鉴别‘细桂叶’滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定方法

技术领域

本发明涉及鉴别‘细桂叶’滇山茶品种的分子特异性标记引物，以及该特异性标记引物对‘细桂叶’滇山茶品种进行快速鉴定的方法。

背景技术

滇山茶(Camellia reticulata)，属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)红山茶组(sect Camellia)，常绿阔叶乔木。滇山茶原产中国云南，适应我国西南山地及其独特的高原季风气候，是中国的特有种、国家重点二级保护植物，且被IUCN(InternationalUnion for Conservation of Nature)列为“vulnerable”(易危种)。它不仅是世界珍稀花卉之一、最受云南人民喜爱的八大名花之首，同时也是云南省花、昆明市花，更是被广泛认可的古老而名贵的观赏树木，已被作为观赏植物栽培了1500多年，具有极高的经济价值。加之我国民众自古即高度重视观赏树木的文化韵味，千姿百态、变化多端的滇山茶之娇艳，被广泛地应用到了园林绿化及盆栽观赏中。此外，又由于其树体高大(最高25m)而名扬海外，受到世界园艺界的珍视，先后被引种到全球多地进行栽培。

滇山茶栽培种质的变异丰富，园艺品种有100多个，其中不乏价格昂贵的名贵品种，如‘恨天高’、‘紫袍’、‘细桂叶’等。实践中，一些品种的形态特征相似度高，很难从形态特征上进行鉴别，能准确掌握滇山茶的形态分类技术的仅有少数专业人士，给滇山茶的应用、推广以及新品种选育带来很多困难。尤其是以下两个问题一直较难解决：一是未到花期植株的品种早期鉴定，二是形态特征相似的品种鉴别。

鉴于上述情况，有必要研究鉴别‘细桂叶’滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定方法以解决上述技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供‘细桂叶’滇山茶品种的分子特异性标记引物，本发明的第二个目的在于提供利用的分子特异性标记引物对‘细桂叶’滇山茶品种进行鉴定的方法。本发明旨在解决无法对未到花期且形态特征相似的滇山茶品种进行早期鉴定的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是这样实现的，‘细桂叶’滇山茶品种的分子特异性标记引物，该特异性标记引物序列如下：

上游引物：5’-CTCCCAACCCATCGTCCTTT-3’；

下游引物：5’-CCTTGCCGCTCTTGCAATC-3’。

本发明的第二个目的是这样实现的，利用所述分子特异性标记引物对‘细桂叶’滇山茶品种进行鉴定的方法，所述方法为：

(1)提取待测滇山茶品种叶片的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的滇山茶品种叶片的基因组DNA作为扩增模板，利用权利要求1所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)中的扩增产物进行电泳检测，电泳结束后用EB染色，于Tanon凝胶成像仪拍照记录结果，将电泳结果与DL2000Marker进行对比，若条带大小为1100bp，则对扩增产物进行DNA双向测序，获得扩增产物DNA序列；

(4)如步骤(3)中所述扩增产物的DNA序列能与NCBI(national centerforbiotechnology information)线上数据库的单拷贝核基因(MH257929)成功比对，且所述扩增产物在823bp、842bp中的至少一个bp上出现特异性位点，则待测滇山茶品种为‘细桂叶’，反之则否；所述823bp的核苷酸碱基为A，所述842bp的核苷酸碱基为C。

优选地，步骤(1)中所述提取待测滇山茶品种叶片的基因组DNA的方法为：取待测滇山茶叶片，加液氮磨碎后，以改良CTAB法进行基因组DNA提取。

优选地，步骤(2)中所述CR扩增体系，每50μL组成为：25μL Taq混合物；1μL DNA模板；22μL ddH2O；1μL浓度为10p的上游引物；1μL浓度为10p的下游引物。

优选地，步骤(2)中所述PCR扩增条件为：在98℃下初始变性2min，再在98℃下变性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，进行35个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选地，所述步骤(3)中的电泳检测方法为：取步骤(2)中的扩增产物2μL，与6μL 1×溴酚蓝缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，恒压300V电压下电泳12分钟。

优选地，步骤(3)中所述扩增产物进行DNA双向测序时采用一代3730测序仪。

优选地，步骤(4)中所述单拷贝核基因长度为1038bp，在NCBI线上数据库的GenBank登录号为MH257929。

该引物经过大量筛选试验获得能够在滇山茶品种及近缘种中扩增出直系同源的单拷贝核基因。所述引物扩增的单拷贝核基因在NCBI线上数据库的GenBank登录号为MH257929，长度1038bp，在823bp位点的核苷酸碱基为A，具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基G进行区别，以及在842bp位点的核苷酸碱基为特异性位点C；具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基A进行区别，可实现滇山茶品种‘细桂叶’的分子鉴别。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于滇山茶品种的鉴定(鉴定其是否为‘细桂叶’)，即待测样品仅限于滇山茶。

本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行，通过测序位点验证，能简单、准确、可靠的实现滇山茶品种‘细桂叶’的分子鉴别。

综上所述，相比于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明在前期的滇山茶转录组测序、单拷贝核基因筛选的基础上，以滇山茶的主要栽培品种为实验对象，针对形态上难以鉴别的品种，筛选出了部分品种的分子特异性标记引物，PCR扩增测序后，可从单拷贝核基因序列上的特异性位点进行部分滇山茶品种的分子鉴定。

2、本发明的分子特异性标记引物可对滇山茶品种‘细桂叶’与其它滇山茶主要栽培品种进行分子鉴别，尤其适合对未到花期植株的滇山茶品种的早期鉴定，以及形态特征相似的品种进行鉴别，如‘小桂叶’等。

3、本发明鉴定方法简单、快捷准确。

附图说明

图1为本发明的分子特异性标记引物PCR扩增的DNA序列(含‘细桂叶’和其它87个滇山茶主要栽培品种)在1038bp左右的比对结果。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：‘细桂叶’滇山茶品种的分子特异性标记引物的开发设计

采集滇山茶品种，采集到的滇山茶品种共88个，分别来自昆明、楚雄彝族自治州、大理白族自治州和保山，采集到的88个滇山茶品种如表1所示：

表1

对表1中采集来的88个滇山茶品种材料进行整理，获得样本材料的幼嫩叶片部分，用电子分析天平称量10mg放入研磨容器中，加液氮磨碎后，以改良CTAB法进行基因组DNA提取。对上述提取到的DNA还需借助琼脂糖凝胶电泳(1％)和DNA/RNA紫外分光光度计进行质量(完整性、纯度及浓度)检测。

(2)设计特异PCR扩增引物

在滇山茶转录组测序的基础上，筛选出长度600-1200bp的单拷贝核基因30个，初步设计了30对引物，根据引物对8个滇山茶品种(随机筛选)的扩增效果，筛选出扩增高效、稳定的单拷贝核基因序列。然后基于该DNA序列设计获得‘细桂叶’滇山茶品种特异性标记引物，引物对的序列为：

上游引物：5’-CTCCCAACCCATCGTCCTTT-3’；下游引物：5’-CCTTGCCGCTCTTGCAATC-3’。

实施例2

(1)以实施例1提取的滇山茶品种叶片的基因组DNA作为扩增模板，利用实施例1设计的分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。

PCR扩增体系每50μL组成如下：Taq混合物25μL，DNA模板1μL，ddH2O 22μL，(浓度10p)上、下游引物各1μL。

PCR扩增条件为：在98℃下初始变性2min，然后在98℃下变性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，进行35个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

(2)取步骤(1)中的扩增产物2μL，与6μL 1×溴酚蓝缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，恒压300V电压下电泳12分钟。电泳结束后用EB染色，于Tanon凝胶成像仪拍照记录结果，将电泳结果与DL2000Marker进行对比，查看有无条带，如有条带，且条带大小为800bp，则对扩增产物送至生物公司，采用一代测序仪3730对扩增产物进行DNA双向测序；

(3)将步骤(2)中的测序结果在NCBI线上数据库进行BLAST，与GenBank登录号为MH257929的单拷贝核基因成功比对上，且在823bp位点的核苷酸碱基为A，具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基G进行区别，以及在842bp位点的核苷酸碱基为特异性位点C(如图1所示)，具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基A进行区别，则待测滇山茶品种为‘细桂叶’，反之则否。可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于滇山茶品种‘细桂叶’的鉴定；其稳定性、特异性非常高。

实施例3

(1)以实施例1提取的滇山茶品种叶片的基因组DNA作为扩增模板，利用实施例1设计的分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。

PCR扩增体系每50μL组成如下：Taq混合物25μL，DNA模板1μL，ddH2O 22μL，(浓度10p)上、下游引物各1μL。

PCR扩增条件为：在98℃下初始变性2min，然后在98℃下变性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，进行35个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

(2)取步骤(1)中的扩增产物2μL，与6μL 1×溴酚蓝缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，恒压300V电压下电泳12分钟。电泳结束后用EB染色，于Tanon凝胶成像仪拍照记录结果，将电泳结果与DL2000Marker进行对比，查看有无条带，如有条带，且条带大小为800bp，则对扩增产物送至生物公司，采用一代测序仪3730对扩增产物进行DNA双向测序；

(3)将步骤(2)中的测序结果在NCBI线上数据库进行BLAST，与GenBank登录号为MH257929的单拷贝核基因成功比对上，且在823bp位点的核苷酸碱基为A(如图1所示)，具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基G进行区别，则待测滇山茶品种为‘细桂叶’，反之则否。可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于滇山茶品种‘细桂叶’的鉴定；其稳定性、特异性非常高。

实施例4

(1)以实施例1提取的滇山茶品种叶片的基因组DNA作为扩增模板，利用实施例1设计的分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。

PCR扩增体系每50μL组成如下：Taq混合物25μL，DNA模板1μL，ddH2O 22μL，(浓度10p)上、下游引物各1μL。

PCR扩增条件为：在98℃下初始变性2min，然后在98℃下变性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，进行35个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

(2)取步骤(1)中的扩增产物2μL，与6μL 1×溴酚蓝缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，恒压300V电压下电泳12分钟。电泳结束后用EB染色，于Tanon凝胶成像仪拍照记录结果，将电泳结果与DL2000Marker进行对比，查看有无条带，如有条带，且条带大小为800bp，则对扩增产物送至生物公司，采用一代测序仪3730对扩增产物进行DNA双向测序；

(3)将步骤(2)中的测序结果在NCBI线上数据库进行BLAST，与GenBank登录号为MH257929的单拷贝核基因成功比对上，且在842bp位点的核苷酸碱基为特异性位点C(如图1所示)，具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基A进行区别，则待测滇山茶品种为‘细桂叶’，反之则否。可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于滇山茶品种‘细桂叶’的鉴定；其稳定性、特异性非常高。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 鉴别'细桂叶'滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定方法

<130> 2022

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

ctcccaaccc atcgtccttt 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ccttgccgct cttgcaatc 19