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一种提高植酸酶热稳定性的方法及突变体APPAmut6和应用

文献发布时间：2023-06-19 16:11:11

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高植酸酶热稳定性的方法及突变体APPAmut6和应用。

背景技术

植酸酶（Phytase）,即肌醇六磷酸磷酸水解酶（myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolases）是一类能够催化植酸盐水解为肌醇、肌醇磷酸酯和无机磷酸盐的磷酸酶。植酸酶在食品加工、环境保护、生物燃料生产等多种行业中存在广泛应用价值，目前最常见的则是作为饲料添加剂。鉴于饲料制粒加工过程瞬时高温的工艺要求，耐热性成为制约植酸酶工业应用的瓶颈问题之一。

解折叠自由能ΔG反映了蛋白质折叠态和解折叠态之间吉布斯自由能的差异，是反映蛋白质热稳定性的重要指标，差值越大，蛋白质变性所需能量越高，代表蛋白质越稳定。因此通过分析突变前后ΔG的变化（即ΔΔG），可以确定某些位点突变对蛋白质的热稳定性的影响。然而，目前ΔG存在多种不同的计算方法，如可以通过计算氢键、盐键等能量之和获得，也可以通过计算原子势和扭转角势获得，且不同方法所得结果存在差异。因此可以选择不同方法分别对蛋白质突变前后的ΔΔG进行计算，之后对所得结果进行统计分析及实验验证，以获得热稳定性提高的植酸酶突变体。

发明内容

本发明的目的是提供以来源于

本发明的再一目的是提供上述植酸酶突变体的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述植酸酶突变体编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述植酸酶突变体编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备热稳定性提高的植酸酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述植酸酶突变体的应用。

本发明对来源于

根据本申请的热稳定性提高的植酸酶突变体，所述突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示氨基酸序列突变序列，其中，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的突变位点为选自以下突变位点之一或任意组合：

第65位氨基酸由G突变为R；

第89位氨基酸由A突变为V；

第282位氨基酸由E突变为L；

第339位氨基酸由G突变为V；

第365位氨基酸由G突变为D；或

第405位氨基酸由Q突变为L。

根据本申请的技术方案，同时将APPAmut4的第65位氨基酸由G突变为R，第89位氨基酸由A突变为V，第282位氨基酸由E突变为L，第339位氨基酸由G突变为V，第365位氨基酸由G突变为D，第405位氨基酸由Q突变为L，得到突变体APPAmut6。

根据本发明的具体实施方式，所述APPAmut4的突变体APPAmut6的氨基酸序列SEQID NO:2所示。

根据本发明的具体实施方式，植酸酶APPAmut4的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了编码上述植酸酶突变体的基因。

根据本发明的具体实施方式，植酸酶突变体APPAmut6的编码基因序列如SEQ IDNO:4所示。

根据本发明的提高植酸酶的热稳定性的方法包括以下步骤：

将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的植酸酶至少进行以下突变之一或任意组合：

第65位氨基酸由G突变为R；

第89位氨基酸由A突变为V；

第282位氨基酸由E突变为L；

第339位氨基酸由G突变为V；

第365位氨基酸由G突变为D；或

第405位氨基酸由Q突变为L。

根据本申请的提高植酸酶的热稳定性的方法，包括以下步骤，同时将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的植酸酶进行以下突变：

同时将APPAmut4的第65位氨基酸由G突变为R，第89位氨基酸由A突变为V，第282位氨基酸由E突变为L，第339位氨基酸由G突变为V，第365位氨基酸由G突变为D，第405位氨基酸由Q突变为L，得到突变体APPAmut6。

本发明提供了包含上述植酸酶突变体的编码基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述植酸酶突变体的编码基因的重组菌株。

根据本发明的具体实施方式，制备热稳定性提高的植酸酶的方法如下所述：

(1)用含有植酸酶突变体的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导植酸酶表达；

(3)回收并纯化所表达的植酸酶。

本发明的有益效果：

本发明对植酸酶进行了系列突变，这些突变通过降低解折叠自由能，从而显著提高了酶的热稳定性。本发明对植酸酶APPAmut4进行突变，植酸酶突变体与亲本相比，植酸酶热稳定性增强，APPAmut4在65°C下处理10 min后，剩余酶活为12.3%，突变体APPAmut6剩余酶活为77.1%。本发明克服了现有技术的不足，提供了具有高热稳定性的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的植酸酶突变体。因此，本发明提供的植酸酶突变体可以很好的应用于能源、食品和饲料行业中，有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示植酸酶APPAmut4与各单点突变体的最适温度对比；

图2显示植酸酶APPAmut4与组合突变体APPAmut6的最适温度对比；

图3显示植酸酶APPAmut4与各单点突变体在65 °C下处理的热稳定性对比；

图4显示植酸酶APPAmut4与组合突变体APPAmut6在65 °C下处理的热稳定性对比；

图5显示植酸酶APPAmut4与突变体在65 °C下的

具体实施方式

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：表达宿主为

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶等试剂均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

（1）大肠杆菌培养基低盐LB（LLB）（1 %蛋白胨、0.5 %酵母提取物、0.5 % NaCl，pH自然）；

（2）毕赤酵母培养基YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，pH自然）；

（3）BMGY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%甘油，1.34% YNB，0.00004%生物素，pH自然）；

（4）BMMY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.5%甲醇，1.34% YNB，0.00004%生物素，pH自然）；

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

植酸酶活性测定方法：

将酶液用0.1 mol/L含有0.05% BSA和0.05% Triton X-100的pH 5.5 HAc-NaAc缓冲液进行稀释，将100 µL稀释后的酶液加入到900 µL植酸钠底物(用0.1 mol/L的pH 5.5的HAc-NaAc缓冲液配制)中，在37°C反应10 min，加入1 mL 10%(W/V)TCA终止反应，最后加入1 mL显色液[1%(W/V)四水合钼酸铵，3.2%(V/V)浓硫酸，7.32%(W/V)硫酸亚铁]进行显色。对照则是在加酶液之前先加入TCA混匀使酶变性，其他相同。显色后，在700 nm光吸收下测定OD值，计算酶活。

实施例1、植酸酶的定点突变

以来源于

第65位氨基酸由G突变为R；

第89位氨基酸由A突变为V；

第282位氨基酸由E突变为L；

第339位氨基酸由G突变为V；

第365位氨基酸由G突变为D；

第405位氨基酸由Q突变为L。

同时进行上述突变得到突变体APPAmut6。

定点突变参照

表1 定点突变所需引物

实施例2、植酸酶工程菌株的构建

以质粒pPICZαA-

实施例3、APPAmut4及突变体植酸酶的制备

（1）蛋白的诱导表达

将得到的重组表达菌株接种至YPD培养基中进行种子培养，200 rpm，30 °C培养48h后，以1%接种量转接至BMGY培养基中，200 rpm，30°C培养48 h。之后4500 rpm离心5 min，弃上清，收集菌体并加入含有0.5%甲醇的BMMY培养基进行诱导表达，每12 h补加0.5%甲醇，共诱导48 h。

（2）蛋白的纯化

将诱导表达后的菌液12000 rpm离心10 min，收集上清进行浓缩，再用20 mM pH8.0 Tris-HCl进行透析。然后将透析后的酶液进行阴离子交换层析，A液为20 mM pH 8.0Tris-HCl，B液为A液加1 M NaCl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。

实施例4、APPAmut4及突变体植酸酶的性质测定

（1）最适温度测定

在0.1mol/L pH 5.5 HAc-NaAc缓冲液条件下，分别在不同温度（30 °C、35 °C、40°C、45 °C、50 °C、55°C、60 °C、65 °C和70 °C）下对APPAmut4和突变体的酶活性进行测定来确定最适温度，最适温度对应活性定义为100%，依次计算其余温度下的剩余酶活。如图1所示，APPAmut4的最适温度为55 °C，单点突变体G339V的最适温度降为45 °C，其余单点突变体的最适温度保持不变。对于组合突变体APPAmut6，如图2所示，其最适温度为45 °C。

（2）热稳定性测定

将纯化所得蛋白用0.1 mol/L含有0.05% BSA和0.05% Triton X-100的pH 5.5HAc-NaAc缓冲液稀释至合适倍数后，取100 μL于1.5 mL EP管中，分别在65 °C下保温不同时间（0、2、5、10、15和30 min），之后测定对应酶活，以保温0 min的活性为100%，计算不同保温时间下的剩余酶活。

如图3所示，APPAmut4在65 °C下处理10 min后，剩余酶活为12.3%，而各单点突变体的剩余酶活则在17.7%~30.7%之间；如图4所示，组合突变体APPAmut6在65°C下处理10min后剩余酶活为77.1%。

半衰期

其中，

式中，A

半衰期

（3）动力学参数测定

配制不同浓度的植酸钠（0.05－1.00 mM）作为底物，在37 °C、pH 5.5条件下进行植酸酶的活性测定。之后使用软件GraphPad Prism进行数据处理，拟合米氏方程并计算出

表2 APPAmut4和突变体的动力学参数

以上实施例仅用于理解本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高植酸酶热稳定性的方法及突变体APPAmut6和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 418

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Ala Ala Pro Val Ala Ile Gln Pro Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val

1 5 10 15

Val Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln

20 25 30

Leu Met Asn Asp Val Thr Pro Asp Thr Trp Pro Gln Trp Pro Val Ala

35 40 45

Ala Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gln Leu Val Thr Leu Met Gly

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Asp Tyr Phe Arg Ser Gln Gly Leu Leu Ala Ala Gly

65 70 75 80

Cys Pro Thr Asp Ala Asp Ile Tyr Ala Gln Ala Asp Val Asp Gln Arg

85 90 95

Thr Arg Leu Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Ile Ala Pro Gly Cys

100 105 110

Gly Leu Lys Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Val Asp Pro Leu

115 120 125

Phe His Pro Val Asp Ala Gly Val Cys Lys Leu Asp Ser Thr Gln Thr

130 135 140

His Lys Ala Val Glu Glu Arg Leu Gly Gly Pro Leu Ser Glu Leu Ser

145 150 155 160

Lys Arg Tyr Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Ile Leu Asn Phe

165 170 175

Ala Ala Ser Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Gln Gln Gln Gly Lys Thr Cys

180 185 190

Asp Phe Ala Asn Phe Ala Ala Asn Lys Ile Thr Val Asn Lys Pro Gly

195 200 205

Thr Lys Val Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly

210 215 220

Glu Ile Phe Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ala Met Pro Asp Val Ala Trp

225 230 235 240

His Arg Leu Thr Gly Glu Asp Asn Trp Ile Ser Leu Leu Ser Leu His

245 250 255

Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His

260 265 270

Lys Gly Thr Pro Leu Leu Gln Gln Ile Glu Thr Ala Leu Val Leu Gln

275 280 285

Arg Asp Ala Gln Gly Gln Thr Leu Pro Leu Ser Pro Gln Thr Lys Ile

290 295 300

Leu Phe Leu Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met

305 310 315 320

Leu Gly Leu Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro

325 330 335

Gly Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln

340 345 350

Arg Tyr Val Ala Val Lys Leu Phe Tyr Gln Thr Met Gly Gln Leu Arg

355 360 365

Asn Ala Glu Lys Leu Asp Leu Lys Asn Asn Pro Ala Gly Arg Val Pro

370 375 380

Val Ala Ile Asp Gly Cys Glu Asn Ser Gly Asp Asp Lys Leu Cys Gln

385 390 395 400

Leu Asp Thr Phe Gln Lys Lys Val Ala Gln Ala Ile Glu Pro Ala Cys

405 410 415

His Ile

<210> 2

<211> 418

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Ala Ala Pro Val Ala Ile Gln Pro Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val

1 5 10 15

Val Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln

20 25 30

Leu Met Asn Asp Val Thr Pro Asp Thr Trp Pro Gln Trp Pro Val Ala

35 40 45

Ala Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gln Leu Val Thr Leu Met Gly

50 55 60

Arg Phe Tyr Gly Asp Tyr Phe Arg Ser Gln Gly Leu Leu Ala Ala Gly

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Cys Pro Thr Asp Ala Asp Ile Tyr Val Gln Ala Asp Val Asp Gln Arg

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100 105 110

Gly Leu Lys Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Val Asp Pro Leu

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130 135 140

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Lys Arg Tyr Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Ile Leu Asn Phe

165 170 175

Ala Ala Ser Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Gln Gln Gln Gly Lys Thr Cys

180 185 190

Asp Phe Ala Asn Phe Ala Ala Asn Lys Ile Thr Val Asn Lys Pro Gly

195 200 205

Thr Lys Val Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly

210 215 220

Glu Ile Phe Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ala Met Pro Asp Val Ala Trp

225 230 235 240

His Arg Leu Thr Gly Glu Asp Asn Trp Ile Ser Leu Leu Ser Leu His

245 250 255

Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His

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Lys Gly Thr Pro Leu Leu Gln Gln Ile Leu Thr Ala Leu Val Leu Gln

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Leu Phe Leu Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met

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Leu Gly Leu Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro

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Gly Gly Val Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln

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Arg Tyr Val Ala Val Lys Leu Phe Tyr Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg

355 360 365

Asn Ala Glu Lys Leu Asp Leu Lys Asn Asn Pro Ala Gly Arg Val Pro

370 375 380

Val Ala Ile Asp Gly Cys Glu Asn Ser Gly Asp Asp Lys Leu Cys Gln

385 390 395 400

Leu Asp Thr Phe Leu Lys Lys Val Ala Gln Ala Ile Glu Pro Ala Cys

405 410 415

His Ile

<210> 3

<211> 1257

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

gctgctccag tcgctatcca acctactggt tacactcttg agagagttgt catcttgtct 60

agacatggtg ttagatcccc aactaagcag acccaattga tgaacgatgt gacacctgac 120

acgtggcctc aatggccagt tgcagctggt gagttgacac caagaggtgc tcagttggtt 180

actttgatgg gtggattcta cggtgactat ttcagatccc aaggattgct tgctgccggc 240

tgtcctactg atgctgacat ctacgcacaa gctgacgttg atcaaagaac tcgtttgacc 300

ggacaagcat tcttggatgg tatcgctcca ggatgtggct tgaaagttca ctaccaggct 360

gatttgaaga aggttgatcc actgttccac cctgttgatg caggtgtttg taagcttgac 420

tctactcaaa cccacaaagc tgttgaagag agattgggtg gtccattgag cgaactttcg 480

aagagatacg ccaaaccttt tgcacaaatg ggagagatcc tgaacttcgc agcgtcacct 540

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tatcagacta tgggacaatt gcgtaacgca gagaagttgg atttgaagaa caacccagcc 1140

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cttgatactt tccagaagaa ggttgctcag gccatagagc cagcttgtca catctaa 1257

<210> 4

<211> 1257

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

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agacatggtg ttagatcccc aactaagcag acccaattga tgaacgatgt gacacctgac 120

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actttgatgg gtagattcta cggtgactat ttcagatccc aaggattgct tgctgccggc 240

tgtcctactg atgctgacat ctacgttcaa gctgacgttg atcaaagaac tcgtttgacc 300