用于预防或治疗纤维化的包含脱镁叶绿酸化合物作为活性成分的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种用于预防或治疗纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含脱镁叶绿酸化合物(pheophorbide compound)作为活性成分。

背景技术

纤维化疾病占西方社会死因的约45％，属于重疾领域，由于纤维化疾病在疾病临床进展显著后才能确诊，因此其预防性治疗有限，并且迄今为止还没有有效的治疗方法来直接解决预先存在的进行性纤维化。

肌成纤维细胞是异常活跃的成纤维细胞，据报道是控制纤维化疾病进展的致病细胞。肌成纤维细胞具有这样的特征：导致由纤维1，3型胶原蛋白和纤连蛋白组成的细胞外基质(ECM)在组织中的积累以及降解细胞外基质的酶基因的失活。

已知细胞因子和由受损上皮、内皮、骨髓源性纤维蛋白细胞、免疫细胞等分泌的生长因子(如TGF-β1(转化生长因子-β1)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-1(白细胞介素-1)、IL-6、IL-13、PDGF(血小板源性生长因子)等)参与肌成纤维细胞的分化和激活。

因此，阻断加剧纤维化的生长因子和细胞因子的激活和信号传导能够成为治疗纤维化的起点，在用于治疗纤维化疾病的领域中正在开发靶向TGF-β1、IL-13、CTGF(结缔组织生长因子)、PDGF、αvβ6整合素、半乳糖凝集素-3、LOXL2(赖氨酰氧化酶同源物2)、转谷氨酰胺酶-2、NOX4(NADPH氧化酶4)或JNK(Jun N-末端激酶)抑制剂的药物。

目前，施用于特发性肺纤维化患者的药物单独或联合使用类固醇和免疫抑制剂。虽然这些药物在大约10％-30％的患者中表现出治疗效果，但由于中位生存率不足3年，疗效不佳，并且副作用多，因此其使用逐渐减少。

另一方面，吡非尼酮(pirfenidone)，一种抑制TGF-β的启动子反应的药物，在2011年指南中被建议为有条件禁止使用。然而，它最近已更新为有条件可用的药物，并已在动物研究中证明减少了肌成纤维细胞的扩散。但随后的临床试验没有报道明显效果，并出现例如恶心、呕吐、消化不良等副作用。

此外，酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布(nintedanib)是一种抑制多种细胞的生长因子受体的药物，已知在诱导有纤维化的动物实验中，尼达尼布在细胞水平抑制促进纤维化的细胞因子的作用，减少由TGF-β导致的胶原蛋白合成，并缓解肺纤维化。在临床试验中，尼达尼布已在广泛的患者群体中显示出延缓肺功能降低的效果，但已知它没有治疗肺纤维化的能力。

因此，吡非尼酮和尼达尼布专注于延缓肺功能降低，并具有局限性，即其本身不能作为阻止纤维化进展的药物。因此，本发明人在开发通过抑制组织纤维化来有效预防或治疗纤维化的药剂上付出了大量的努力。结果，本发明人通过证实脱镁叶绿酸a(pheophorbide a)抑制TGF-β信号传导并有效抑制作为纤维化疾病的关键蛋白质的细胞外基质胶原蛋白和纤连蛋白的激活，而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含通过抑制组织纤维化来有效预防和治疗纤维化的化合物作为活性成分。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或改善纤维化的食品组合物，所述食品组合物含有上述化合物作为活性成分。

问题的解决方案

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗纤维化的药物组合物，所述药物组合物含有脱镁叶绿酸化合物作为活性成分。

本发明还提供一种用于预防或改善纤维化的食品组合物，所述食品组合物含有脱镁叶绿酸化合物作为活性成分。

发明效果

根据本发明的用于预防或治疗纤维化的药物组合物可通过抑制引起纤维化的TGF-β信号传导并抑制胶原蛋白和纤连蛋白的激活和表达，从而有效抑制组织纤维化。此外，由于它显示出显著优于市售的肺纤维化治疗剂尼达尼布或吡非尼酮的抗纤维化活性，因此它可用于预防或治疗纤维化。

附图说明

图1示出了从黄漆木(Dendropanax Morbiferus)中分离脱镁叶绿酸a的过程。

图2是用于分析脱镁叶绿酸a在细胞水平上的抗纤维化活性的实验示意图。

图3是脱镁叶绿酸a对人肺成纤维细胞CCD8-Lu和LL-29的细胞毒性实验结果。

图4是用于确定根据用TGF-β和/或脱镁叶绿酸a处理的Smad蛋白的DNA结合能力差异的荧光素酶测定的结果。

图5是通过用不同浓度的TGF-β和/或脱镁叶绿酸a处理人肺成纤维细胞CCD8-Lu细胞，使用免疫印迹来比较胶原蛋白1A、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达水平差异的结果。

图6是通过用不同浓度的TGF-β和/或脱镁叶绿酸a处理人肺成纤维细胞CCD8-Lu细胞，使用免疫细胞化学分析来比较胶原蛋白1A的表达水平差异的结果。

图7至图10是通过用TGF-β和脱镁叶绿酸a、尼达尼布或吡非尼酮处理人肺成纤维细胞CCD8-Lu细胞，使用定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来比较α-SMA基因(图7)、CTGF基因(图8)、纤连蛋白基因(图9)和NOX4基因(图10)的表达水平差异的结果。

图11是通过用TGF-β和脱镁叶绿酸a、尼达尼布或吡非尼酮处理人肺成纤维细胞CCD8-Lu细胞，使用免疫印迹来比较胶原蛋白1A、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达水平差异的结果。

图12是通过用TGF-β和脱镁叶绿酸a或尼达尼布处理人肺成纤维细胞CCD8-Lu细胞，使用免疫细胞化学分析来比较胶原蛋白1A蛋白的表达水平差异的结果。

图13是通过用TGF-β和脱镁叶绿酸a或尼达尼布处理人肺成纤维细胞CCD8-Lu细胞，使用免疫印迹来比较Smad、磷酸化Smad3、ERK和磷酸化ERK蛋白的表达水平差异的结果。

具体实施方式

用于预防或治疗纤维化的药物组合物

本发明的一个方面提供一种用于预防或治疗纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含脱镁叶绿酸化合物作为活性成分。

在本发明中，术语“脱镁叶绿酸化合物”具有下式的结构：

[式1]

其中R

R

在本发明中，脱镁叶绿酸化合物可以是脱镁叶绿酸a，但不限于此。

在本发明中，术语“脱镁叶绿酸a”为由分子式C

[式2]

脱镁叶绿酸化合物，特别是脱镁叶绿酸a，可以抑制TGF-β信号传导，从而抑制肌成纤维细胞的分化和激活。因此，该化合物可以抑制肌成纤维细胞的主要标志物α-SMA的表达，以及纤维化特征的细胞外基质蛋白胶原蛋白和纤连蛋白的表达。

在本发明中，术语“TGF-β”是指使受损组织的修复启动和终止的关键细胞因子，TGF-B的持续产生导致组织纤维化。特别地，在慢性肝病的肝组织中发现TGF-β1 mRNA的表达与胶原蛋白I mRNA的表达密切相关。此外，TGF-β1蛋白仅在纤维化进展的区域表达，在正常肝组织或非活跃区域不表达。因此，已知TGF-β在肝纤维化和肝硬化中起重要作用。

此外，已知TGF-β参与作为纤维化的主要致病细胞的肌成纤维细胞的分化和激活。在纤维化过程的激活中，分子机制的关键是TGF-β和Smad依赖性信号传导激活肌成纤维细胞。TGF-β1与细胞膜中存在的TGF-β1受体结合导致TGF-β1特定功能的信号的传递。此外，激活的TGF-β1受体诱导Smad2和Smad3蛋白的磷酸化反应，磷酸化的Smad2/Smad3与Smad4蛋白结合形成复合物。已知Smad复合物易位到细胞核中并导致构成细胞外基质的蛋白质(例如纤连蛋白和胶原蛋白)的转录。

因此，脱镁叶绿酸化合物，特别是脱镁叶绿酸a，可以具有这样的特征：通过抑制TGF-β信号传导和抑制Smad蛋白的磷酸化从而抑制构成细胞外基质的纤连蛋白和胶原蛋白的表达。

如本文所用，术语“纤维化”是指在器官或组织中形成过量的纤维结缔组织。它可以与作为器官或组织的正常组分的纤维组织区分开来。纤维化可以理解为一种致死性疾病，其中成纤维细胞过量积累细胞外基质如纤连蛋白、胶原蛋白等，从而由于器官组织硬化而导致人体组织功能持续丧失。

例如，在选自肾、肝、肺、皮肤、心脏、胰腺、泌尿系统、生殖系统、汗腺、神经、脑、骨髓、肌肉及关节中任何一个或多个中可以发生纤维化。

在本发明中，纤维化可以是选自以下中任何一个或多个，但不限于：肝纤维化、肺纤维化、皮肤纤维化、关节纤维化、神经纤维化、胰腺纤维化、肾纤维化、肌肉纤维化和腹膜纤维化。

更具体地，纤维化可以是选自以下中任何一个或多个，但不限于：肺纤维化、特发性肺纤维化、辐射引起的肺损伤或肺纤维化、肺水肿、囊性纤维化、肝纤维化、心内膜心肌纤维化、心肌梗塞、心房纤维化、胶质瘢痕、肾纤维化、骨髓纤维化、关节纤维化、脂肪纤维化、皮肤纤维化、神经纤维化和肌肉纤维化。

如本文所用，术语“肝纤维化”是指由肝脏的慢性损伤引起的纤维组织增生的症状，并且可以包括但不限于由选自以下中的任何一种或多种引起的症状：慢性肝病、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、丁型肝炎病毒感染、血吸虫病、酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝炎、代谢疾病、蛋白质缺乏、冠状动脉疾病、自身免疫性肝炎、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏、原发性胆汁性肝硬化、药物反应和毒素。

肝纤维化是肝硬化的前期疾病，以由于严重的肝损伤导致慢性肝病造成的各种细胞因子和生长因子的作用开始。一般来说，肝纤维化由可逆的薄原纤维组成，如果没有形成结节并且肝损伤的原因是暂时的，则增加的细胞外基质(ECM)会被细胞凋亡和基质金属蛋白酶(MMP)降解，从而恢复正常。然而，肝纤维化过程的反复持续会导致形成粗原纤维并进展为结节性肝硬化。此外，肝硬化是通过肝纤维化过程诱发的，在肝纤维化过程中肝细胞被各种炎症诱导因子的破坏，并积累了包括胶原蛋白在内的异常的细胞外基质蛋白。因此，控制细胞外基质的积累对于肝硬化表达的调控具有重要意义。肝细胞受损时的炎症反应激活了处于静止期的肝星状细胞分泌细胞外基质和各种细胞因子和趋化因子，其中TGF-β1充当有效的生长抑制剂。TGF-β1是一种25kD的物质，其通过与潜伏的TGF-β1结合蛋白结合以无活性的潜伏形式分泌，并以被各种刺激激活的、与细胞外基质如1，4型胶原蛋白、层粘连蛋白和核心蛋白聚糖结合的形式存在。TGF-β1通过减少胶原酶产生或增加胶原酶抑制剂产生来调节胶原蛋白表达，增加巨噬细胞中TNF-α、IL-1、PDGF等的产生，在纤维化过程中起重要作用。现已知TGF-β1仅在纤维化进展的区域表达，而不在正常肝组织或非活跃区域表达，在肝纤维化中起重要作用。

另一方面，非酒精性脂肪肝与饮酒无关，可以由肥胖、糖尿病、高脂血症、药物等引起，并且涵盖了广泛的疾病，包括不伴有炎症反应的单纯性脂肪肝(脂肪变性)，和显示肝细胞炎症、晚期纤维化和肝硬化(取决于疾病的进展)的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。据报道，随着现代社会因高脂高热量饮食导致的成人疾病增多，发达国家中有20％-30％的成年人群体出现非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，其中2％-3％进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者，这些患者特别表现出在组织学上伴有纤维化和炎症的脂肪性肝炎表现，并且有发展为肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的高风险。

如本文所用，术语“肺纤维化”是指由于肺中过多纤维结缔组织的形成或发展(纤维化)而导致瘢痕(纤维)组织的发展。具体而言，肺纤维化是一种导致肺泡和肺间质组织肿胀和形成瘢痕的慢性疾病。这种瘢痕组织取代了健康组织并引起炎症，而慢性炎症可以被视为纤维化的征兆。这种对肺组织的损伤可能导致肺部僵硬，并可能使个体难以维持自主呼吸。

具体地，肺纤维化可以包括但不限于选自以下中的任意一种或多种：特发性肺纤维化；辐射引起的肺损伤；非特异性间质性肺炎；急性间质性肺炎；隐源性机化性肺炎；呼吸性细支气管炎相关的间质性肺病；脱屑性间质性肺炎；淋巴间质性肺炎；间质性肺纤维化；和由弥漫性肺纤维化、肺水肿、囊性纤维化和代谢性疾病引起的肺纤维化。

如本文所用的术语“皮肤纤维化”是过度的皮肤瘢痕形成，并且是病理性伤口愈合反应的结果。纤维化皮肤病的范围很广：硬皮病、肾源性纤维化皮肤病、混合性结缔组织病、硬化性粘液水肿、硬肿病和嗜酸性筋膜炎。暴露于化学品或物理因素(机械创伤、烧伤)也是纤维化皮肤病的潜在原因。皮肤纤维化可由免疫、自身免疫和炎症机制驱动。成纤维细胞导致的胶原蛋白产生和降解的平衡在真皮纤维化的病理生理学中起关键作用。某些细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)和白细胞介素-4(IL-4)促进伤口愈合和纤维化。正常皮肤中的成纤维细胞是静息的。它们合成受控量的结缔组织蛋白并且增殖活性低。皮肤损伤后，这些细胞被激活，即它们表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)并合成大量结缔组织蛋白。活化的细胞通常被称为肌成纤维细胞。这里，“皮肤纤维化”也可以包括“硬皮病”。

如本文所用，术语“心肌纤维化”是指由于基质蛋白在心脏细胞之间过度沉积而导致心脏硬化的现象。心肌纤维化主要存在于心肌梗塞患者的心脏，是心脏功能下降的主要原因。心肌纤维化可以包括但不限于选自以下中的任意一种或多种：心内膜纤维化、心房纤维化、心力衰竭、心肌梗塞和代谢疾病引起的心肌纤维化。此外，由于心脏的纤维化是心力衰竭和心肌梗塞的主要原因，因此术语“心肌纤维化”可以解释为包含由心肌纤维化引起的心力衰竭和/或心肌梗塞。

在本发明中，药物组合物还可以含有药学上可接受的载体。

包含在本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体是通常用于制备的那些，并且包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或介质等，并且除了上述组分外还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、芳香剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

本发明的药物组合物可以按照本领域普通技术人员容易实施的方法，通过与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起配制或通过掺入大容量容器中制备成单位剂型，并且可以进一步包含分散剂或稳定剂。

药物组合物的制剂可以根据使用方法而变化，但可以制备成膏剂、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、溶液剂、流浸膏剂、乳剂、混悬剂、输液剂、片剂、注射剂、胶囊剂和丸剂。药物组合物的制剂还包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂，其为用于局部或经皮施用的制剂。

药物组合物可以与药学上可接受的载体和(如果需要)防腐剂、缓冲剂等在无菌条件下混合。根据本发明的软膏、糊剂、乳膏和凝胶制剂可以另外含有动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石、氧化锌或其混合物作为赋形剂。

本发明的药物组合物在含有有效量的脱镁叶绿酸a时，可以提供所需的纤维化的预防、改善或治疗效果。如本文所用，术语“有效量”是指比阴性对照表现出更多反应的量，优选足以预防、改善或治疗纤维化的量。本发明的药物组合物可以含有脱镁叶绿酸化合物，在一个实施方式中，脱镁叶绿酸a的含量为0.01％至99.9％，余量可由药学上可接受的载体占据。包含在本发明的药物组合物中的化合物将根据组合物的商业化形式等而变化。

本发明的药物组合物的总有效量可以按单剂量施用于患者，或者通过多剂量长期施用的分次治疗方案施用于患者。本发明的药物组合物可以根据疾病的程度来改变活性成分的含量。例如，可以按一次至数次的分剂量来施用，使得以脱镁叶绿酸a为基准，每天每kg体重施用优选0.001μg至100mg、更优选0.01μg至10mg的量。然而，由于脱镁叶绿酸a的剂量是通过考虑各种因素(例如患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率以及药物组合物的施用途径和治疗频率)来确定的。因此考虑到上述情况，本领域普通技术人员将能够根据具体的预防、治疗或改善纤维化的用途来确定脱镁叶绿酸a的合适的有效剂量。根据本发明的药物组合物在其制剂、施用途径和施用方法方面没有特别限制，只要实现本发明的效果即可。

用于预防或改善纤维化的食品组合物

根据本发明的另一方面，提供一种用于预防或改善纤维化的食品组合物，所述食品组合物含有脱镁叶绿酸化合物作为活性成分。

在本发明中，脱镁叶绿酸化合物可以是但不限于脱镁叶绿酸a。

在本发明中，术语“食品”是指含有一种或多种营养物质的天然产品或加工产品，优选是指经过一定的加工步骤后处于可直接食用状态的产品，该术语包括普通含义上的所有食品、食品添加剂、保健功能食品、饮料、饮料添加剂等。

当本发明的组合物制备成食品组合物时，它不仅含有黄漆木提取物作为活性成分，还包括通常在食品制备中添加的组分，例如蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养物质、调味剂和芳香剂。

预防和治疗纤维化的方法

本发明的另一方面提供了一种预防和治疗纤维化的方法，所述方法包括向对象施用脱镁叶绿酸化合物。

对象可以是患有纤维化的对象。对象也可以是哺乳动物，优选人。在这种情况下，脱镁叶绿酸化合物如上所述，并且优选地，脱镁叶绿酸化合物可以是脱镁叶绿酸a。此外，化合物的施用途径、剂量和频率可以根据患者的状况和有无副作用而变化，化合物可以各种方法和量施用于对象，并且本领域普通技术人员可以在适当的范围内选择最佳施用方法、施用剂量和施用频率。纤维化的类型也如上所述。

脱镁叶绿酸类化合物用于治疗纤维化的用途

本发明的另一方面提供脱镁叶绿酸化合物用于治疗纤维化的用途。

在这种情况下，脱镁叶绿酸化合物如上所述，并且优选地，脱镁叶绿酸化合物可以是脱镁叶绿酸a。纤维化的类型也如上所述。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，对于本领域普通技术人员来说，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的范围并不限于此。

制备例1.制备黄漆木提取物

洗涤黄漆木的叶、茎、根等并用研磨机研磨，然后将乙醇或甲醇加入到约8g研磨产物中，使其浓度为20w/v％。将其浸入并搅拌至少4小时，然后过滤以分离初级液体组分。将分离的固体再次浸入乙醇或甲醇中并搅拌至少4小时，然后过滤以获得二级液体组分。将得到的初级液体组分和二级液体组分混合，减压浓缩混合物，并将残余物冷冻干燥以得黄漆木提取物。

制备例2.从黄漆木提取物中分离脱镁叶绿酸a

用石油醚、己烷、氯仿、二氯甲烷和乙酸乙酯按所述顺序对制备例1中获得的黄漆木提取物进行分馏以获得馏分。使高活性氯仿馏分在硅胶柱上经历石油醚、乙醚、甲醇和水的洗脱条件，共得到6个亚馏分(F-1至F-6)。其中，使F-2馏分在硅胶柱上经历石油醚、乙醚和甲醇的洗脱条件，共得到10个亚馏分(F-1a至F-10a)。

其中，通过使F-4a亚馏分在硅胶柱上经历二氯甲烷：甲醇＝95：05(v/v)的洗脱条件，共得到三个亚馏分(F-1b至F-3b)。其中，如下表1(图1)所示，通过NMR分析在F-3b亚馏分中确认脱镁叶绿酸a。

[表1]

实验例1.脱镁叶绿酸a的细胞毒性实验

为了确认制备例2中得到的脱镁叶绿酸a的细胞毒性，使用了人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞和LL-29细胞。将CCD8-Lu细胞和LL-29细胞以2×10

通过将样本处理组的吸光度表示为相对于对照组的百分比，在图3中显示细胞存活率作为实验的结果。如图3所示，证实了脱镁叶绿酸a在最高到2.5μM的浓度下几乎没有细胞毒性，在5μM的浓度下表现出约25％的细胞毒性，在10μM的浓度下表现出约75％的细胞毒性。

实验例2.确认脱镁叶绿酸a对TGF-β信号通路的抑制作用

制备运载体(vector)，其中将通过重复8次Smad基因可以结合的核苷酸序列(5′-GGTGTCTAGACATAGTCTAGAGACA-3′SEQ ID NO：1)获得的基因与作为报告基因的编码荧光素酶的基因连接。将上述运载体与其中RSV启动子基因与编码β-半乳糖苷酶基因连接的运载体一起转染到Balb/c3T3细胞中。6小时后，阴性对照组不予处理，阳性对照组用5ng/ml浓度的TGF-β处理，实验组用浓度分别为0.06μM、0.12μM、0.25μM、0.5μM、1μM和5μM制备例2得到的脱镁叶绿酸a以及5ng/ml的TGF-β进行处理。

然后将细胞于37℃在5％CO

实验例3.脱镁叶绿酸a化合物的抗纤维化活性分析

实验例3.1.使用免疫印迹法分析抗纤维化活性

使用免疫印迹法进行基于细胞的测定实验，以分析脱镁叶绿酸a的抗纤维化活性。

在含有10％FBS的DMEM培养基中培养人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞。然后，将约2×10

24小时后，在用浓度为5ng/ml的TGF-β处理后，诱导细胞纤维化6小时。6小时后，用制备例2中获得的脱镁叶绿酸a处理细胞，并进一步培养18小时(图2)。然后，阴性对照组不予处理，阳性对照组仅用浓度为5ng/ml的TGF-β处理，实验组用浓度为5mg/mL的TGF-β处理并且6小时后用浓度分别为0.06μM、0.12μM、0.25μM、0.5μM、2.5μM和5μM的脱镁叶绿酸a处理。

18小时后，去除培养基并通过加入PBS缓冲溶液洗涤细胞两次，并向其中直接添加含有蛋白酶抑制剂的100μl的RIPA缓冲溶液(150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸、0.1％SDS、50mM Tris pH 7.5)。10分钟后，使用刮刀回收细胞并转移到微型管中并以约12000×g离心10分钟。

获得分离的上清液并转移到新的微型管中，然后使用二辛可宁酸测定(BCA测定)蛋白质定量试剂盒对蛋白质进行定量。对含有等量蛋白质的每个样本进行电泳，然后进行免疫印迹。抗胶原蛋白1A或抗纤连蛋白、抗α-平滑肌肌动蛋白抗体用作一抗，抗小鼠IgGHRP或抗兔IgG HRP用作二抗。使用用于校正的抗β-肌动蛋白抗体对蛋白质表达的差异进行校正。

根据图5所示的实验结果，发现当用TGF-β处理人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞时，胶原蛋白1A、纤连蛋白和平滑肌肌动蛋白的表达增加，并证实了用脱镁叶绿酸a进行处理抑制了TGF-β诱导的胶原蛋白1A、纤连蛋白和平滑肌肌动蛋白的表达。结果，脱镁叶绿酸a抑制了纤维化特征蛋白的表达，从而证实了抑制纤维化进展的可能性。

实验例3.2.使用免疫细胞化学染色法分析抗纤维化活性

使用免疫细胞化学染色法进行基于细胞的测定实验，以分析制备例2中获得的脱镁叶绿酸a的抗纤维化活性。

在含有10％FBS的DMEM培养基中培养人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞。然后将约2×10

24小时后，在用浓度为5ng/ml的TGF-β处理后，诱导细胞纤维化6小时。6小时后，用制备例2中获得的脱镁叶绿酸a处理细胞，并进一步培养18小时(图2)。然后，阴性对照组不予处理，阳性对照组仅用浓度为5ng/ml的TGF-β处理，实验组用浓度为5ng/ml的TGF-β处理并且6小时后用浓度分别为0.15μM、0.3μM、0.6μM、1.2μM、2.5μM和5μM的脱镁叶绿酸a处理。

每个样本的免疫组织化学分析按如下进行。首先，将样本用PBS缓冲液洗涤两次，然后加入4％甲醛固定1小时，抗胶原蛋白1A作为一抗，Alexa Fluor 488作为二抗。使用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色，并使用荧光显微镜分析荧光强度的差异。

作为实验结果，如图6所示，通过荧光强度证实了在阴性对照CCD8-Lu细胞中胶原蛋白1A的表达低，而当用5ng/ml TGF-β处理时胶原蛋白1A的表达显著增加。此外，证实了当用5ng/ml TGF-β处理并且6小时后用脱镁叶绿酸a处理时，TGF-β诱导的胶原蛋白1A的表达增加受到很大抑制；尤其是，用2.5μM或更高浓度的脱镁叶绿酸a处理显示出对TGF-β诱导的胶原蛋白1A表达增加的抑制作用最优异。结果发现，脱镁叶绿酸a抑制了纤维化的进展。

实验例4.脱镁叶绿酸a与肺纤维化治疗剂之间的抗纤维化活性比较

实验例4.1.使用定量实时聚合酶链反应比较抗纤维化活性

使用定量实时聚合酶链反应进行基于细胞的分析实验，以分析制备例2中获得的脱镁叶绿酸a相比先前被批准为肺纤维化治疗剂的尼达尼布和吡非尼酮的抗纤维化活性。

在含有10％FBS的DMEM培养基中培养人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞。然后将约2×10

24小时后，在用浓度为5ng/ml的TGF-β处理后，诱导细胞纤维化6小时。6小时后，用制备例2中得到的脱镁叶绿酸a或肺纤维化治疗剂处理细胞，再培养18小时。然后，阴性对照组不予处理，阳性对照组仅用浓度为5ng/ml的TGF-β处理，实验组用浓度为5ng/ml的TGF-β处理并且6小时后分别用浓度为2.5μM或5μM的脱镁叶绿酸a、浓度为1μM的尼达尼布和浓度为1mM的吡非尼酮处理。

18小时后，除去培养基，加入PBS缓冲液洗涤细胞2次，向其中直接添加0.5ml RNA提取物(trizol试剂，Thermo Fisher Scientific)，随后使其室温静置10分钟。然后，加入0.1ml氯仿并搅拌15秒，然后以约12000×g离心10分钟。

分离上清液，加入相同体积的异丙醇并以12000×g离心10分钟。然后除去液体，所得材料用75％乙醇洗涤一次，然后在室温下干燥。干燥后，向其中加入约50μl不含RNAase的纯化蒸馏水，并使用分光光度计测定所得RNA的量和纯度。

为了使用获得的RNA来合成cDNA，将2μg纯化的总RNA与oligo dT在70℃下进行5分钟退火反应，然后添加10×逆转录缓冲溶液、10mM dNTP、RNAse抑制剂和M-MLV逆转录酶(Enzynomics，Korea)以在42℃下进行60分钟的cDNA合成反应。

cDNA合成反应完成后，于72℃加热5分钟使逆转录酶灭活，然后加入RNaseH去除单链RNA，得到最终的cDNA。通过定量实时聚合酶链反应观察肌成纤维细胞的特征基因α-平滑肌肌动蛋白基因、纤维化特征基因CCN2(或CTGF)基因、纤维化特征基因纤连蛋白和被称为活性氧类的量的主要调节剂的NOX4(NADPH氧化酶4)基因的表达是否发生变化。将GAPDH基因一起定量以纠正表达差异。在定量实时聚合酶链反应中所用的基因的核苷酸序列如下表2所示。

[表2]

根据图7至图10所示的实验结果，发现当用TGF-β处理人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞时，α-SMA、CTGF和NOX4基因的表达增加，并证实了用浓度为2.5μM和5μM的脱镁叶绿酸a进行处理显著抑制了TGF-β诱导的α-SMA、CTGF和NOX4基因的表达。另一方面，证实了1μM尼达尼布和1mM吡非尼酮对TGF-β诱导的α-SMA、CTGF和NOX4基因表达的抑制较弱或几乎不抑制。结果证实，在相同条件下，与现有的肺纤维化治疗剂尼达尼布和吡非尼酮相比，脱镁叶绿酸a表现出显著优异的抗纤维化活性。

实验例4.2.基于纤维化相关蛋白表达比较抗纤维化活性

使用免疫印迹法进行基于细胞的分析实验，以分析脱镁叶绿酸a相比先前被批准为肺纤维化治疗剂的尼达尼布和吡非尼酮的抗纤维化活性。

在含有10％FBS的DMEM培养基中培养人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞。然后将约2×10

24小时后，在用浓度为5ng/ml的TGF-β处理后，诱导细胞纤维化6小时。然后，用制备例2中得到的脱镁叶绿酸a或肺纤维化治疗剂处理细胞，再培养18小时。然后，阴性对照组不予处理，阳性对照组仅用浓度为5ng/ml的TGF-β处理，实验组用浓度为5ng/ml的TGF-β处理并且6小时后分别用浓度为2.5μM或5μM的脱镁叶绿酸a、浓度为1μM的尼达尼布和浓度为1mM的吡非尼酮处理。

18小时后，去除培养基并通过加入PBS缓冲溶液洗涤细胞两次，并向其中直接添加含有蛋白酶抑制剂的100μl RIPA缓冲溶液(150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸、0.1％SDS、50mM Tris pH 7.5)。10分钟后，使用刮刀回收细胞并转移到微型管中并以约12000×g离心10分钟。

获得分离的上清液并转移到新的微型管中，然后使用二辛可宁酸测定(BCA测定)蛋白质定量试剂盒对蛋白质进行定量。对含有等量蛋白质的每个样本进行电泳，然后进行免疫印迹。抗α-SMA、抗胶原蛋白1A和抗纤连蛋白用作一抗，抗小鼠IgG HRP或抗兔IgG HRP用作二抗。使用用于校正的抗β-肌动蛋白抗体对蛋白质表达的差异进行校正。

根据图11所示的实验结果，发现当用TGF-β处理人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞时，α-SMA、胶原蛋白1A和纤连蛋白基因的表达增加，并证实了用浓度为2.5μM和5μM的脱镁叶绿酸a进行处理显著抑制了TGF-β诱导的α-SMA、胶原蛋白1A和纤连蛋白的表达。另一方面，证实了1μM尼达尼布和1mM吡非尼酮对TGF-β诱导的α-SMA、胶原蛋白1A和纤连蛋白表达的抑制较弱或几乎不抑制。结果证实，在相同条件下，与现有的肺纤维化治疗剂尼达尼布和吡非尼酮相比，脱镁叶绿酸a表现出显著优异的抗纤维化活性。

实验例4.3.使用免疫细胞化学染色法分析抗纤维化活性

使用免疫细胞化学染色法进行基于细胞的分析实验，以分析脱镁叶绿酸a相比先前被批准为肺纤维化治疗剂的尼达尼布和吡非尼酮的抗纤维化活性。

在含有10％FBS的DMEM培养基中培养人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞。然后将约2×10

24小时后，在用浓度为5ng/ml的TGF-β处理后，诱导细胞纤维化6小时。6小时后，用2.5μM或5μM脱镁叶绿酸a、1μM尼达尼布或1mM吡非尼酮处理细胞。

每个样本的免疫组织化学分析按如下进行。首先，将样本用PBS缓冲液洗涤两次，然后加入4％甲醛固定1小时，抗胶原蛋白1A作为一抗，Alexa Fluor 488作为二抗。使用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色，并使用荧光显微镜分析荧光强度的差异。

作为实验结果，如图12所示，通过荧光强度证实了在阴性对照CCD8-Lu细胞中胶原蛋白1A的表达低，而当用5ng/ml TGF-β处理时胶原蛋白1A的表达显著增加。此外，证实了当用5ng/ml TGF-β进行处理并且6小时后用脱镁叶绿酸a进行处理时，浓度为2.5μM和5μM的脱镁叶绿酸a显著抑制了TGF-β诱导的增加的胶原蛋白1A表达。另一方面，证实了1μM尼达尼布对TGF-β诱导的胶原蛋白1A蛋白表达的抑制较弱。结果证实，在相同条件下，与现有的肺纤维化治疗剂尼达尼布相比脱镁叶绿酸a表现出显著优异的抗纤维化活性。

实验例5.与纤维化相关的磷酸化蛋白的表达调控的确认

使用免疫印迹法进行基于细胞的测定实验，以确定脱镁叶绿酸a对TGF-β信号通路中磷酸化的影响。

使用免疫印迹法进行基于细胞的分析实验，以分析脱镁叶绿酸a相比先前被批准为肺纤维化治疗剂的尼达尼布和吡非尼酮的抗纤维化活性。

在含有10％FBS的DMEM培养基中培养人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞。然后将约2×10

24小时后，在用浓度为5ng/ml的TGF-β处理后，诱导细胞纤维化6小时。然后，用制备例2中得到的脱镁叶绿酸a或肺纤维化治疗剂处理细胞，再培养18小时。然后，阴性对照组不予处理，阳性对照组仅用浓度为5ng/ml的TGF-β处理，实验组用浓度为5ng/ml的TGF-β处理并且6小时后分别用浓度为5μM的脱镁叶绿酸a和浓度为1μM的尼达尼布进行处理。

1小时后，去除培养基并通过加入PBS缓冲溶液洗涤细胞两次，并向其中直接添加含有蛋白酶抑制剂的100μl的RIPA缓冲溶液(150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸、0.1％SDS、50mM Tris pH 7.5)。10分钟后，使用刮刀回收细胞并转移到微型管中并以约12000×g离心10分钟。

获得分离的上清液并转移到新的微型管中，然后使用二辛可宁酸测定(BCA测定)蛋白质定量试剂盒对蛋白质进行定量。对含有等量蛋白质的每个样本进行电泳，然后进行免疫印迹。抗pSmad3抗体、抗Smad3抗体、抗pERK抗体和抗ERK抗体用作一抗，抗小鼠IgG HRP或抗兔IgG HRP用作二抗。

根据图13所示的实验结果，发现当用TGF-β处理人肺来源的成纤维细胞CCD8-Lu细胞时，磷酸化Smad3和磷酸化ERK的表达增加，并证实了用浓度为5μM的脱镁叶绿酸a进行处理显著抑制了TGF-β诱导的磷酸化Smad3和磷酸化ERK的表达。另一方面，证实了1μM尼达尼布几乎不抑制TGF-β诱导的磷酸化Smad3和磷酸化ERK的表达。结果，证实了脱镁叶绿酸a通过抑制TGF-β诱导的磷酸化Smad3和磷酸化ERK蛋白的表达而表现出抗纤维化功效。

实验例6.脱镁叶绿酸a对肺纤维化模型小鼠抗纤维化作用的鉴定

在本实验中，评估了脱镁叶绿酸a在肺纤维化模型中的抗纤维化作用，其中通过用博来霉素(BLM)(NIPPON KAYAKU，KIT代号NA)处理C57BL/6NCrl0ri小鼠(Orient Bio)诱导肺纤维化。实验组如下表3所示。

[表3]

将小鼠称重并分为总共7组，然后第1天，对溶媒对照组中用无菌生理盐水进行气管内施用，对除溶媒对照组以外的其他组中用BLM进行气管内施用以诱导肺纤维化。然后，从第1天到第21天，将不含有效物质的DMSO(sigma D2650-5X)施用于溶媒对照组和阴性对照组(纤维化对照组)。

此外，T1至T4组和阳性对照组分别每日1次口服施用有效物质(脱镁叶绿酸a)和尼达尼布。但是，在第1天在气管内施用BLM前一小时，口服施用有效物质或赋形剂。

施用后，每天观察一次死亡和垂死状态，每天观察两次全身症状，例如外观和行为变化。当判断为异常时，更广泛地观察动物并且增加频率，在显示出与严重疼痛或死亡相当的毒性时实施安乐死。在施用期间总共测量体重7次(第1、2、4、8、11、15和18天)，并且在尸检当天测量一次。

在第22天，通过吸入异氟醚对动物实施安乐死并进行尸检。先切开后腔静脉和隐静脉释放血液以排血，观察到胸腔和腹腔外观存在异常，然后取出肺。将取出的肺称重，并将其一部分(左肺)用10％中性缓冲福尔马林溶液固定以进行组织病理学检查。由固定的肺制备组织标本，用苏木精和曙红(H&E)染色并进行组织病理学检查。通过使用以下计算公式来计算取出的肺的器官重量比。

<等式1>

器官重量比＝肺总重(g)/总体重(g)

实验结果用平均值和标准差表示，并使用Prisima系统或统计分析系统(SAS/STAT)进行统计分析。

在使用Pristima系统进行统计分析的情况下，通过多重比较分析进行组间比较。将实验数据用Bartlett检验进行方差齐性检验，然后采用单因素方差分析(ANOVA)检验同方差数据，并通过Dunnett检验来分析组间差异。非同方差数据通过Kruskal-Wallis检验来分析，施用组与对照组差异通过Dunn秩和检验来分析。或者，对两组之间的方差齐性进行F检验。

在使用SAS/STAT进行统计分析中，两组间方差齐性检验采用F检验来进行。对同方差数据进行学生t检验以验证组间差异，对非同方差数据进行Wilcoxon秩和检验。实验结果的统计分析方法总结在表4中。

[表4]

结果，证实了在肺纤维化模型中，与阴性对照组相比，施用脱镁叶绿酸a的组显示出抗纤维化作用。此外，证实了与施用了尼达尼布的阳性对照组相比，施用脱镁叶绿酸a的组显示出显著的抗纤维化效果。

序列表

<110> 白雁生物技术公司

<120> 用于预防或治疗纤维化的包含脱镁叶绿酸化合物作为活性成分的药物组合物

<130> SPO20-033_PCT_PBT

<150> KR 10-2019-164277

<151> 2019-12-11

<160> 11

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合Smad基因的核苷酸

<400> 1

ggtgtctaga catagtctag aca 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α-SMA-S

<400> 2

gcccagccaa gcactgtcag ga 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> alpha-SMA-AS

<400> 3

tcccaccatc accccctgat gtc 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTGF-S

<400> 4

ggcttaccga ctggaagac 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTGF-AS

<400> 5

aggaggcgtt gtcattgg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白-S

<400> 6

gtggctgaag acacaaggaa 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白-AS

<400> 7

cctgccattg taggtgaat 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NOX4-S

<400> 8

cacctctgcc tgttcatctg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NOX4-AS

<400> 9

ggctctgctt agacacaatc c 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-S

<400> 10

gtctcctctg acttcaacag cg 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-AS

<400> 11

accaccctgt tgctgtagcc aa 22