用于高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的标志物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及对高度近视进行风险预测以及高度近视的辅助诊断的标志物组合物及其应用。另外地，本发明还涉及筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的标志物组合物或方法。

背景技术

近视作为一种全球高发性疾病近年来受到国内外越来越多的关注，预计到 2050年，近视将影响到全球近50％的人口，同时高度近视也将影响到全球近10％的人口。同时，近视也是目前影响我国青少年人群视觉健康的主要眼病，其中高度近视是引起我国眼病患者眼盲和低视力的主要原因之一，将给患者及其家庭带来严重的经济负担。

高度近视的发生发展是一个涉及多因素参与的复杂过程，其具体的发病机制仍不清楚，当下的各种光学矫正手段如各种框架眼镜和角膜接触镜，以及手术治疗方法如屈光手术和巩膜加固手术，都不能从根本上控制及延缓高度近视相关并发症的发生发展，可以说目前缺乏行之有效的高度近视的治疗措施。此外，目前近视以及高度近视的诊断主要依靠屈光度的测量或者眼轴的生物学测量，学界尚未有可以辅助其诊断或能够预测其发生发展风险的相关生物标志物的报道。由此可见，寻找更有效的方法对高度近视患者和高危人群进行早期检测、风险预测和早期干预具有重要的临床意义。

疾病的分子标志物可以作为疾病早期检测和风险预测的指标，或者作为疾病诊断后的疾病分级、严重程度、进展或疾病减轻的指标。蛋白质组学从整体水平上研究细胞内蛋白质的表达情况，通过比较正常和疾病状态下蛋白表达的差异，揭示参与病理过程的蛋白网络，发现网络中的关键因素，在研究疾病的病理机制、确定有效预防和早期干预方面具有独特的优势。

国际上已有研究表明近视的发生发展与细胞代谢及增殖密切相关，高度近视人眼组织与低度近视人眼组织相比有显著的代谢差异，这种代谢机制已被作为一种近视发生和发展的新学说而被国际热议。目前对高度近视患者的蛋白质组学研究主要集中在考察高度近视患者眼前房水、玻璃体和血液中蛋白质组改变的情况[XueM,et al.Proteomicanalysis of aqueous humor in patients with pathologic myopia.JProteomics.2021 Mar 15；234:104088；邵瑭等，“病理性近视眼患者血清蛋白质组学分子标志物筛选”中华眼科杂志,2012, 48:246-252]。近几十年来，各种研究揭示多种眼组织均参与了近视的发生发展。在近视人类和动物模型中，已经报道了近视与巩膜重塑和玻璃体腔伸长的关系，该模型显示巩膜变薄，巩膜胶原储存减少，巩膜细胞丢失，所涉及的差异表达蛋白质多为结构蛋白如胶原蛋白和蛋白多糖，以及酶类如基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂等[Gentle A,et al.Collagen gene expression and the alteredaccumulation of scleral collagen during the development of high myopia.J BiolChem.2003 May 9；278(19):16587-94]。在形觉剥夺小鸡构建的高度近视模型中，高度近视眼与正常对照眼相比，全角膜蛋白质组呈现出差异性改变[Kang BS,et al.Cornealproteome and differentially expressed corneal proteins in highly myopicchicks using a label-free SWATH-MS quantification approach.Sci Rep.2021 Mar9；11(1):5495]，其研究结果充分说明了角膜检测在近视研究中的重要意义。但是，目前尚无研究揭示不同近视人眼角膜细胞代谢及增殖相关的差异性表达蛋白。细胞代谢及增殖将引起何种角膜形态或超微结构改变，从而影响患者的屈光度，最终导致近视，特别是高度近视的发生发展，仍需要进一步讨论。

因此，探究不同近视程度人群细胞代谢及增殖相关差异的蛋白基础，并将其开发成对高度近视进行风险预测和高度近视的辅助诊断标志物，以及筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的标志物，对于进一步阐明高度近视的病理机制，在临床上延缓高度近视的进展具有划时代的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人采用高通量蛋白质组学方法考察了轻度近视、中度近视和高度近视患者角膜基质中的蛋白质表达差异，并首次发现了在不同程度的近视人群中表达具有显著差异的特定TGFBI蛋白和DAD1蛋白的蛋白质标志物组合物，为高度近视风险人群提供了一种新的辅助诊断、风险预测手段，以及高度近视候选药物筛选方法，也为进一步阐明此类疾病的病理机制奠定基础。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种用于待检测对象高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的蛋白质标志物组合物，其特征在于：所述标志物为TGFBI 蛋白和DAD1蛋白的组合，所述标志物用于通过高通量蛋白质组学方法对样品进行检测，所述样品来自角膜组织，进一步地，所述样品来自泪液、房水、玻璃体、血液、血浆或血清。

在第二个方面中，本发明提供了一种用于待检测对象高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的标志物组合物，以及说明书，所述说明书记载了高度近视患者、中度近视患者、低度近视患者和/或健康人群样品的上述标志物水平参考数据集合。

进一步地，对于上述标志物组合物或上述试剂盒而言，所述待检测对象高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的方法包括以下步骤：

(1)提供来源于待测对象的样品，对样品中的标志物水平进行检测，所述标志物为TGFBI蛋白和DAD1蛋白的组合；

(2)将步骤(1)测得的标志物水平与高度近视患者、中度近视患者和/ 或低度近视患者的相应标志物的水平参考数据集合进行比较，并将健康人群样品的相应标志物的水平作为阴性对照；以及

(3)如果所述待测对象的样品中标志物的水平在高度近视患者样品的相应标志物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度≤-6.00D，或眼轴长度≥26.00mm，则将所述待测对象判定为患有高度近视；

如果所述待测对象的样品中标志物的水平在中度近视或轻度近视患者样品的相应标志物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度＞-6.00D，且眼轴长度<26.00mm，则将所述待测对象判定为未患有高度近视；和

如果所述待测对象的样品中标志物的水平在高度近视患者样品的相应标志物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度＞-6.00D，且眼轴长度<26.00mm，则将所述待测对象判定为发展成高度近视的风险较高。

在第三个方面中，本发明提供了一种用于筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的标志物组合物，其特征在于：所述标志物为TGFBI蛋白和DAD1 蛋白的组合，所述标志物用于通过高通量蛋白质组学方法对样品进行检测，所述样品来自角膜组织、泪液、房水、玻璃体、血液、血浆或血清。

在第四个方面中，本发明提供了一种筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)在待测组中，向待测对象施用待测化合物，分别检测待测组中来源于所述对象的样品中标志物TGFBI蛋白和DAD1蛋白的水平L

(2)分别对步骤(1)中检测得到的水平L

其中，在步骤(1)和步骤(2)中，所述标志物用于通过高通量蛋白质组学方法对样品进行检测，所述样品来自角膜组织、泪液、房水、玻璃体、血液、血浆或血清，所述待测对象是患有高度近视的动物，优选地，所述动物是哺乳动物，更优选地，所述哺乳动物是人、非人灵长类动物或啮齿类动物。

特别需要指出的是，在本发明中，术语“标志物”也称为“生物学标志物”是指个体的生物学状态的可测量指标。这样的生物学标志物可以是在个体中的任何物质，只要其与被检测个体的特定生物学状态(例如，疾病、病症或障碍) 有关即可，例如核酸(如DNA或RNA)标志物、蛋白标志物、细胞因子标志物、趋化因子标志物、糖类标志物、抗原标志物、抗体标志物和功能性标志物等。生物学标志物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程、致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。

在本发明中，术语“血浆”指全血的液体成分。根据所使用的分离方法不同，血浆可以完全不含细胞成分，也可以含有不同量的血小板和/或少量其他细胞成分。

在本发明中，术语“待测对象”是患有高度近视的动物。优选地，所述动物是哺乳动物。更优选地，所述哺乳动物是人、非人灵长类动物或啮齿类动物。例如，医学研究中常用的高度近视动物模型，如雏鸡、树鼩、豚鼠、恒河猴等。参见例如，WO2018/164113A。

在本发明中，术语“高度近视”指等效球镜屈光度≤-6.00D，或眼轴长度≥26.00mm的屈光不正。高度近视眼轴的伸长程度变大，当其持续进展，导致视网膜、脉络膜向后方拉伸，使其负荷增强，进而导致眼底发生各种各样的异常时，则称为病理性近视或恶性近视。病理性近视是导致失明的主要原因之一，目前尚没有高度近视以及病理性近视的有效预防和治疗方法。

在本发明中，术语“标志物水平参考数据集合”指高度近视患者、中度近视患者、低度近视患者或健康人群样品的参考值或正常值的范围。本领域技术人员知晓，在样品数量足够多的情况下，每个生物标志物在上述患者或健康人群中的绝对值或正常值的范围可以通过检验和计算得到。此外，也可以通过统计学方法计算得到。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明将由TGFBI蛋白和DAD1蛋白组成的标志物组合物用于高度近视的辅助早期筛查和风险预测，这种标志物具有高灵敏度和高特异性的优点，具有重要的科学研究和临床应用价值。

(2)可以将本发明的由TGFBI蛋白和DAD1蛋白组成的标志物用于筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物，以便于开发在临床上用于预防、延缓或治疗高度近视的药物。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：低度近视组、中度近视组和高度近视组患者TGFBI蛋白的蛋白含量差异。图1A为串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)相对定量蛋白组学分析结果，图1B为平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)技术靶向验证结果。

图2：低度近视组、中度近视组和高度近视组患者角膜DAD1蛋白的蛋白含量差异。图2A为TMT相对定量蛋白组学分析结果，图2B为PRM技术靶向验证结果。

图3：差异表达蛋白质互作网络图。图中结点表示差异表达蛋白质，线表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用，上方标注为蛋白质在数据库中的编码。网络中，与某个蛋白质直接相互作用的蛋白质数目称为该蛋白质的连接度，通常来讲，蛋白质的连接度越大，该蛋白质发生变化时整个系统受到的扰动就越大，该蛋白质可能是维持系统平衡和稳定的关键，为后续重点研究的候选蛋白质。

图4：TGFBI蛋白互作网络预测分析图。图中中心结点表示TFGBI蛋白，其他结点表示与TGFBI蛋白存在相互作用关系的蛋白质，线表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用，下方标注为蛋白质的编码基因。网络中，与某个蛋白质直接相互作用的蛋白质数目称为该蛋白质的连接度，通常来讲，蛋白质的连接度越大，该蛋白质发生变化时整个系统受到的扰动就越大，该蛋白质可能是维持系统平衡和稳定的关键，为后续重点研究的候选蛋白质。

图5：DAD1蛋白互作网络预测分析图。图中中心结点表示DAD1蛋白，其他结点表示与DAD1蛋白存在相互作用关系的蛋白质，线表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用，下方标注为蛋白质的编码基因。网络中，与某个蛋白质直接相互作用的蛋白质数目称为该蛋白质的连接度，通常来讲，蛋白质的连接度越大，该蛋白质发生变化时整个系统受到的扰动就越大，该蛋白质可能是维持系统平衡和稳定的关键，为后续重点研究的候选蛋白质。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例

1.实验方法

本实验选取南开大学附属眼科医院(天津市眼科医院)2019年2月-2019 年8月行飞秒激光辅助下微小切口基质透镜切除术(small incision lenticule extraction，SMILE)手术患者术中切除的角膜基质组织，共计133人，259 只眼，所有患者除确诊不同程度近视外，均不伴有其他眼部及全身系统性疾病，不影响角膜蛋白结果分析。本研究通过南开大学伦理委员会审核批准。

所有患者患眼按照等效球镜度(SE＝球镜+柱镜/2)分为低度近视组(SE＞ -3.00D)、中度近视组(-6.00D＜SE≤-3.00D)以及高度近视组(SE≤-6.00D)，并在所有入选患者中从低度、中度、高度近视组分别随机选择各9例眼，共计 27例眼进行标本采集。

对上述标本的角膜样品进行串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)相对定量蛋白组学分析，对所鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析,筛选有潜在研究前景的候选蛋白质，每组进行三次生物学重复。

对获得的候选差异表达蛋白质，基于STRING(http://string-db.org/) 数据库中的信息查找目标蛋白质之间的相互作用关系，并使用CytoScape软件 (版本号：3.2.1)生成相互作用网络并对网络进行分析，筛选后续验证实验的重点蛋白质。

对于选定的目标差异蛋白质，使用平行反应监测(Parallel reactionmonitoring，PRM)技术靶向验证候选蛋白在不同度数近视眼角膜中的表达差异，每组进行三次重复实验。

对于验证成功的差异表达蛋白质，再次基于STRING (http://string-db.org/)数据库中的信息查找目标蛋白质之间的相互作用关系并进行预测分析，并使用CytoScape软件(版本号：3.2.1)生成相互作用网络并对网络进行蛋白质互作的预测分析。

2.实验结果

本研究采用TMT定量蛋白质组学技术进行分析，在人角膜样品中共鉴定到蛋白质2472个。按照表达倍数变化1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍)且p值<0.05的标准筛选差异表达蛋白质。根据生物信息学分析结果以及图3中差异表达蛋白质互作分析结果，进一步选择TGFBI蛋白和DAD1 蛋白作为潜在的差异蛋白。

(1)TGFBI蛋白

TMT蛋白质谱分析显示：高度近视、中度近视和低度近视眼人群角膜的 TGFBI蛋白表达量有明显差异。高度近视组的蛋白相对表达量要显著低于低度近视组，并且高度近视组的蛋白相对表达量也要显著低于中度近视组。高度近视/低度近视组＝0.8883/1.0845＝0.8192，p＝0.0169，高度近视/中度近视＝0.8883/1.0411＝0.8533，p＝0.0354。

使用PRM进一步证实TGFBI蛋白的含量差异。PRM结果显示：TGFBI蛋白低度近视组均值为78.9419，中度近视组为46.0605，高度近视组为42.6479。高度近视/低度近视＝0.5402，p＝0.0265，中度近视/低度近视＝0.5835，p＝0.0450。

通过PRM结果与TMT结果相比，可见PRM验证结果与TMT相对定量结果趋势相一致。高度近视组TGFBI蛋白明显低于低度近视组，且差异显著。在生物体中，蛋白质并不是独立存在的，其功能的行使必须借助于其他蛋白质的调节和介导。这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。图4中以TGFBI蛋白为中心对蛋白质之间的相互作用及相互作用形成的网络进行研究，对于进一步揭示蛋白质的功能具有重要意义。

(2)DAD1蛋白

TMT蛋白质谱分析显示：高度近视、中度近视和低度近视眼人群角膜的DAD1 蛋白表达量有明显差异。高度近视组的蛋白相对表达量要显著低于低度近视组，并且高度近视组的蛋白相对表达量也要显著低于中度近视组。高度近视/低度近视组＝0.8877/1.1249＝0.7892，p＝0.0074，高度近视/中度近视＝0.8877/1.0162＝0.8735，p＝0.0083。

使用PRM进一步证实DAD1蛋白的含量差异。PRM结果显示：DAD1蛋白低度近视组均值为0.4358，中度近视组为0.2752，高度近视组为0.2591。高度近视/低度近视＝0.5944，p＝0.0277，中度近视/低度近视＝0.6314，p＝0.0054。

通过PRM结果与TMT结果相比，可见PRM验证结果与TMT相对定量结果趋势相一致。高度近视组DAD1蛋白明显低于低度近视组，且差异显著。在生物体中，蛋白质并不是独立存在的，其功能的行使必须借助于其他蛋白质的调节和介导。这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。图5中以DAD1蛋白为中心对蛋白质之间的相互作用及相互作用形成的网络进行研究，对于进一步揭示蛋白质的功能具有重要意义。

综上所述，本发明人采用高通量蛋白质组学方法首次发现了在不同程度近视人群的角膜组织中表达具有显著差异的特定蛋白TGFBI蛋白和DAD1蛋白的标志物组合物。此外，拟于源自患者血液、血浆、血清、泪液和房水的样品中，也能够得到与上述角膜组织样品中一致的结果。此细胞代谢相关蛋白质标志物组合物将为高度近视患者提供了一种新的风险预测以及辅助诊断标志物，并提供了以该标志物组合物为基础的候选药物筛选方法，也为进一步阐明此类疾病的病理机制奠定基础。

本发明如有未尽事宜则为公知技术范畴。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。