一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪痘病毒(African swine fevervirus, ASFV)感染引起的，巧猪、豪猪、野猪及家养猪易感，猪一旦感染后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强 的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％，虽然无该病毒感染人的报道，但发生该 病后对养猪业带来极大的危害，动物产品的销售、贸易等均受到严重限制，因此世界动 物卫生组织将其列为法定上报的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中，也被列为一 类动物疾病。

ASFV二十面体对称，病毒粒子直径200nm，结构呈同心球状，最中央区域为核质体，其直径约80nm，由病毒基因组、完成基因早期转录所必需的酶以及一些DNA结合 蛋白组成，如p150、p37、p34、p14以及p14.5、p10，核质体外围是一些蛋白组成的核 衣壳，壳粒是其基本结构单位，共有1982-2172个。

1921年，ASF最早在肯尼亚出现，随后的几十年里该病发生于撒哈拉沙漠周边一些国家，1957年非洲大陆外的葡萄牙国家首次爆发该病，葡萄牙的这次ASF发生后很 快就被控制和消灭掉，到了1960年，里斯本附近地区又爆发了ASF，从该病爆发开始 到1995年，ASFV在伊比利亚半岛(西班牙和葡萄牙)的许多地区蔓延，上世纪70年 代末到80年代中后期，ASFV迅速扩散到世界其他的地方，其中影响较大的是另外一 些欧洲国家(如意大利、法国、荷兰、比利时等)和美洲的一些国家，多米尼加共和国 和巴西尤其严重。通过追根溯源发现，给健康猪饲喂污染ASFV的机场和港口的泔水， 是造成ASFV从疫区国家传播到无疫病国家的主要原因。一旦猪群感染，发病猪及猪肉 制品立马成为新的病毒传染源。西班牙ASFV的流行病学资料显示，控制措施如果能落 实到位，ASF还是可以清除的，然而在意大利的撒丁岛和非洲大陆，特别是非洲东南部 地区，该病毒仍持续存在。上世纪90年代到本世纪初，ASF的流行病学和分布情况发 生了改变，开始进入其他的一些地区，包括一些西非国家；1996年科特迪瓦发生ASF， 1997年尼日利亚和多哥发生ASF，1999年加纳发生ASF，2003年布基纳法索发生ASF，2010年乍得发生ASF等；在西非发生的同时，马达加斯加和毛里求斯这样的岛屿国家 也出现了ASF的流行；2007年，格鲁吉亚首次发生了ASF，随后向西北方向流行，再 次进入欧洲大陆。到目前为止，ASF己在非洲、美洲、欧洲及欧亚大陆交界处等许多国 家流行，2018年8月3日，中国确诊首例非洲猪瘟疫情，2018年之前，中国没有非洲 猪瘟。分子流行病学研究表明：传入中国的非洲猪瘟病毒属基因Ⅱ型，与格鲁吉亚、俄 罗斯、波兰公布的毒株全基因组序列同源性为99.95％左右，通常非洲猪瘟跨国境传入 的途径主要有四类：一是生猪及其产品国际贸易和走私，二是国际旅客携带的猪肉及其 产品，三是国际运输工具上的餐厨剩余物，四是野猪迁徙。中国已查明疫源的68起家 猪疫情，传播途径主要有三种：一是生猪及其产品跨区域调运，占全部疫情约19％；二 是餐厨剩余物喂猪，占全部疫情约34％；三是人员与车辆带毒传播，这是当前疫情扩散 的最主要方式，占全部疫情约46％。

PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，用于检测各种组织、体液中病原微生物的核酸，与其它试验相比，此方法更加快速、敏感，且 不需要分离培养病原微生物，并能进行大批量的流行病学调查。Steiger等首先根据AS FV DNA保守区序列设计一对PCR引物，用建立的PCR检测细胞培养和感染组织中的 ASFV核酸，虽然该对引物检测时灵敏高，但在血液样品检测时，可能会检出假阳性， 并伴有非特异性条带产生。本发明的目的在于提供一种PCR检测方法，具有高度的特 异性和能适应ASFV变异的性能。

发明内容

本发明的目的在于提供适宜ASFV变异的PCR诊断试剂盒，其具有高度保守的引 物序列，可以更好的应对ASFV的变异以及具有高度的特异性。

本发明的制备和使用过程如下：

1.从NCBI上获得非洲猪瘟序列，通过NCBI Blast功能，获得保守序列，比对结 果见图1；

2.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：Primer:F 5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’(Seq ID No.1)，R 5’-CGCAACATTCGCATCTAC- 3’(Seq IDNo.2)，扩增区域94354-94632，长度279bp；

3.样品处理

选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-2 0℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入5ml PBS缓冲液(pH值 为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000 r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；

4.样品DNA模板提取

将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；

5.试剂盒组成

20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)；

6.PCR扩增

取步骤四样品5μl，加入15μl PCR反应混合物、1U Taq酶，PCR反应程序：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，样品出现预定 大小的荧光带即为阳性。

本发明的有益效果是：

本发明提供的非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其中包含的引物序列高度保守，可以检测 不同来源，突变的非洲猪瘟病毒，可以更好的应对非洲猪瘟病毒突变。

附图说明

图1序列对比图

图2特异性检验结果图

图3不同种类非洲猪瘟病毒检测

图4敏感性检验结果图

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制 本发明的范围。

实施例1

本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；

表1实验材料和试剂

表2实验仪器设备

1.从NCBI上获得非洲猪瘟序列(序列号：U18466.2)，通过NCBI Blast功能，获得保守序列，比对结果见图1；

2.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：Primer:F 5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’(Seq ID No.1)，R 5’-CGCAACATTCGCATCTAC- 3’(Seq IDNo.2)，扩增区域94354-94632，长度279bp；

3.样品处理

选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-2 0℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入5ml PBS缓冲液(pH值 为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000 r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；

4.样品DNA模板提取

将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；

5.试剂盒组成

20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)；

6.PCR扩增

取步骤四样品5μl，加入15μl PCR反应混合物、1U Taq酶，PCR反应程序：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，样品出现预定 大小的荧光带即为阳性。

实验一试剂盒特异性检验

1.病料的收集和处理

选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-2 0℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入2ml PBS缓冲液(pH值 为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000 r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；

2.基因组DNA的提取

将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；

3.用本试剂盒对步骤二的DNA样品，以及猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PrV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRS)、猪乙型脑炎病毒(Japaneseenceph alitis virus,JEV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus infection,PPI)的cDNA为模板，用设 计的引物PCR扩增，观察结果，结果见图2。

根据实验结果可以看出，本试剂盒在猪瘟病毒样品中可以扩增出特异条带，在PrV、 PCV2、PRRS、JEV、PPI cDNA为模板的PCR体系中未扩增出特异条带，说明本试剂 盒特异性良好。

实验二：试剂盒敏感性检验

将初始浓度为400ng/μl的标准模板ASFV DNA分别按1：10、1：30、1：50、1： 70、1：90、1：100稀释，从每个稀释度各取2μl模板用ASFV PCR试剂盒进行检验， 观察结果，实验结果见图3。

结果显示1％稀释的PrV DNA模板也能用本试剂盒检测出来。

实验三：应对非洲猪瘟病毒变异能力检测

从NCBI上查找相差比较大的不同区域，不同时间段非洲猪瘟病毒序列(MN641876.1、MH910496.1、MN336500.2、M77121.1、NC044956.1、AY261365.1、NC044942.1、LR536725.1)，人工合成相关的4Kb的DNA序列，插入pGEM-T载体，瞬时转染大肠 杆菌DH5а，挑选克隆测序，测序正确的菌株，扩大培养，用本试剂盒PCR检测，实验 结果见图3。

从实验结果可以看出，均出现了目的条带，说明本试剂盒能够很好的检测不同类型 的非洲猪瘟病毒，具有很好的抗病毒变异功能。

实验四：与其他方法的比较

收集猪血液95份，用本试剂盒与HA、ELISA方法分别检测样品，观察结果，实验 结果见表3。

表3不同检测方法非洲猪瘟病毒检出率

序列表

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