一种甘蔗白叶病植原体基因组DNA的纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于基因组测序的甘蔗白叶病植原体基因组DNA纯化方法。

背景技术

甘蔗白叶病是由植原体引起的甘蔗毁灭性病害，可造成甘蔗和制糖产业巨大的经济损失。亟需对其进行深入的研究。

植原体只能寄生在植物或昆虫的活细胞内，迄今为止无法在人工培养基上进行培养。病原物的基因组序列是从分子水平开展病害研究的重要基础，对于植原体这类不能体外培养的病原菌来说，获得基因组序列对于研究尤为重要。

由于植原体无法在体外培养，因此很难获得纯的植原体DNA。使用感染宿主的总DNA对植原体基因组进行测序是非常低效的，只有极少的测序读数来自植原体。因此，开展植原体基因组测序必须进行基因组DNA的纯化。目前对植原体基因组DNA纯化方法主要是使用密度梯度离心或脉冲场凝胶电泳，然而这些方法步骤繁琐、耗时，并且需要超速离心机和脉冲场电泳系统等昂贵的设备，一般的实验室很难开展此项研究。

因此，如何提供一种植原体基因组DNA的纯化方法，以解决现有技术中纯化方法繁琐，成本高的技术问题，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蔗白叶病植原体基因组DNA的制备方法，以解决现有技术当中植原体基因组DNA的纯化方法复杂，成本高的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种甘蔗白叶病植原体基因组DNA的纯化方法，包括如下步骤：

(1)将甘蔗与PBS溶液混合研磨后一次离心弃上清，加入PBS溶液重悬、二次离心弃上清，再使用PBS溶液重悬，得重悬液；

(2)将步骤(1)得到的重悬液过滤得滤液，离心得沉淀1；

(3)将步骤(2)得到的全部沉淀1加入DNase I和DNase I Buffer混合，一次水浴，加入EDTA，二次水浴，离心得沉淀2；

(4)将步骤(3)得到的全部沉淀2加入溶菌酶、RNaseA和蛋白酶K混合静置，再加入裂解液，水浴，依次加入苯酚、氯仿，离心取上清，加入无水乙醇静置，得混合液；

(5)将步骤(4)得到的混合液转移至核酸吸附柱中，一次离心弃滤液，吸附柱用乙醇洗涤，二次离心弃滤液，将核酸吸附柱置于收集管中，空柱三次离心，向吸附柱中央悬空滴加ddH

优选的，步骤(1)所述一次离心、二次离心的转速为11000～13000rmp，时间为2～4min；

步骤(2)、步骤(3)所述离心的转速为11000～13000rmp，时间为4～6min。

优选的，步骤(1)所述PBS溶液为1×PBS，用量为35～45mL，甘蔗叶用量为8～12g。

优选的，步骤(2)所述重悬液依次使用100μm、70μm、40μm细胞过滤器和10μm、5μm针头过滤器过滤。

优选的，步骤(3)所述DNaseI的用量为8～12μL，所述DNaseI Buffer的用量为150～250μL；

DNaseI与EDTA的比例为1：2(v:v)。

优选的，步骤(4)所述溶菌酶的用量为150～250μL、所述RNaseA的用量为15～25μL，所述蛋白酶K的用量为15～25μL。

优选的，步骤(4)所述裂解液为100mmol/L pH7.0的Tris-HCl，500mmol/LpH8.0的EDTA，20mmol/L NaCl，10％SDS；所述裂解液的用量为450～550μL。

优选的，步骤(4)所述苯酚的用量为250～350μL；所述氯仿的用量为250～350μL；所述无水乙醇的用量为900～1100μL。

优选的，步骤(5)所述乙醇的用量为550～650μL；所述ddH

优选的，步骤(4)所述离心的转速为9000～11000rmp，时间为4～6min；

步骤(5)所述一次离心、二次离心、三次离心、四次离心的转速为9000～11000rmp，时间为0.5～2.5min。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明提供了一种简便、快速的甘蔗白叶病植原体基因组DNA的纯化方法。与现有的使用密度梯度离心或脉冲场凝胶电泳纯化植原体DNA的方法相比，不需要昂贵的设备和试剂，方便快捷，获得的甘蔗白叶病植原体基因组DNA满足高通量基因组测序要求。

2、本发明涉及一种用于基因组测序的甘蔗白叶病植原体基因组DNA纯化方法。本发明通过研磨裂解甘蔗叶片细胞释放甘蔗白叶病植原体，通过多次重悬去除大量释放的寄主DNA，根据甘蔗白叶病植原体菌体大小，使用优化的过滤方案除去寄主细胞并获得甘蔗白叶病植原体，使用DNA酶去除残余的寄主DNA，最后提取甘蔗白叶病植原体DNA。

使用本发明提供的方法能够获得满足二代基因组测序要求的高纯度甘蔗白叶病植原体基因组DNA，二代高通量测序证实读数序列大部分为甘蔗白叶病植原体序列。相比于目前常用的植原体基因组DNA的纯化方法，本方法具有成本低廉、操作步骤简单、提取耗时短等优势，适用于大量甘蔗白叶病植原体基因组测序DNA的制备。

3、需要说明的是，本发明所得到的沉淀1和沉淀2量非常少，不好表示，沉淀1和沉淀2都是全部使用，试剂具体写成了实际操作过程中的用量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为甘蔗CYC基因PCR检测图。其中，M为DNA Marker E，1号泳道为病叶提取的总DNA，2号泳道为研磨匀浆液提取的总DNA，3号泳道为使用本方法(实施例1)纯化的DNA；使用本方法纯化的DNA未检测到甘蔗CYC基因，表明本方法对于甘蔗DNA的去除效果较好。

图2为甘蔗白叶病植原体secA基因PCR检测图；其中，M为DNA Marker E，1号泳道为病叶提取的总DNA，2号泳道为研磨匀浆液提取的总DNA，3号泳道为使用本方法(实施例1)纯化的DNA；使用本方法纯化的DNA检测甘蔗白叶病植原体secA基因的PCR条带明亮，与病叶和研磨匀浆液提取的总DNA检测效果相当，表明纯化后甘蔗白叶病植原体DNA损失较小。

图3为验证甘蔗基因组DNA去除情况的定量PCR检测图；检测的基因为甘蔗APRT基因和CYC基因(实施例1)；相对于纯化前，本方法纯化后甘蔗APRT基因和CYC基因数量降低了96％和99.9％，表明甘蔗基因组DNA除去效果较好。

图4为二代高通量测序中甘蔗白叶病植原体读数占比。使用甘蔗病叶提取的总DNA进行二代高通量测序只有0.55％的测序读数为甘蔗白叶病植原体序列，而使用本方法纯化的DNA进行二代高通量测序87.79％的测序读数为甘蔗白叶病植原体DNA。

具体实施方式

本发明提供了一种甘蔗白叶病植原体基因组DNA的纯化方法，包括如下步骤：

(1)将甘蔗与PBS溶液混合研磨后一次离心弃上清，加入PBS溶液重悬、二次离心弃上清，再使用PBS溶液重悬，得重悬液(叶片研磨形成的匀浆，主要包括破碎的植物细胞和释放的甘蔗白叶病植原体)；

(2)将步骤(1)得到的重悬液过滤得滤液，离心得沉淀1(过滤除去植物细胞得到甘蔗白叶病植原体菌体)；

(3)将步骤(2)得到的全部沉淀1加入DNase I和DNase I Buffer混合，一次水浴，加入EDTA，二次水浴，离心得沉淀2(进一步使用DNase I除去残余的寄主DNA)；

(4)将步骤(3)得到的全部沉淀2加入溶菌酶、RNaseA和蛋白酶K混合静置(破坏甘蔗白叶病植原体菌体，除去RNA和蛋白)，再加入裂解液，水浴，依次加入苯酚、氯仿，离心取上清，加入无水乙醇静置，得混合液(释放甘蔗白叶病植原体DNA，除去蛋白，多糖，酚类等杂质，使用无水乙醇沉淀DNA)；

(5)将步骤(4)得到的混合液转移至核酸吸附柱中，一次离心弃滤液，吸附柱用乙醇洗涤，二次离心弃滤液，将核酸吸附柱置于收集管中，空柱三次离心，向吸附柱中央悬空滴加ddH

在本发明中，步骤(1)所述一次离心、二次离心的转速为11000～13000rmp；优选为12000rmp。

在本发明中，步骤(1)所述一次离心、二次离心的时间为2～4min；优选为3min。

在本发明中，步骤(2)、步骤(3)所述离心的转速为11000～13000rmp；优选为12000rmp。

在本发明中，步骤(2)、步骤(3)所述离心的时间为4～6min；优选为5min。

在本发明中，步骤(1)所述PBS溶液为1×PBS，用量为35～45mL；优选为37～43mL；进一步优选为39～41mL；更优选为40mL。

甘蔗叶用量为8～12g；优选为9～11g；进一步优选为10g。

在本发明中，步骤(2)所述重悬液依次使用100μm、70μm、40μm细胞过滤器和10μm、5μm针头过滤器过滤。

在本发明中，步骤(3)DNase I的用量为8～12μL；优选为9～11μL；进一步优选为10μL。

在本发明中，步骤(3)DNase I Buffer的用量为150～250μL；优选为170～230μL；进一步优选为190～210μL；更优选为200μL。

在本发明中，步骤(3)DNase I与EDTA的比例为1：2(v:v)。

在本发明中，步骤(4)所述溶菌酶的用量为150～250μL；优选为170～230μL；进一步优选为190～210μL；更优选为200μL。

所述RNaseA的用量为15～25μL；优选为；进一步优选为；更优选为。

所述蛋白酶K的用量为15～25μL；优选为17～23μL；进一步优选为19～21μL；更优选为20μL。

在本发明中，步骤(4)所述裂解液为100mmol/L pH7.0的Tris-HCl，500mmol/LpH8.0的EDTA，20mmol/L NaCl，10％SDS；

所述裂解液的用量为450～550μL；优选为470～530μL；进一步优选为490～510μL；更优选为500μL。

在本发明中，步骤(4)所述苯酚的用量为250～350μL；优选为270～330μL；进一步优选为290～310μL；更优选为300μL。

在本发明中，步骤(4)所述氯仿的用量为250～350μL；优选为270～330μL；进一步优选为290～310μL；更优选为300μL。

在本发明中，步骤(4)所述无水乙醇的用量为900～1100μL；优选为950～1050μL；进一步优选为1000μL。

在本发明中，步骤(5)所述乙醇的用量为550～650μL；优选为570～630μL；进一步优选为590～610μL；更优选为600μL。

在本发明中，步骤(5)所述ddH

在本发明中，步骤(4)所述离心的转速为9000～11000rmp；优选为10000rmp。

在本发明中，步骤(4)所述离心的时间为4～6min；优选为5min。

在本发明中，步骤(5)所述一次离心、二次离心、三次离心、四次离心的转速为9000～11000rmp；优选为10000rmp。

在本发明中，步骤(5)所述一次离心、二次离心、三次离心、四次离心的时间为0.5～2.5min；优选为1～2min；进一步优选为1.5min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种甘蔗白叶病植原体基因组DNA的纯化方法，步骤如下：

1、取甘蔗叶片10g，无菌水洗净后剪碎放入研钵中，加1×PBS溶液研磨至匀浆状；

2、研磨匀浆加入50mL离心管中，12000rmp离心3分钟，弃上清，1×PBS溶液重悬，12000rmp离心3分钟，弃上清，1×PBS溶液再次重悬；

3、重悬液依次使用100μm、70μm、40μm细胞过滤器过滤，过滤时使用玻棒搅动；

4、针头注射器吸取滤液，使用10μm、5μm针头过滤器过滤，针头过滤器堵塞导致注射器推不动时，及时更换新的针头过滤器，50mL离心管收集滤液，12000rpm离心5min，弃上清；

5、离心管中加入10μL DNase I和200μL DNase I Buffer，涡旋混匀，37℃水浴10min后加入20μL EDTA(25mmol/L)，65℃水浴10min，之后将所有溶液转移至1.5mL离心管中，12000rpm离心5min，弃上清；

6、离心管中加入200μL溶菌酶悬浮菌体，加入20μL RNaseA(20mg/mL)和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，室温静置1min；

7、加入500μL的裂解液，50℃水浴20min，加入300μL的苯酚，混匀，再加入氯仿300μL，混匀，10000rpm离心5min，转移上清液至新离心管，加入1mL无水乙醇，混匀，室温放置5min；

8、全部混合液(包括絮状物)转移至核酸吸附柱中，10000rpm离心1min，弃滤液，吸附柱中600μL 70％的乙醇洗涤，10000rpm离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中，10000rpm空柱离心2min，将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附柱中央悬空滴加50μLddH

9、收集的DNA溶液送测序公司进行基因组测序(序列读数结果如图4所示)。

实施例2

一种甘蔗白叶病植原体基因组DNA的纯化方法，步骤如下：

1.取甘蔗叶片8g，无菌水洗净后剪碎放入研钵中，加1×PBS溶液研磨至匀浆状；

2.研磨匀浆加入50mL离心管中，11000rmp离心2分钟，弃上清，1×PBS溶液重悬，11000rmp离心2分钟，弃上清，1×PBS溶液再次重悬；

3.重悬液依次使用100μm、70μm、40μm细胞过滤器过滤，过滤时使用玻棒搅动；

4.针头注射器吸取滤液，使用10μm、5μm针头过滤器过滤，针头过滤器堵塞导致注射器推不动时，及时更换新的针头过滤器，50mL离心管收集滤液，11000rpm离心4min，弃上清；

5.离心管中加入10μL DNase I和200μL DNase I Buffer，涡旋混匀，37℃水浴10min后加入20μL EDTA(25mmol/L)，65℃水浴10min，之后将所有溶液转移至1.5mL离心管中，11000rpm离心4min，弃上清；

6.离心管中加入200μL溶菌酶悬浮菌体，加入15μL RNaseA(20mg/mL)和15μL蛋白酶K(20mg/mL)，室温静置1min；

7.加入500μL的裂解液，50℃水浴20min，加入250μL的苯酚，混匀，再加入氯仿250μL，混匀，9000rpm离心4min，转移上清液至新离心管，加入1mL无水乙醇，混匀，室温放置5min；

8.全部混合液(包括絮状物)转移至核酸吸附柱中，9000rpm离心1min，弃滤液，吸附柱中550μL 70％的乙醇洗涤，9000rpm离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中，9000rpm空柱离心2min，将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附柱中央悬空滴加45μLddH2O，室温放置2min，9000rpm离心1min。

9.收集的DNA溶液送测序公司进行基因组测序。

实施例3

一种甘蔗白叶病植原体基因组DNA的纯化方法，步骤如下：

1.取甘蔗叶片12g，无菌水洗净后剪碎放入研钵中，加1×PBS溶液研磨至匀浆状；

2.研磨匀浆加入50mL离心管中，13000rmp离心4分钟，弃上清，1×PBS溶液重悬，13000rmp离心4分钟，弃上清，1×PBS溶液再次重悬；

3.重悬液依次使用100μm、70μm、40μm细胞过滤器过滤，过滤时使用玻棒搅动；

4.针头注射器吸取滤液，使用10μm、5μm针头过滤器过滤，针头过滤器堵塞导致注射器推不动时，及时更换新的针头过滤器，50mL离心管收集滤液，12000rpm离心6min，弃上清；

5.离心管中加入10μL DNase I和200μL DNase I Buffer，涡旋混匀，37℃水浴10min后加入20μL EDTA(25mmol/L)，65℃水浴10min，之后将所有溶液转移至1.5mL离心管中，13000rpm离心6min，弃上清；

6.离心管中加入200μL溶菌酶悬浮菌体，加入25μL RNaseA(20mg/mL)和25μL蛋白酶K(20mg/mL)，室温静置1min；

7.加入550μL的裂解液，50℃水浴20min，加入300μL的苯酚，混匀，再加入氯仿350μL，混匀，11000rpm离心6min，转移上清液至新离心管，加入1mL无水乙醇，混匀，室温放置5min；

8.全部混合液(包括絮状物)转移至核酸吸附柱中，11000rpm离心1min，弃滤液，吸附柱中650μL 70％的乙醇洗涤，11000rpm离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中，11000rpm空柱离心2min，将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附柱中央悬空滴加55μLddH

9.收集的DNA溶液送测序公司进行基因组测序。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。