基于心源性休克大鼠模型的代谢组学分析方法

技术领域

本发明属于生物信息学领域，涉及一种基于心源性休克大鼠模型的代谢组学分析方法。

背景技术

心源性休克是由于心功能不全，导致泵衰竭，使周边组织处于低灌流状态、血流动力学异常，从而诱发休克。根据心源性休克发生发展过程可分为早、中、晚期，早期在临床上的血流动力学指标表现为：血压正常甚至轻度增高或稍降，心率加快，脉压差变小；中期血流动力学参数表现为：血压下降幅度明显，心率比早期时增快，脉压差比早期进一步变小；晚期则会出现弥散性血管内凝血和多器官功能衰竭的症状。心源性休克的临床治疗提倡尽早发现高危患者，尽快实施有效的治疗措施，探讨对心源性休克早、中期的干预作用及机制显得尤为重要。

心源性休克患者主要的死亡原因是心力衰竭，参附注射液能够显著改善心力衰竭急性发作期患者的心功能。目前对参附注射液治疗心源性休克的作用机制研究较少，且未明确对心源性休克分期。中医讲究辨证论治，在疾病发生发展的过程中，其生理、病理状态也是不断变化的，疾病治疗应对“症”下药。

参附注射液对心力衰竭的患者有强心利尿、回阳救逆固脱的功效，在临床上运用广泛。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于心源性休克大鼠模型的代谢组学分析方法，研究参附注射液对心源性休克早、中期模型大鼠血浆代谢物的影响，寻找可能的生物标记物，探讨参附注射液治疗心源性休克早、中期的作用机制。

本发明通过下述技术方案来实现。基于心源性休克大鼠模型的代谢组学分析方法，步骤如下：

步骤一、采用左冠状动脉前降支近心尖端、远心尖端结扎法复制早、中期心源性休克大鼠模型；

步骤二、基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪，采集大鼠心源性休克早、中期血浆样品的代谢图谱信息；

步骤三、数据预处理；

步骤四、进行多变量统计分析，筛选出有显著性差异的生物标志物群；

步骤五、分析其参与的代谢通路,探讨参附注射液治疗心源性休克早、中期的作用机制。

步骤三中，基于ProgenesisQi软件对采集得到的谱图进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等，获得包含化合物保留时间和质荷比信息的csv格式文件。

步骤四中，利用EZinfo 2.0统计软件进行多变量统计分析，筛选出有显著性差异的生物标志物群。

步骤五中，通过Metaboanalyst.ca网站分析其参与的代谢通路,探讨参附注射液治疗心源性休克早、中期的作用机制。

本发明的有益效果：研究参附注射液对心源性休克早、中期模型大鼠血浆代谢物的影响，寻找可能的生物标记物，探讨参附注射液治疗心源性休克早、中期的作用机制；代谢组学分析方法与中医药整体观相吻合，从整体的角度研究外界刺激对生物体内源性小分子的影响及变化规律，为中医证候和中药整体作用机制研究提供了新的研究思路和方法。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

基于心源性休克大鼠模型的代谢组学分析方法，步骤如下：

步骤一、采用左冠状动脉前降支近心尖端、远心尖端结扎法复制早、中期心源性休克大鼠模型。实验前大鼠禁食12h，腹腔注射2％戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉后将其固定在鼠板上。分离右股静脉，行插管术以备输液。分离气管，行气管插管术。开胸后迅速开小动物呼吸机，剪开心包膜，提起心脏结扎左冠状动脉前降支近心尖端，造成心源性休克早期模型；结扎左冠状动脉前降支远心尖端，造成心源性休克中期模型，闭合胸腔，稳定10min。

步骤二、基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪(UPLC/Q-TOF-MS)联用技术，利用超高效液相色谱的快速分离和质谱高灵敏度的特性，采集大鼠心源性休克早、中期血浆样品的代谢图谱信息；

上述图谱信息获取具体过程包括以下几个过程：

1、血浆样品制备方法

将冻存大鼠血浆室温解冻，取100ul血浆于1.5mlEP管，加甲醇300ul，涡旋混匀1min，4℃恒温静置3h，离心(4℃，15000RCF，10min)后取上清液于1.5mlEP管，30℃水浴氮气吹干，保存至-80℃。复溶：加水-甲醇溶液(水：甲醇＝85:15)200ul定容，涡旋混匀1min，离心(4℃，15000RCF，15min)，取上清液于样品瓶，既得。

2、血浆样品测定条件

(1)质谱条件:电离源温度100℃，锥孔气为氮气，流速50L/h；去溶剂气为氮气，温度400℃，流速800L/h。正离子模式下毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为40V，提取锥孔电压为80V，采集时间为0～25min,质量数范围为50～1000Da；负离子模式下毛细管电压为2.5kV，锥孔电压为40V，补偿电压为80V。为确保质量的准确性和重复性，采用甲酸钠建立质量轴标准曲线，亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。串联质谱碰撞气为氩气，低碰撞能为4eV，高碰撞能为20～40eV。

为保证整个分析系统的稳定性，在本实验中使用质控样品(Quality control，QC)进行方法验证，QC样品由每个正常样品各取5μL混合而得。样品的检测过程中，每检测7个正常样品后运行1次QC样品以衡量系统的稳定性。为避免误差，样品的检测顺序为随机进行。

(2)色谱条件：其中正离子模式色谱条件:水相A：超纯水(0.1％甲酸)，有机相B：乙腈；水相A：超纯水(0.1％甲酸)，有机相B：乙腈；梯度洗脱：0～2min,0.1％B；2～6.4min,0.1％～22％B；6.4～9min,22％～35％B；9～22min,35％～100％B；22～24min,100％B；24～32min,100％～90％B；32～34min,90％～0.1％B；34～36min,0.1％B。柱温40℃，样品室温度10℃，流速为0.4ml/min，进样量为1ul。负离子模式色谱条件：水相A：超纯水(0.1％甲酸)，有机相B：乙腈；梯度洗脱：0～20min,5％～95％B；20～23min,95％～5％B。柱温40℃；样品室温度10℃；流速为0.3ml/min；进样量为1ul。

(3)测定仪器、色谱柱和图谱采集软件

WatersAcquity UPLC液相色谱系统、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS质谱仪和WatersACQUITY UPLC BEH C

步骤三、运用Progenesis QI进行数据预处理；

基于ProgenesisQi软件对采集得到的谱图进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等，获得包含化合物保留时间和质荷比信息的csv格式文件。

步骤四、利用EZinfo 2.0统计软件进行多变量统计分析，筛选出有显著性差异的生物标志物群。

设计好实验分组,将处理后的数据矩阵导入EZinfo 2.0统计软件进行多变量统计分析，进行有监督的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，对组别进行分类并判别组间差异,选择显著性差异P小于0.05、投影变量(VIP)大于1的变量作为生物标记物,此时得到其保留时间和质核比信息。基于HMDB、KEGG等生物学数据库筛选出大鼠内源性生物标记物并对其进行鉴定。

心源性休克早期大鼠模型使得1个病理型生物标记物发生了显著波动，但由于资源有限，未能鉴定出该病理性标记物。而在参附注射液治疗心源性休克早期过程中则找到4个具有显著差异的潜在生物标志物，通过已获得的MS

心源性休克中期大鼠模型使得14个病理型生物标记物发生了显著波动，最终鉴定出3个病理性标记物，分别为二腺苷六磷酸、L-γ-谷氨酰-L-异亮氨酸、二甲基苯并咪唑。与正常组比较，心源性休克中期模型组病理性标记物均表现为上升趋势。

步骤五、对步骤三筛选出的并确认的差异代谢标志物通过Metaboanalyst.ca网站分析其参与的代谢通路,探讨参附注射液治疗心源性休克早、中期的作用机制。把差异代谢标志物群放入Metaboanalyst.ca网站自动给出代谢通路，然后结合相关代谢物数据库如HMBD(Human Metabolome Database)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)等查询差异生物标记物生物学功能并作出解释下即可。心源性休克早期病情发展较慢，内源性代谢物组的波动较小。(2)心源性休克中期模型引起大鼠体内二腺苷六磷酸、L-γ-谷氨酰-L-异亮氨酸和二甲基苯并咪唑的差异性表达，根据其生物学功能，推测可能影响了大鼠体内的糖代谢和氨基酸合成。

本发明通过结扎大鼠左冠状动脉不同部位观察了血流动力学与肠系膜微循环学各指标时间变化规律，并与前人的研究、临床的指标相对比，以实验指标的数据来判断模型研究的准确性，初步表明，于分别结扎大鼠左冠状动脉前降支近心尖端、远心尖端20min后各指标组间之间存在极显著差异，因此判定早、中期心源性休克模型成功建立。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。