/更窄的范围。这些因素可以通过糖肽LC-MS/MS来测量。

“生物缀合物的同质性”意指附接的糖残基的同质性，并且可以使用测量聚糖长度和流体动力学半径的方法进行评价。

将“产率”测量为在控制和优化的条件下从在生物反应器中生长的1升细菌生产培养物衍生的碳水化合物量。纯化生物缀合物后，碳水化合物产率可以通过蒽酮测定或使用碳水化合物特异性抗血清的ELISA直接测量。间接测量是可以的，这通过使用蛋白量(通过BCA、Lowry或bardford测定测量)和聚糖长度和结构来计算每克蛋白的理论碳水化合物量。另外，还可以通过从挥发性缓冲液中干燥糖蛋白制剂并使用天平来测量重量来测量产率。

可以使用各种方法来分析本发明的聚糖和缀合物，例如SDS-PAGE或毛细管凝胶电泳。O-抗原聚合物长度由线性组装的重复单元的数目限定。这意味着典型的类似梯形的模式是构成聚糖的不同重复单元数目的结果。因此，SDS PAGE(或按大小分开的其他技术)中的彼此相邻的两个条带仅通过单个重复单元而不同。在分析糖蛋白的聚糖大小时发现了这些离散差异：非糖基化载体蛋白和具有不同聚合物链长度的生物缀合物根据其电泳迁移率分离。测量生物缀合物上存在的第一可检测重复单元数(n

在另一个实施方案中，可以应用高质量MS和大小排阻HPLC来测量完整生物缀合物的大小。

在另一个实施方案中，可以使用蒽酮 - 硫酸测定法来测量多糖产率。参见[85]。在另一个实施方案中，可以使用甲基戊糖测定法来测量多糖产率。参见例如[86]。

糖基化位点使用可以通过例如糖肽LC-MS/MS进行定量：用蛋白酶消化缀合物，并通过合适的色谱方法(C18，亲水性相互作用HPLC HILIC，GlycoSepN柱，SE HPLC，AE HPLC)分离肽，并使用MS / MS鉴定不同的肽。这种方法可以与或不与通过化学(史密斯降解)或酶促方法预先缩短糖链一起使用。使用在215-280nm处的UV检测对糖肽峰进行定量允许相对测定糖基化位点的使用。在另一个实施方案中，通过大小排阻HPLC：通过从SE HPLC柱的较早洗脱时间反映更高的糖基化位点使用。

提供了包含修饰的载体蛋白的组合物。在某些实施方案中，所述修饰的载体蛋白是O-糖基化的。在某些实施方案中，与修饰的载体蛋白可操作连接的聚糖是免疫原性的，并且因此该组合物是免疫原性组合物。

“免疫原性组合物”、“疫苗组合物”或“药物组合物”是经配制为允许活性成分的生物活性有效的制剂，并且其不含对会向其施用组合物的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。免疫原性、疫苗或药物组合物包含药物级活性成分(例如，药物级抗原)，因此，本发明的免疫原性、疫苗或药物组合物不同于任何例如天然存在的组合物。参见[87]。在某些实施方案中，所述免疫原性、疫苗或药物组合物是无菌的。在某些实施方案中，所述组合物是包含“免疫原性缀合物”(例如，与免疫原性聚糖共价连接的修饰的载体蛋白)的免疫原性组合物。在某些实施方案中，所述免疫原性聚糖是O-抗原。免疫原性组合物包含免疫学有效量的免疫原性聚糖或免疫原性缀合物。“免疫有效量”可以作为单剂量或作为系列的一部分施用于个体。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的佐剂、赋形剂、载体或稀释剂。佐剂、赋形剂、载体和稀释剂本身不诱导抗体或免疫应答，但是它们提供引发或增强对抗原(例如，免疫原性聚糖)的抗体或免疫应答的技术效果。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物是单价制剂。在其他实施方案中，本发明的免疫原性组合物是多价制剂，例如二价、三价和四价制剂。例如，多价制剂包含两种或更多种免疫原性的修饰的载体蛋白(例如，包含第一免疫原性聚糖的第一免疫原性的O-糖基化的修饰的载体蛋白和包含第二免疫原性聚糖的至少第二免疫原性的O-糖基化的修饰的载体蛋白，其任选地进一步含有包含第三免疫原性聚糖的第三免疫原性的O-糖基化的修饰的载体蛋白)。在进一步实施方案中，多价免疫原性组合物包含直接或间接附接至两种或更多种不同的免疫原性聚糖的O-糖基化的修饰的载体蛋白。

还提供了制备免疫原性组合物的方法，其包括将本发明的免疫原性缀合物(例如，包含免疫原性聚糖的O-糖基化的修饰的载体蛋白)与药学上可接受的佐剂、赋形剂或稀释剂混合的步骤。

提供了诱导哺乳动物(例如，人哺乳动物)中的抗体应答的方法，其包括向所述哺乳动物施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。还提供了用于诱导哺乳动物中的抗体或免疫应答的免疫原性组合物。提供了免疫原性组合物，其用于制备用于诱导哺乳动物中的抗体或免疫应答的药物。

肺炎链球菌是全球重要的封装的人病原体。肺炎链球菌(肺炎链球菌，肺炎球菌)是革兰氏阳性细菌，其导致相当大的发病率和死亡率(尤其是在婴儿和老年人中)，引起侵袭性疾病，诸如菌血症和脑膜炎，肺炎和其他非侵入性疾病，诸如急性中耳炎。在标准医学教科书中，由肺炎链球菌引起的主要临床综合征被广泛认可和讨论。例如，侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)被定义为从血液或另一正常无菌部位分离肺炎链球菌的任何感染。本文提供了用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的免疫原性组合物，所述疾病例如肺炎、侵袭性肺炎球菌病(IPD)、慢性阻塞性肺病的恶化(eCOPD)、中耳炎、脑膜炎、菌血症、肺炎和/或结膜炎。提供了免疫原性组合物，其用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的免疫应答。还提供了免疫原性组合物，其用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的抗体或免疫应答。提供了免疫原性组合物，其用于制备用于诱导哺乳动物中针对肺炎链球菌聚糖的抗体或免疫应答的药物。

由肺炎链球菌感染引起的疾病可以选自肺炎、侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)、慢性阻塞性肺病的恶化(eCOPD)、中耳炎、脑膜炎、菌血症、肺炎和/或结膜炎。在人哺乳动物是婴儿(在本发明的上下文中定义为0-2岁)的情况下，该疾病可以选自中耳炎、脑膜炎、菌血症、肺炎和/或结膜炎。在一个方面，在人哺乳动物是婴儿(在本发明的上下文中定义为0-2岁)的情况下，该疾病选自中耳炎和/或肺炎。在人哺乳动物是老年人(即50岁或更多岁，通常超过55岁且更通常超过60岁)的情况下，该疾病可以选自肺炎、侵袭性肺炎球菌病(IPD)和/或慢性阻塞性肺病的恶化(eCOPD)。在一个方面，在人哺乳动物是老年人的情况下，该疾病是侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)。在另一个方面，在人哺乳动物是老年人的情况下，该疾病是慢性阻塞性肺病的恶化(eCOPD)。

佐剂是用于免疫原性和疫苗组合物中的非抗原组分，以增强和调节对抗原的免疫或抗体应答。众所周知的是，佐剂增强抗原的免疫作用的诱导、幅度和/或寿命。佐剂是一种化合物，当单独施用该化合物时，其不生成对抗原的免疫或抗体应答。

除了抗原以外，本发明的免疫原性和疫苗组合物还可以包含佐剂。在某些实施方案中，所述佐剂是药物级的。佐剂可以在施用免疫原性或疫苗组合物之前、同时或之后施用。

佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A、MF59, AS03, AS04, 聚山梨醇酯80(TWEEN 80)、咪唑并吡啶化合物(参见[88])、咪唑并喹喔啉化合物(参见[89])、CpG ([90])或含有未甲基化的CpG的寡核苷酸[91])和皂苷诸如QS21(参见[92])。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其他佐剂是任选地与免疫刺激剂(诸如单磷酰脂质A)组合的水包油型乳液(诸如角鲨烯或花生油)(参见[93])。在某些实施方案中，所述佐剂是水包油乳剂(例如MF59和AS03)，脂质体(例如3-o-去酰基-4'-单磷酰脂质A (MPL))和/或皂苷(例如，QS21)(例如AS01)，TLR2激动剂，TLR3激动剂，TLR4激动剂，TLR5激动剂，TLR6激动剂，TLR7激动剂，TLR8激动剂，TLR9激动剂，铝盐，纳米颗粒，微粒，ISCOMS，氟化钙，有机化合物复合物或其组合。参见例如[94]，[95]和[96]。在一个具体实施方案中，本发明的免疫原性或疫苗组合物包含抗原和佐剂，其中所述佐剂是水包油乳剂(例如MF59和AS03及其各自的亚型，包括亚型B和E)，铝盐(例如，磷酸铝和氢氧化铝)，脂质体，皂苷(例如QS21)，Toll样受体的激动剂(TLRa)(例如，TLR4a和TLR7a)或其组合(例如Alum-TLR7a ([97])。“TLR激动剂”意指能够通过TLR信号传导途径引起信号传导应答的组分，其作为直接配体，或者通过内源性或外源性配体的生成而间接引起([98])。例如，TLR4激动剂能够通过TLR-4信号传导途径引起信号应答。TLR-4激动剂的合适实例是脂多糖，合适地是脂质A的无毒衍生物，尤其是单磷酰脂质A或更具体地3-脱酰基单磷酰脂质A (3D-MPL)。在某些实施方案中，所述免疫原性或疫苗组合物包含一种或多种佐剂。

在某些实施方案中，所述佐剂是单磷酰脂质A (诸如3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL))或其衍生物，或单磷酰脂质A连同铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳液的组合。在某些实施方案中，所述佐剂包含QS21、3D-MPL和生育酚于水包油乳剂中的制剂([99])。

药学上可接受的赋形剂可以由本领域技术人员选择。例如，所述药学上可接受的赋形剂可以是缓冲剂，诸如Tris(三甲胺)，磷酸盐(例如磷酸钠、蔗糖磷酸盐谷氨酸盐)，乙酸盐，硼酸盐(例如硼酸钠)，柠檬酸盐，甘氨酸，组氨酸和琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)，合适地，氯化钠，组氨酸，磷酸钠或琥珀酸钠。药学上可接受的赋形剂可以包括盐，例如氯化钠、氯化钾或氯化镁。任选地，药学上可接受的赋形剂包含至少一种稳定溶解度和/或稳定性的组分。增溶剂/稳定剂的实例包括去污剂，例如月桂肌氨酸和/或聚山梨醇酯(例如TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))。稳定剂的实例还包括泊洛沙姆(例如泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407)。药学上可接受的赋形剂可以包括非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、TWEEN 80(聚山梨醇酯-80)、TWEEN 60（聚山梨醇酯-60)、TWEEN 40(聚山梨醇酯-40)和TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)或聚氧乙烯烷基醚(适合地，聚山梨醇酯-80)。替代的增溶剂/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成的多元醇(诸如蔗糖、海藻糖等)。药物赋形剂可以是防腐剂，例如苯酚、2-苯氧基乙醇或硫柳汞。其他药学上可接受的赋形剂包括糖(例如乳糖、蔗糖)和蛋白(例如明胶和白蛋白)。本发明所用的药学上可接受的赋形剂包括盐水溶液、水性右旋糖和甘油溶液(本领域中也称为“载体”或“填充剂”)。许多药学上可接受的赋形剂描述于例如[100]。

本发明的免疫原性组合物还可以包含稀释剂，诸如盐水和甘油。另外，免疫原性组合物可以包含辅助物质，诸如润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质和/或多元醇。

本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸钾铝)或此类铝盐的混合物)。

本发明的免疫原性组合物还可以包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞或2-苯氧基乙醇。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含0.001%至0.01%硫柳汞。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含0.001%至0.01% 2-苯氧基乙醇。

本发明的免疫原性组合物还可以包含去污剂，例如聚山梨醇酯，诸如TWEEN 80(聚山梨醇酯80)。去污剂可以以低水平(例如<0.01%)存在，但已经提出更高水平用于稳定抗原制剂，例如最高达10%。

本发明的免疫原性组合物或疫苗可以用于通过经由全身性或粘膜途径向哺乳动物施用所述免疫原性组合物或疫苗组合物来诱导免疫或抗体应答和/或保护或治疗易于感染的所述哺乳动物。这些施用可以包括经由肌肉内(IM)、腹膜内、皮内(ID)或皮下途径注射；或经由向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的粘膜施用。例如，可以使用鼻内(IN)施用。尽管本发明的免疫原性组合物或疫苗可以作为单次剂量施用，但其组分也可以同时或在不同时间一起共施用。对于共同施用，任选的佐剂例如可以存在于任何或所有不同的施用中，然而，在本发明的一个具体方面，其与免疫原性的O-糖基化的修饰的载体蛋白组合存在。除了施用的单一途径以外，可以使用2种不同的施用途径。在初始接种疫苗后，受试者可以接受足够间隔开的一次或几次加强免疫。

实施例

应理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且将向本领域技术人员提示鉴于此的各种修饰或变化并且将其包括在本申请的精神和范围之内。

实施例1

使用含有多糖生物合成簇(O-抗原或荚膜多糖)的染色体拷贝以及表达PglL和修饰的载体蛋白的两种质粒的O-抗原脂多糖连接酶基因

如先前([101])所述，通过考马斯亮蓝染色或Western印迹分析生产过程。在硝酸纤维素膜上印迹后，将样品用抗His、抗聚糖或抗载体蛋白免疫染色。抗兔IgG-HRP(Biorad)被用作二抗。用ECL™ Western印迹检测试剂(Amersham Biosciences, LittleChalfont Buchinghamshire)实施检测。

对于周质蛋白提取，通过以10,000g离心20 min来收获细胞，并重悬浮于1体积的0.9% NaCl中。通过在25-30 min期间以7,000g离心来沉淀细胞。将细胞重悬浮于悬浮缓冲液(25%蔗糖，100mM EDTA 200mM Tris HCl pH 8.5，250 OD/ml)中，并将悬浮液在搅拌下在4-8℃下孵育30 min。将悬浮液在4-8℃下在30 min期间以7,000-10,000g离心。丢弃上清液，将细胞重悬浮于相同体积的冰冷的20 mM Tris HCl pH 8.5中，并在搅拌下在4-8℃下在30 min期间孵育。将成球细胞(spheroblast)在4-8℃下在25-30 min期间以10,000 g离心，收集上清液并通过0.2 g膜。将周质提取物加载在7.5% SDS-PAGE上，并用考马斯染色用于鉴定。

为了纯化生物缀合物，将含有从100,000 OD的细胞获得的周质蛋白的上清液加载在用缓冲液A (20 mM Tris HCl pH 8.0)平衡的Source Q阴离子交换柱(XK 26/40≈180ml床材料)上。用5倍柱体积(CV)缓冲液A洗涤后，用15CV至50%缓冲液B (20 mM Tris HCl+1M NaCl pH 8.0)和然后2CV至100%缓冲液B的线性梯度洗脱蛋白。蛋白通过SDS-PAGE分析，并通过考马斯染色。生物缀合物可以在6-17 mS之间的电导率洗脱。将样品浓缩10倍，并将缓冲液更换为20 mM Tris HCl pH 8.0。

将生物缀合物加载在用缓冲液A：20mM Tris HCl pH 8.0平衡的Source Q柱(XK16/20≈28 ml床材料)上。上面使用的相同梯度用于洗脱生物缀合物。蛋白通过SDS-PAGE分析，并通过考马斯染色。通常，生物缀合物在6-17 mS之间的电导率洗脱。将样品浓缩10倍，并将缓冲液更换为20 mM Tris HCl pH 8.0。

将生物缀合物加载在用20mM Tris HCl pH 8.0平衡的Superdex 200 (Hi Load26/60，制备级)上。来自Superdex 200柱的蛋白级分通过SDS-PAGE分析，并通过考马斯染色进行染色。

来自不同纯化步骤的生物缀合物通过SDS-PAGE分析，并通过考马斯染色。使用该方法将生物缀合物纯化至超过98%的纯度。使用该技术可以成功地产生生物缀合物。

假单胞菌外毒素A (EPA)载体蛋白(SEQ ID NO:1)被修饰以并入一个或多个来自脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白PilE的GlycoTag (作为SEQ ID NO:137提供的野生型序列)(对于方法，参见[29]；[6]；[4]和[31]，全部通过引用以其整体并入本文)。对重组EPA (rEPA，SEQID NO:1)进行修饰，以制备其他三种重组EPA蛋白：

- 第一个已经被修饰为在其N-末端并入

- 第二个已经被修饰为在关于SEQ ID NO:1()的内部残基A375处并入

- 第三个已被修饰为在其C-末端并入

将脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

在三种不同的温度(-80℃、2-8℃和室温(RT)20-25℃)下持续六个月的时间研究rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原生物缀合物的稳定性。另外，对纯化的rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原进行五个冷冻/解冻循环(5 FT)。在零个月、两周、一个月、三个月和六个月时采集的样品的SEC-HPLC读出值揭示，rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原生物缀合物峰面积随时间恒定。图3。对于进行五个冷冻/解冻循环的样品，观察到相同的结果。没有观察到降解产物，并且仅观察到少量的聚集。生物缀合物具有随时间良好的稳定性。图3。

为了评估rEPA1-宋内志贺氏菌O-抗原生物缀合物的免疫原性，将四只雌性新西兰白兔(3-4月龄)分为两组(每组两只兔)，并在0、7、10和18天用包含2 µg糖、40 µg蛋白和非弗氏佐剂(第1组)或10 µg糖、200 µg蛋白和非弗氏佐剂(第2组)的生物缀合物组合物皮下注射。在零、二十一和二十八天进行采血。在第二十八天采集的血液样品的Western印迹揭示，在所有受试者中都生成针对宋内志贺氏菌O-抗原和EPA的抗体(图4)，其中2 µg剂量(图4A)诱导比10 μg剂量(图4B)更好的抗体应答。这些结果显示，

为了评估在载体蛋白上使用多个GlycoTag的技术可行性，对EPA进行修饰，以并入一个或两个拷贝的具有序列SEQ ID NO:9的

这些结果显示，经修饰以并入多于一个GlycoTag的载体蛋白可用于体内生物缀合。

为了评估

表1：

+) 检测到转移

++) 良好的转移

+++) 有效的转移。

关于肺炎球菌Sp15A CPS的结果是不确定的，因为未检测到Sp15A CPS的转移，但检测到肺炎球菌Sp14 CPS的转移并且Sp15A和Sp14 CPS两者均具有还原末端结构半乳糖-β1,4-葡萄糖-UndPP。

脑膜炎奈瑟氏菌PglL同源物的鉴定和表征

鉴定了二十种奈瑟氏菌PglL蛋白，其各自来自不同的奈瑟氏菌属物种。使用建立的方法，首先针对其将宋内志贺氏菌O-抗原(通过由wbgT、wbgU、wzx、wxy、wbgV、wbgW、wbgX、wbgY和wbgZ基因组成的操纵子(编码SEQ ID NO:208-216的蛋白)制成，其制成具有还原末端结构N-乙酰基-altruronic acid-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-岩藻糖胺的糖)7转移至内源性菌毛蛋白上的能力，以及具有与

表2

显示

设计并产生二十二种修饰的EPA载体蛋白，其各自在内部残基处并入一个拷贝的具有序列SEQ ID NO:140 (29个氨基酸序列，对应于

图7A(描绘EPA残基1.-20.)和图7B(描绘EPA残基21.-22.)。

为了评估向位于载体蛋白内的GlycoTag(即“内部GlycoTag”)的聚糖转移，将编码

从淋病奈瑟氏菌(

使用建立的方法，修饰EPA载体蛋白(SEQ ID NO:1)，以并入一个拷贝的GlycoTag，所述GlycoTag来自

- 第一种EPA已经被修饰为在其N-末端并入

- 第二种EPA已经被修饰为在其N-末端并入

- 第三种EPA已经被修饰为在其N-末端并入

- 第四种EPA已经被修饰为在其N-末端并入

- 第五种EPA已经被修饰为在其N-末端并入

- 第六种EPA已经被修饰为在其N-末端并入

使用Western印迹测定法来确定

这些结果显示，PglL (

设计并产生修饰的EPA载体蛋白，其各自并入一个或两个拷贝的淋病奈瑟氏菌菌毛蛋白GlycoTag序列。内部EPA残基R274、S408和/或A519(相对于SEQ ID NO:1编号)被具有序列SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146(分别为对应于

使用建立的方法，将编码淋病奈瑟氏菌PglL (

表4

这些结果显示，内部残基R274或A519被GlycoTag序列SEQ ID NO:145和146取代的修饰的EPA载体蛋白对于经由

这些结果还显示，内部残基S408被GlycoTag序列SEQ ID NO:145取代的修饰的EPA载体蛋白对于经由

内部残基S408被GlycoTag序列SEQ ID NO:146取代的修饰的EPA载体蛋白对于经由

比较

使用建立的方法，将编码

这些结果显示，当将GlycoTag引入载体蛋白(在此为EPA)的N-末端或内部残基时，

评价在实施例3中描述的

使用建立的方法，将编码来自肺炎球菌血清型Sp8或Sp22A的CPS的核苷酸序列，以及编码二十一种奈瑟氏菌PglL蛋白之一的核苷酸序列，和编码rEPA1的核苷酸序列，可操作地引入大肠杆菌

考马斯蓝染色和Western印迹测定证实，

表5

实施例9

菌毛蛋白结构的比较

所有例举的修饰的载体蛋白(rEPA序列以及mAcrA、mPcrv和mCrm197) - SEQ IDNO:51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202和204。

仅仅rEPA修饰的载体蛋白序列 - SEQ ID NO:51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135。

用NmPglL和宋内志贺氏菌O-抗原测定的修饰的载体蛋白(参见实施例1的rEPA；实施例2；以及实施例4、5和7的Acr、Pcr和Crm197) - SEQ ID NO:51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202和204

用NgPgL和宋内志贺氏菌O-抗原测定的修饰的载体蛋白(参见实施例5、6和7) -SEQ ID NO:101、113、115、117、121、123、125、127、129,131和133。

** 序列特征在优先权申请的说明书中举例说明(例如，经由加下划线) **

SEQ ID NO:1

假单胞菌外毒素A (EPA)氨基酸序列(成熟序列/除去信号序列)。对应于NCBI参考序列WP_016851883.1。

SEQ ID NO:2

假单胞菌外毒素A (EPA)氨基酸序列(信号序列加下划线)。对应于NCBI参考序列WP_016851883.1。

SEQ ID NO:3

假单胞菌外毒素A (EPA)多核苷酸序列。对应于NCBI登录号JX026663.1。

SEQ ID NO:4

DsbA信号序列。

SEQ ID NO:5

DsbA信号肽多核苷酸序列。

SEQ ID NO:6

类志贺邻单胞菌O17(即宋内志贺氏菌) O-抗原簇核苷酸序列(包含wbgT、wbgU、wzx、wxy、wbgV、wbgW、wbgX、wbgY和wbgZ编码区；10963 bp)。对应于NCBI GenBank登录号AF285970.1. [102]。

SEQ ID NO:7

PelB信号序列。

SEQ ID NO:8

脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

SEQ ID NO:9

脑膜炎奈瑟氏菌PglL (

SEQ ID NO:10

淋病奈瑟氏菌PglL (

SEQ ID NO:11

淋病奈瑟氏菌PglL (

SEQ ID NO:12

乳糖奈瑟氏菌020-06PglL (

SEQ ID NO:13

乳糖奈瑟氏菌020-06PglL (

SEQ ID NO:14

乳糖奈瑟氏菌ATCC 23970 PglL (

SEQ ID NO:15

乳糖奈瑟氏菌ATCC 23970 PglL (

SEQ ID NO:16

淋病奈瑟氏菌F62PglL (

SEQ ID NO:17

淋病奈瑟氏菌F62PglL (

SEQ ID NO:18

灰色奈瑟氏菌ATCC 14685 PglL多核苷酸序列。对应于NCBI GenBank登录号EEZ72274.1。

SEQ ID NO:19

灰色奈瑟氏菌ATCC 14685 PglL氨基酸序列。对应于NCBI GenBank登录号EEZ72274.1。

SEQ ID NO:20

粘液奈瑟氏菌PglL多核苷酸序列。对应于NCBI GenBank登录号KGJ31457.1。

SEQ ID NO:21

粘液奈瑟氏菌PglL氨基酸序列。对应于NCBI GenBank登录号KGJ31457.1。

SEQ ID NO:22

浅黄奈瑟氏菌NRL30031/H210PglL多核苷酸序列。对应于NCBI GenBank登录号EEG34481.1。

SEQ ID NO:23

浅黄奈瑟氏菌NRL30031/H210PglL氨基酸序列。对应于NCBI GenBank登录号EEG34481.1。

SEQ ID NO:24

粘液奈瑟氏菌ATCC 25996PglL (

SEQ ID NO:25

粘液奈瑟氏菌ATCC 25996PglL (

SEQ ID NO:26

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元014菌株F0314 PglL多核苷酸序列。对应于NCBIGenBank登录号EFI23064.1。

SEQ ID NO:27

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元014菌株F0314 PglL氨基酸序列。对应于NCBIGenBank登录号EFI23064.1。

SEQ ID NO:28

SEQ ID NO:29

SEQ ID NO:30

沙伊甘氏奈瑟氏菌871PglL (

SEQ ID NO:31

沙伊甘氏奈瑟氏菌871PglL (

SEQ ID NO:32

沙伊甘氏奈瑟氏菌871PglL (

SEQ ID NO:33

沙伊甘氏奈瑟氏菌871PglL (

SEQ ID NO:34

奈瑟氏菌属物种

SEQ ID NO:35

奈瑟氏菌属物种

SEQ ID NO:36

SEQ ID NO:37

SEQ ID NO:38

长奈瑟氏菌糖解亚种ATCC 29315 PglL (

SEQ ID NO:39

长奈瑟氏菌糖解亚种ATCC 29315 PglL (

SEQ ID NO:40

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200PglL (

SEQ ID NO:41

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200PglL (

SEQ ID NO:42

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元

SEQ ID NO:43

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元

SEQ ID NO:44

奈瑟氏菌属物种

SEQ ID NO:45

奈瑟氏菌属物种

SEQ ID NO:46

SEQ ID NO:47

SEQ ID NO:48

恒河猴奈瑟氏菌ATCC 33926PglL多核苷酸序列。对应于NCBI GenBank登录号EGQ77792.1

SEQ ID NO:49

恒河猴奈瑟氏菌ATCC 33926 PglL氨基酸序列。对应于NCBI GenBank登录号EGQ77792.1

SEQ ID NO:50

rEPA1多核苷酸序列。

SEQ ID NO:51

rEPA1氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140(DsbA信号序列加下划线，GlycoTag和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加双下划线)

SEQ ID NO:52

rEPA2多核苷酸序列。

SEQ ID NO:53

rEPA2氨基酸序列 - 在残基A375处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列和GlycoTag加下划线，6xHis标签(SEQ ID NO:217)加双下划线)

SEQ ID NO:54

rEPA3多核苷酸序列。

SEQ ID NO:55

rEPA3氨基酸序列 - 在C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列和GlycoTag加下划线，6xHis标签(SEQ ID NO:217)加双下划线)

SEQ ID NO:56

rEPA4多核苷酸序列 – 在残基A14处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:57

rEPA4氨基酸序列 - 在残基A14处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:58

rEPA5多核苷酸序列 – 在残基D36处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:59

rEPA5氨基酸序列 - 在残基D36处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:60

rEPA6多核苷酸序列 – 在残基Q92处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:61

rEPA6氨基酸序列 - 在残基Q92处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:62

rEPA7多核苷酸序列 – 在残基G123处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:63

rEPA7氨基酸序列 - 在残基G123处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:64

rEPA8_E157_核苷酸。

SEQ ID NO:65

rEPA8氨基酸序列 - 在残基E157处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:66

rEPA9多核苷酸序列 – 在残基A177处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:67

rEPA9氨基酸序列 - 在残基A177处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:68

rEPA10多核苷酸序列 – 在残基Y208处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:69

rEPA10氨基酸序列 - 在残基Y208处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:70

rEPA11多核苷酸序列 – 在残基N231处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:71

rEPA11氨基酸序列 - 在残基N231处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:72

rEPA12多核苷酸序列 – 在残基E252处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:73

rEPA12氨基酸序列 - 在残基E252处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:74

rEPA13多核苷酸序列 – 在残基R274处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:75

rEPA13氨基酸序列 - 在残基R274处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:76

rEPA14多核苷酸序列 – 在残基A301处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:77

rEPA14氨基酸序列 - 在残基A301处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:78

rEPA15多核苷酸序列 – 在残基Q307处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:79

rEPA15氨基酸序列 - 在残基Q307处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:80

rEPA16多核苷酸序列 – 在残基A365处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:81

rEPA16氨基酸序列 - 在残基A365处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:82

rEPA17多核苷酸序列 – 在残基S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:83

rEPA17氨基酸序列 - 在残基S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:84

rEPA18多核苷酸序列 – 在残基T418处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:85

rEPA18氨基酸序列 - 在残基T418处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:86

rEPA19多核苷酸序列 – 在残基A464处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:87

rEPA19氨基酸序列 - 在残基A464处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:88

rEPA20多核苷酸序列 – 在残基A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:89

rEPA20氨基酸序列 - 在残基A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:90

rEPA21多核苷酸序列 – 在残基G525处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:91

rEPA21氨基酸序列 - 在残基G525处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:92

rEPA22多核苷酸序列 – 在残基H533处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:93

rEPA22氨基酸序列 - 在残基H533处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:94

rEPA23多核苷酸序列 – 在残基S585处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:95

rEPA23氨基酸序列 - 在残基S585处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:96

rEPA24多核苷酸序列 - 在残基K240处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:97

rEPA24氨基酸序列 - 在残基K240处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:98

rEPA25多核苷酸序列 – 在残基A375处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:99

rEPA25氨基酸序列 - 在残基A375处的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列、GlycoTag加下划线，且6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线)。

SEQ ID NO:100

rEPA26多核苷酸序列 – 在N-末端的GlycotTag序列SEQ ID NO:145。

SEQ ID NO:101

rEPA26氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:145 (DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线，GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:102

rEPA27多核苷酸序列 – 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:150。

SEQ ID NO:103

rEPA27氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:150 (DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线，GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:104

rEPA28多核苷酸序列 – 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:154。

SEQ ID NO:105

rEPA28氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:154 (DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线，GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:106

rEPA29多核苷酸序列 – 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:157。

SEQ ID NO:107

rEPA29氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:157 (DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线，GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:108

rEPA30多核苷酸序列 – 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:160。

SEQ ID NO:109

rEPA30氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:160 (DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线，GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:110

rEPA31多核苷酸序列 – 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:163。

SEQ ID NO:111

rEPA31氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:163 (DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线，GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:112

rEPA32多核苷酸序列 – 在残基R274处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145。

SEQ ID NO:113

rEPA32氨基酸序列 - 在残基R274处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:114

rEPA33多核苷酸序列 – 在残基S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145。

SEQ ID NO:115

rEPA33氨基酸序列 - 在残基S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:116

rEPA34多核苷酸序列 – 在残基A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145。

SEQ ID NO:117

rEPA34氨基酸序列 - 在残基A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:118

rEPA35多核苷酸序列 – 在残基S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146。

SEQ ID NO:119

rEPA35氨基酸序列 - 在残基S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:120

rEPA36多核苷酸序列 – 在残基A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146。

SEQ ID NO:121

rEPA36氨基酸序列 - 在残基A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:122

rEPA37多核苷酸序列 – 在残基R274和S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146。

SEQ ID NO:123

rEPA37氨基酸序列 - 在残基R274和S408处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:124

rEPA38多核苷酸序列 – 在残基R274和A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146。

SEQ ID NO:125

rEPA38氨基酸序列 - 在残基R274和A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:126

rEPA39多核苷酸序列 – 在残基S408和A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146。

SEQ ID NO:127

rEPA39氨基酸序列 - 在残基S408和A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:128

rEPA40多核苷酸序列 – 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:145。

SEQ ID NO:129

rEPA40氨基酸序列 - 在N-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:145(DsbA信号序列加下划线，GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:130

rEPA41多核苷酸序列 – 在残基R274处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146。

SEQ ID NO:131

rEPA41氨基酸序列 - 在残基R274处的GlycoTag序列SEQ ID NO:146 (DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:132

rEPA42多核苷酸序列 – 在残基R274和A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145。

SEQ ID NO:133

rEPA42氨基酸序列 - 在残基R274和A519处的GlycoTag序列SEQ ID NO:145(DsbA信号序列和GlycoTag加下划线)。

SEQ ID NO:134

rEPA43多核苷酸序列 – 在N-末端和C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140。

SEQ ID NO:135

rEPA43氨基酸序列 - 在N-末端和C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线；GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:136

成熟的rEPA43氨基酸序列(即，除去信号序列) - 在N-末端和C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (6xHis标签(SEQ ID NO:217)加下划线；GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:137

脑膜炎奈瑟氏菌MC58 PilE氨基酸序列(成熟序列；除去信号序列)。对应于NCBI登录号NP_273084.1。

SEQ ID NO:138

脑膜炎奈瑟氏菌MC58 PilE氨基酸序列(信号序列加下划线)。对应于NCBI登录号NP_273084.1。

SEQ ID NO:139

脑膜炎奈瑟氏菌MC58 PilE多核苷酸序列。对应于NCBI参考序列NC_003112.2的17741-17229。

SEQ ID NO:140

脑膜炎奈瑟氏菌PilE GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:137的残基45-73；29个氨基酸长)。例如Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro GlyAsn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys。

SEQ ID NO:141

脑膜炎奈瑟氏菌PilE GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:137的残基55-73；19个氨基酸长)。例如Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr SerSer Glu Ile Lys。

SEQ ID NO:142

脑膜炎奈瑟氏菌PilE GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:137的残基55-66；12个氨基酸长)。例如Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val。

SEQ ID NO:143

淋病奈瑟氏菌菌毛蛋白(

SEQ ID NO:144

淋病奈瑟氏菌菌毛蛋白(

SEQ ID NO:145

淋病奈瑟氏菌GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:143的残基52-81；30个氨基酸长)。例如Ser Ala Val Thr Gly Tyr Tyr Leu Asn His Gly Thr Trp Pro Lys AspAsn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser Pro Thr Asp Ile Lys。

SEQ ID NO:146

淋病奈瑟氏菌GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:143的残基62-81；20个氨基酸长)。例如Gly Thr Trp Pro Lys Asp Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser ProThr Asp Ile Lys。

SEQ ID NO:147

淋病奈瑟氏菌GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:143的残基62-73；12个氨基酸长)。例如Gly Thr Trp Pro Lys Asp Asn Thr Ser Ala Gly Val。

SEQ ID NO:148

乳糖奈瑟氏菌020-06菌毛蛋白(

SEQ ID NO:149

乳糖奈瑟氏菌020-06菌毛蛋白(

SEQ ID NO:150

乳糖奈瑟氏菌020-06 GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:148的残基52-86；35个氨基酸长)。例如Ala Ala Val Val Glu Tyr Tyr Ser Asp Asn Gly Thr Phe Pro AlaGln Asn Ala Ser Ala Gly Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ile Thr Gly Lys Tyr Val AlaLys。

SEQ ID NO:151

乳糖奈瑟氏菌020-06 GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:148的残基62-73；12个氨基酸长)。例如Gly Thr Phe Pro Ala Gln Asn Ala Ser Ala Gly Ile。

SEQ ID NO:152

长奈瑟氏菌糖解亚种ATCC 29315菌毛蛋白(

SEQ ID NO:153

长奈瑟氏菌糖解亚种ATCC 29315菌毛蛋白(

SEQ ID NO:154

长奈瑟氏菌糖解亚种ATCC 29315 GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:153的残基52-97；45个氨基酸长)。

SEQ ID NO:155

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200 (

SEQ ID NO:156

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200 (

SEQ ID NO:157

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200 GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:156的残基57-93；37个氨基酸长)。

SEQ ID NO:158

粘液奈瑟氏菌ATCC 25996 (

SEQ ID NO:159

粘液奈瑟氏菌ATCC 25996 (

SEQ ID NO:160

粘液奈瑟氏菌ATCC 25996 GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:159的残基52-92；41个氨基酸长)。

SEQ ID NO:161

沙伊甘氏奈瑟氏菌871 (

SEQ ID NO:162

沙伊甘氏奈瑟氏菌871 (

SEQ ID NO:163

沙伊甘氏奈瑟氏菌871 GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:162的残基53-83；31个氨基酸长)。例如Gly Ala Val Thr Glu Tyr Glu Ala Asp Lys Gly Val Phe ProThr Ser Asn Ala Ser Ala Gly Val Ala Ala Ala Ala Asp Ile Asn Gly Lys。

SEQ ID NO:164

沙伊甘氏奈瑟氏菌871 GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:162的残基63-74；12个氨基酸长)。例如Gly Val Phe Pro Thr Ser Asn Ala Ser Ala Gly Val。

SEQ ID NO:165

乳糖奈瑟氏菌ATCC 23970菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEEZ75637.1。

SEQ ID NO:166

淋病奈瑟氏菌F62菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank EFF40919.1。

SEQ ID NO:167

灰色奈瑟氏菌ATCC 14685菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEEZ70774.1。

SEQ ID NO:168

灰色奈瑟氏菌ATCC 14685菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEEZ70775.1。

SEQ ID NO:169

粘液奈瑟氏菌菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank KGJ31398.1。

SEQ ID NO:170

粘液奈瑟氏菌菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank KGJ31397.1。

SEQ ID NO:171

浅黄奈瑟氏菌NRL30031/H210菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEEG33288.1。

SEQ ID NO:172

粘液奈瑟氏菌ATCC 25996菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEFC89512.1。

SEQ ID NO:173

粘液奈瑟氏菌ATCC 25996菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEFC89511.1。

SEQ ID NO:174

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元014菌株F0314菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBIGenBank EFI23295.1。

SEQ ID NO:175

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元014菌株F0314菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBIGenBank EFI23294.1。

SEQ ID NO:176

SEQ ID NO:177

沙伊甘氏奈瑟氏菌871菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank EGY51595.1。与SEQ ID NO:162和179的100%同一性。

SEQ ID NO:178

沙伊甘氏奈瑟氏菌871菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank. EGY51594 (=ID 180)。

SEQ ID NO:179

沙伊甘氏奈瑟氏菌871菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank EGY51595.1。与SEQ ID NO:162和177的100%同一性。

SEQ ID NO:180

沙伊甘氏奈瑟氏菌871菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank EGY51594.1。

SEQ ID NO:181

奈瑟氏菌属物种83E34菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank KPN71218.1。

SEQ ID NO:182

奈瑟氏菌属物种83E34菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank KPN71186.1。

SEQ ID NO:183

SEQ ID NO:184

SEQ ID NO:185

长奈瑟氏菌糖解亚种ATCC 29315菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEFE49587.1。

SEQ ID NO:186

长奈瑟氏菌糖解亚种ATCC 29315菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEFE49588.1。与SEQ ID NO:153的100%同一性。

SEQ ID NO:187

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGF04823.1。

SEQ ID NO:188

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGF11985.1。

SEQ ID NO:189

杆菌状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGF12096.1。

SEQ ID NO:190

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元020菌株F0370菌毛蛋白多氨基酸序列。对应于NCBIGenBank EKY04118.1。

SEQ ID NO:191

奈瑟氏菌属物种口腔分类单元020菌株F0370菌毛蛋白多氨基酸序列。对应于NCBIGenBank EKY04120.1。

SEQ ID NO:192

奈瑟氏菌属物种74A18菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank KPN73545.1。

SEQ ID NO:193

奈瑟氏菌属物种74A18菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBank KPN73546.1。

SEQ ID NO:194

SEQ ID NO:195

恒河猴奈瑟氏菌ATCC 33926菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGQ74605.1。

SEQ ID NO:196

恒河猴奈瑟氏菌ATCC 33926菌毛蛋白氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGQ74606.1。

SEQ ID NO:197

AcrA多核苷酸序列(包括pelB信号序列)。

SEQ ID NO:198

AcrA氨基酸序列(pelB信号序列加下划线)。

SEQ ID NO:199

mAcrA氨基酸序列 – 在C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (pelB信号序列和GlycoTag SEQ ID NO:140加下划线；6xHis-标签(SEQ ID NO:217)加双下划线)。

SEQ ID NO:200

PcrV多核苷酸序列(包括LtIIb信号序列)。

SEQ ID NO:201

PcrV氨基酸序列(LtIIb信号序列加下划线)。

SEQ ID NO:202

mPcrV氨基酸序列 – 在C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (LtIIb信号序列和GlycoTag加下划线；6xHis-标签(SEQ ID NO:217)加双下划线)。

SEQ ID NO:203

Crm197多核苷酸序列(包括在C-末端的DsbA信号序列和GlycoTag序列SEQ ID NO:140)。

SEQ ID NO:204

mCrm197氨基酸序列 - 在C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140 (DsbA信号序列和GlycoTag加下划线；6xHis-标签(SEQ ID NO:217)加双下划线)。

SEQ ID NO:205

Crm197氨基酸序列(DsbA信号序列加下划线)。

SEQ ID NO:206

m2Crm197多核苷酸序列(包括在N-末端和C-末端的DsbA信号序列和GlycoTag序列SEQ ID NO:140)。

SEQ ID NO:207

M2Crm197氨基酸序列 – 在N-末端和C-末端的GlycoTag序列SEQ ID NO:140(DsbA信号序列和6xHis-标签(SEQ ID NO:217)加下划线；GlycoTag加双下划线)。

SEQ ID NO:208

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原WbgT氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17408.1。[102]。

SEQ ID NO:209

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原WbgU氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17409.1。[102]。

SEQ ID NO:210

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原Wzx氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17410.1。[102]。

SEQ ID NO:211

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原Wzy氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17411.1。[102]。

SEQ ID NO:212

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原WbgV氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17412.1。[102]。

SEQ ID NO:213

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原WbgW氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17413.1。[102]。

SEQ ID NO:214

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原WbgX氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17414.1。[102]。

SEQ ID NO:215

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原WbgY氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17415.1。[102]。

SEQ ID NO:216

类志贺邻单胞菌O17(即，宋内志贺氏菌) O-抗原WbgZ氨基酸序列，其对应于NCBIGenBank登录号AAG17416.1。[102]。

SEQ ID NO:217

6xHis-标签。

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专利发明人：R·福拉多尔;S·J·凯姆勒;M·T·科瓦里克;G·J·波施;
专利申请人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司;