致癌CHD1L的具有抗结肠直肠癌的临床前活性的小分子抑制剂

本申请要求于2020年3月24日提交的美国临时申请62/994,259和2021年1月20日提交的美国临时申请63/139,394的权益，两者均通过引用全部并入本文。

这项发明是在国防部(DoD)授予的资助号W81XWH1810142的政府资助下完成的。美国政府对这项发明拥有某些权利。

背景技术

基因组的完整性通过染色质结构的构象变化来维持，染色质结构的构象变化调节DNA对于基因表达和复制的可接近性。染色质结构通过组蛋白的翻译后修饰和核小体的重排来维持[Lorch等人,2010；Kumar等人,2016；Swygert等人,2014]。ATP依赖的染色质重塑剂是通过改变组蛋白组成，以及通过沿DNA驱逐或移位核小体来改变染色质的酶。它们的活性通过调节基因表达和DNA对于复制、转录和DNA修复的可接近性在细胞功能中发挥关键作用[Erdel等人,2011；Brownlee等人,2015]。染色质重塑的失调与人类疾病，尤其是癌症有关[Zhang等人,2016；Valencia&Kadoch,2019]。

在过去十年中，被称为CHD1L(染色质域解旋酶/ATP酶DNA结合蛋白1样)的染色质重塑剂，也被称为ALC1(在肝癌1中扩增)，已成为一种与显著的人类癌症病理相关的癌基因(Ma等人,2008；Cheng等人,2013]。CHD1L还参与多药耐药性，从耐药外排泵(如ABCB1)的上调[Li等人,2019]到PARP1介导的DNA修复[Pines等人,2012；Tsuda等人,2017]和抗细胞凋亡活性[Li等人,2013；Chen等人,2009]。此外，CHD1L的扩增或过表达与患者的不良预后相关，包括低的总体生存率(OS)和转移性疾病[He等人,2015；Hyeon等人,2013；Su等人,2014；Mu等人,2015；Su等人,2015；Li等人,2013；He等人,2012；Chen等人,2010]。CHD1L过表达也与肿瘤进展有关，并可作为患者生存率低的预测因子[Ji等人,2013]。CHD1L的多功能致癌机制使其成为癌症中的一个有吸引力的靶标。虽然CHD1L的癌症驱动机制已在肝癌[Li等人,2019]、乳腺癌[Wu等人,2014]和肺癌[Li等人,2019]中进行了研究，但对结肠直肠癌(CRC)中与CHD1L相关的病理机制知之甚少。

CRC是每年诊断出的第三大最常见的癌症，CRC患者死亡率居世界第二[Jemal等人,2011]。CRC的早期发现结合手术和基于5-氟尿嘧啶(5FU)的联合化疗对总体生存率的改善微乎其微[Jemal等人,2011；Fakih,2015]。目前的化疗和靶向治疗对转移性CRC(mCRC)基本无效，5年的总体生存率低至11％证明了这一点[Jemal等人,2011；Fakih,2015]。本领域尚未满足识别和表征涉及CRC肿瘤进展和转移的病理学的靶标的需求。

大多数CRC患者的Wnt信号传导通路发生突变，导致T细胞因子/淋巴增强因子转录或TCF复合体异常[Kinzler&Voelstein,1996；Cancer Genome Atlas,2012]。这种突变可以导致组成型β-连环蛋白的易位和TCF转录的反式激活[Clevers,2006；Korinek等人,1997]。TCF复合体由TCF4(又称TCFL2)调控，其通过与一系列共激活因子(如β-连环蛋白、PARP1和CREB结合蛋白(CBP))的相互作用而激活[Shitashige等人,2008]。最近，TCF4被证明是腺瘤(即息肉)和晚期mCRC的早期转移的特异性驱动因子[Hyeo等人,2013；Su等人,2014]。

据报告，TCF转录作为上皮细胞-间充质转化(EMT)的主调节因子发挥作用[Sánchez-Tillá等人,2011；Zhou等人,2016；Abraham等人,2019]。这一过程可以将相对良性的上皮肿瘤细胞转化为间充质细胞，其具有增加的癌干细胞(CSC)干性(stemness)和驱动mCRC的其他恶性特性[Chaffer等人,2016]。最近有报道称，某些CRC驱动基因的改变在原发性和转移性肿瘤对中很常见[Hu等人,2019]。更具体地，据报道，异常的TCF4是mCRC的特异性驱动因子[Hu等人,2019]，以及CRC可以在早期腺瘤(即，息肉[另见Magri&Bardelli,2019])中转移，这可能是由TCF驱动的EMT引起[Chaffer等人，2016；Chaffer&Weinberg,2011]。这些报告表明TCF转录是CRC进展和转移的所有阶段的驱动力。

EMT是许多人类疾病的主要驱动力，特别是实体肿瘤进展、对药物和放射治疗的抗性、免疫应答和免疫治疗的逃避以及转移的促进[Chaffer等人2016；Chaffer&Weinberg,2011；Scheel&Weinberg,2012]。

由于Wnt信号传导通路和TCF转录在癌症和其他疾病中的重要性[Clevers,2006]，已经对抑制Wnt信号传导通路和TCF转录的小分子药物进行了检测[Lee等人,2011；Polakis,2012]。考虑的治疗策略包括受体靶标(例如Frizzled)；防止Wnt配体分泌(例如porcupine)；抑制β-连环蛋白破坏复合体(例如tankyrases)；以及使用β-连环蛋白和共激活剂(如CBP)的蛋白质-蛋白质抑制(PPI)。虽然临床试验可能正在进行中，但尚未有针对Wnt/TCF通路的药物获得临床批准[Lu等人,2016]。相比之下，本发明描述了一种新的治疗策略，特别是用于鉴定用于治疗Wnt/TCF驱动的CRC的小分子药物，其中CHD1L被鉴定为调节CRC中的恶性表型的TCF转录所需的DNA结合因子。

例如，美国专利9616047报道了β-连环蛋白的小分子抑制剂或β-连环蛋白/TCF-4复合体的破坏物，据说其可以减弱结肠癌的发生。其中报道的β-连环蛋白的抑制剂包括七叶亭，以及指定为HI-B1-HI-B20、HI-B22-HI-B-24、HI-B26、HI-B32和HI-B34的化合物，其结构均在该专利中提供。该专利在其中的一些通用化学式中进一步描述了据说可用作β-连环蛋白抑制剂和治疗结肠癌发生的化合物。本专利在此通过引用将其全部内容并入本文，其中所述的具体化合物的结构、化合物的通式和可变定义在本发明中是有用的。本文所鉴定的化合物在结构上与该专利所描述的那些不同。

CN109761909于2019年5月17日发布了报告(如欧洲专利局数据库中的英文摘要所述)，某些N-(4-(嘧啶-4-氨基)苯基)磺酰胺化合物或某些式的盐抑制Hsp90-Cdc37(热休克蛋白Hsp90及其辅助伴侣Cdc37)相互作用的客户(client)蛋白表达，并被报道用于治疗或预防由Hsp90信号通道介导的各种疾病。所公开的申请中给出的式为：

其中变量根据欧洲专利局数据库英语机器翻译定义如下：

R

R

R

该公开的申请通过引用将其全部内容并入本文中，其中所述的具体化合物的结构、化合物的通式和变量定义在本发明中有用的。该公开的申请中公开的结构可以从本申请的任何化学式中排除。

本发明检查了CHD1L在CRC中的临床病理学特征，并且本文的结果表明CHD1L是涉及TCF转录的药物靶标。本文还提出了CHD1L介导的TCF转录的机制。本文鉴定了CHD1L的小分子抑制剂，其能够在多种细胞模型(包括肿瘤类器官和患者衍生的肿瘤类器官(PDTO))中防止TCF转录、逆转EMT和其他恶性特性。本文鉴定的某些CHD1L抑制剂显示出类似药物的药理特性，包括体内药代谢动力学(PK)和药效学(PD)特征，这对于向治疗CRC和其他癌症的转化发展是重要的。

发明内容

本发明涉及CHD1L驱动的癌症、更具体地TCF转录驱动的癌症、以及还更具体地EMT驱动的癌症的治疗。CHD1L被发现是TCF转录复合体的重要组成部分。抑制CHD1L ATP酶以及抑制CHD1L依赖的TCF转录的CHDL1的小分子抑制剂已经得到鉴定。CHD1L抑制剂被认为防止TCF复合体与Wnt响应元件和启动子位点结合。更具体地，CHD1L抑制剂诱导EMT的逆转。CHD1L抑制剂可用于治疗各种癌症，尤其是CRC和m-CRC。特别是关于CRC，在实施方案中显示CHD1L抑制剂抑制癌症干细胞(CSC)干性和侵袭潜能。在实施方案中，CHD1L抑制剂诱导CRCPDTO中的细胞毒性。在具体实施方案中，CHD1L驱动的癌症是CRC、乳腺癌、胶质瘤、肝癌、肺癌或胃肠道(GI)癌。在具体实施方案中，TCF转录驱动的癌症是CRC，包括mCRC。在具体实施方案中，EMT驱动的癌症是CRC，包括mCRC。

本发明提供了一种治疗CHD1L驱动的癌症、更具体地TCF转录驱动的癌症、以及还更具体地EMT驱动的癌症的方法，包括GI癌，特别是CRC和mCRC，其包括向有此需要的患者施用对CHD1L抑制有效、对异常的TCF转录抑制有效、或对诱导EMT逆转有效的量的CHD1L抑制剂。在实施方案中，CHD1L抑制剂是式I-XX或式XXX-XVII中任一种的化合物。更具体地，本发明提供了一种通过施用有效量的CHD1L抑制剂来抑制(特别是在CRC中的)异常TCF转录的方法。还更具体地，本发明提供了一种通过施用有效量的CHD1L抑制剂来诱导(特别是在CRC或mCRC中的)EMT逆转的方法。本发明提供了一种通过施用有效量的CHD1L抑制剂来抑制(特别是在CRC中)癌症干细胞(CSC)干性和/或侵袭潜能的方法。本发明提供了一种通过施用有效量的CHD1L抑制剂来治疗CHD1L驱动的癌症、TCF转录驱动的癌症或EMT驱动的癌症(特别是CRC)的方法。

在实施方案中，CHD1L抑制剂选择性地抑制CHD1L。在实施方案中，本文中的CHD1L抑制剂不是PARP抑制剂。在实施方案中，本文中的CHD1L抑制剂不是拓扑异构酶抑制剂。具体地，本文中的CHD1L抑制剂不是DNA拓扑异构酶的抑制剂。具体地，本文中的CHD1L抑制剂不是拓扑异构酶IIα型的抑制剂。在实施方案中，本文中的CHD1L抑制剂不是β-连环蛋白的抑制剂，特别是诸如美国专利9616047中所述的抑制剂。在实施方案中，本文中的CHD1L抑制剂不是Hsp90-Cdc37相互作用的客户蛋白表达的抑制剂，特别是如CN109761909中所描述的抑制剂。

本发明还提供了一种通过向有此需要的患者施用对CHD1L抑制有效、对抑制异常的TCF转录有效、或对EMT的逆转有效的量的本发明的CHD1L抑制剂来预防CHD1L驱动的、TCF转录或EMT驱动的癌症中的肿瘤生长、侵袭和/或转移的方法。在具体实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。在实施方案中，肿瘤是与GI癌相关的肿瘤。在实施方案中，肿瘤是与CRC相关的肿瘤。在实施方案中，肿瘤是与mCRC相关的肿瘤。

在具体实施方案中，本发明提供了一种治疗CRC(包括mCRC)的方法，其包括向有此需要的患者施用对抑制CHD1L有效的量的CHD1L抑制剂。在具体实施方案中，本发明提供了一种治疗CRC(包括mCRC)的方法，其包括向有此需要的患者施用对抑制异常的TCF转录有效的量的CHD1L抑制剂。在具体实施方案中，本发明提供了一种治疗CRC(包括mCRC)的方法，其包括向有此需要的患者施用对诱导EMT逆转有效的量的CHD1L抑制剂。

在具体实施方案中，本发明提供了一种诱导癌细胞的细胞凋亡的方法，其包括使癌细胞接触有效量的CHD1L抑制剂。在一个实施方案中，CHD1L抑制剂以对异常的TCF转录的抑制有效的量提供。在一个实施方案中，CHD1L抑制剂以对诱导EMT逆转有效的量提供。在一个实施方案中，癌细胞是CRC癌细胞。在一个实施方案中，癌细胞是mCRC癌细胞。在一个实施方案中，该方法在体内应用。在一个实施方案中，该方法在患者体内应用。在一个实施方案中，该方法在体外应用。

在本文中的包括施用CHD1L抑制剂的方法的实施方案中，通过任何已知方法和给药方案施用CHD1L抑制剂以获得期望的益处。在一个实施方案中，施用是口服施用。在一个实施方案中，施用通过静脉注射。

本发明还提供了一种治疗耐药性癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用对CHD1L抑制有效、对异常的TCF转录抑制有效或诱导EMT逆转有效的量的CHD1L抑制剂，并与癌症已对其产生抗性的已知治疗联合。在具体实施方案中，癌症已对其产生抗性的治疗是常规化疗和其他靶向治疗。在具体实施方案中，本发明提供了一种提高DNA损伤药物在癌症中的疗效的方法，其包括用DNA损伤药物和CHD1L抑制剂联合治疗癌症，其中CHD1L以有效降低对DNA损伤药物的抗性的量使用。在一个实施方案中，DNA损伤药物是拓扑异构酶抑制剂。具体地，DNA损伤药物是DNA拓扑异构酶抑制剂。具体地，DNA损伤药物是拓扑异构酶IIα型抑制剂。特别地，DNA损伤药物是依托泊苷(etoposide)或替尼泊甙(teniposide)。具体地，DNA损伤药物是SN38或其前药。在一个实施方案中，DNA损伤药物是胸苷酸合成酶抑制剂。在一个实施方案中，胸苷酸合成酶抑制剂是叶酸类似物。在一个实施方案中，胸苷酸合成酶抑制剂是核苷酸类似物。在特定实施方案中，胸苷酸合成酶抑制剂为雷替曲塞(raltitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、诺拉曲塞(nolatrexed)或ZD9331。在具体实施方案中，DNA损伤药物为5-氟尿嘧啶或卡培他滨(capecitabine)。

在一个实施方案中，癌症是CDH1L驱动的癌症。在一个实施方案中，癌症是TCF转录驱动的癌症。在一个实施方案中，癌症是EMT驱动的癌症。在一个实施方案中，治疗用于CRC。在一个实施方案中，治疗用于mCRC。在实施方案中，DNA损伤药物和CHD1l抑制剂通过以适合实现联合治疗益处的任何已知方法的给药方案施用。在实施方案中，口服施用CHD1L抑制剂，并通过任何已知的施用方法和给药方案施用DNA损伤药物。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用DNA损伤药物之前施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用DNA损伤药物之前和任选地之后施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在通过静脉注射施用DNA损伤药物之前和任选地之后口服施用。

本发明提供了治疗CHD1L驱动的癌症、TCF转录驱动的癌症，或EMT驱动的癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用对CHD1L抑制有效、或对异常的TCF转录抑制有效、或对诱导EMT逆转有效的量的CHD1L抑制剂，并与治疗癌症的的替代方法联合。在一个实施方案中，癌症是GI癌，或更具体地是CRC癌，还更具体地是mCRC。在一个实施方案中，治疗的替代方法是施用5-氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶与亚叶酸(也称为醛氢叶酸)的组合、拓扑异构酶抑制剂、或细胞毒性剂或抗肿瘤剂的一种或多种。在实施方案中，CHD1L抑制剂与5-氟尿嘧啶联合施用、或与5-氟脲嘧啶和亚叶酸联合施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂与拓扑异构酶抑制剂联合施用，特别是与伊立替康(irinotecan，SN38的前药，也称为喜树碱)或SN38的任何其他已知前药联合施用。在实施方案中，使用CHD1L抑制剂和拓扑异构酶抑制剂的联合治疗显示出对癌症的至少相加的活性。在实施方案中，CHD1L抑制剂与拓扑异构酶抑制剂的联合治疗显示出对癌症的协同的活性(大于相加的活性)。

在实施方案中，CHD1L抑制剂与细胞毒性或抗肿瘤剂、特别是铂基的抗肿瘤剂、更特别是顺铂、卡铂或奥沙利铂联合施用。在实施方案中，使用CHD1L抑制剂和铂基抗肿瘤剂的联合治疗显示出对癌症的至少相加的活性。在实施方案中，CHD1L抑制剂与铂基抗肿瘤剂的联合治疗显示出对癌症的协同的活性(大于相加的活性)。在实施方案中，铂基抗肿瘤剂和CHD1L抑制剂通过适合实现联合治疗益处的任何已知方法的给药方案施用。在实施方案中，口服施用CHD1L抑制剂，并通过任何已知的施用方法和给药方案施用铂基肿瘤剂。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用铂基肿瘤剂之前施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用铂基抗肿瘤剂之前和任选地之后施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在通过静脉注射施用铂基肿瘤剂之前和任选地之后口服施用。

在实施方案中，CHD1L抑制剂与用于治疗GI癌、尤其是CRC和mCRC的化疗方案联合施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂与被称为FOLFOX的化疗方案联合施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂与被称为FOLFIRI的化疗方案联合施用。在实施方案中，化疗方案和CHD1L抑制剂通过适合实现联合治疗益处的任何已知方法的给药方案施用。在实施方案中，口服施用CHD1L抑制剂，并通过任何已知的施用方法和给药方案施用化疗方案。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用化疗方案之前施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用化疗方案之前和任选地之后施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在通过静脉注射施用PARP抑制剂之前和任选地之后口服施用。

本发明提供了一种治疗对聚(ADP)-核糖)聚合酶I(PARPI)敏感的癌症的方法，其中CHD1L抑制剂与PARP抑制剂联合使用。在实施方案中，对CHD1L抑制有效、对异常的TCF转录抑制有效或对诱导EMT逆转有效的量的CHD1L抑制剂与对治疗癌症有效的量的PARP抑制剂联合使用，以至少增强癌症治疗的有效性。在实施方案中，使用CHD1L抑制剂和PARP抑制剂的联合治疗显示出对癌症的至少相加的活性。在实施方案中，CHD1L抑制剂与PARP抑制剂的联合治疗表现出对癌症的协同的活性(大于相加的活性)。在实施方案中，癌症是对PARP抑制剂治疗敏感的癌症。在实施方案中，癌症是对PARP抑制剂治疗具有或已经产生抗性的癌症。在实施方案中，癌症是这样的癌症，其对PARP抑制剂治疗敏感，或对PARP抑制剂治疗已经产生抗性，以及是CHD1L驱动的、TCF驱动的或EMT驱动的癌症。在实施方案中，该癌症是同源重组缺陷型癌症(参见，例如Zhou等人BioRxiv 2020)。在实施方案中，所治疗的癌症是对PARP抑制剂敏感的癌症，更具体地是乳腺癌或卵巢癌敏感的癌症。在具体实施方案中，癌症是BRCA缺陷的乳腺癌或卵巢癌。在实施方案中，所治疗的癌症是GI癌、CRC或mCRC。在实施方案中，CHD1L抑制剂与PARP抑制剂的联合治疗逆转了癌症对PARP抑制剂治疗的抗性。在实施方案中，PARP抑制剂是奥拉帕尼(olaparib)、维利帕尼(veliparib)或他拉唑帕尼(talazoparib)。在实施方案中，PARP抑制剂为卢卡帕尼(rucaparib)或尼拉帕尼(Niraparib)。本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括联合施用对治疗癌症有效的量的PARP抑制剂和对抑制CHD1L有效的量的CHD1L抑制剂。在实施方案中，PARP抑制剂和CHD1l抑制剂通过适合实现联合治疗益处的任何已知方法的给药方案施用。在实施方案中，口服施用CHD1L抑制剂，并通过静脉注射施用PARP抑制剂。在实施方案中，CHD1L抑制剂和PARP抑制剂均通过静脉注射施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用PARP抑制剂之前施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用PARP抑制剂之前和任选地之后施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在施用PARP抑制剂之后施用。在实施方案中，CHD1L抑制剂在通过静脉注射施用PARP抑制剂之前和任选地之后口服施用。

本发明还提供了一种鉴定CHD1L抑制剂的方法，所述CHD1L抑制剂抑制CHD1L依赖性TCF转录，所述方法包括确定所选化合物是否抑制CHD1L ATP酶，如本文的实施方案中所述。在具体实施方案中，确定对cat-CHD1L ATP酶的抑制。在实施方案中，表现出抑制百分数为30％或以上的化合物选择作为抑制性CHD1L ATP酶。在实施方案中，表现出抑制百分数为80％或以上的化合物选择作为抑制性CHD1L ATP酶。在具体实施方案中，CHD1L抑制剂在针对CHD1LATP酶、特别是cat-CHD1L ATP酶的剂量响应测定中表现出IC

在具体实施方案中，在2D癌细胞模型中评估CHD1L抑制剂对TCF转录的抑制，特别是使用一个或多个CRC细胞系，如本文中的实施例中所述。在具体实施方案中，对TCF转录的抑制使用TOPflash报告基因构建体并且更具体地如本文所述的TOPFlask荧光素酶报告基因构建体来确定。在具体实施方案中，细胞模型中CHD1L抑制剂对TCF转录的抑制呈剂量依赖性。在具体实施方案中，细胞模型中CHD1L抑制剂对TCF转录的抑制在1至50μM的范围呈剂量依赖性。在具体实施方案中，CHD1L抑制剂在20μM表现出标准化为细胞活力的75％或更少的TCF-转录％。在具体实施方案中，CHD1L抑制剂在40μM表现出标准化为细胞活力的50％或更少的TCF-转录％。在具体实施方案中，CHD1L抑制剂表现出对TCF转录的剂量依赖性抑制，在癌细胞系中用TOPflash报告基因测定的IC

在具体实施方案中，评估CHD1L抑制剂逆转或抑制EMT的能力。在具体实施方案中，在肿瘤类器官中评估CHD1L抑制剂逆转EMT的能力。在实施方案中，EMT的逆转或抑制在表达波形蛋白的肿瘤类器官中评估，其中波形蛋白表达的剂量依赖性降低表示EMT的逆转或抑制。在实施方案中，EMT的逆转在表达E-钙粘蛋白的肿瘤类器官中评估，其中E-钙粘蛋白表达的剂量依赖性增加表示EMT的逆转或抑制。在实施方案中，EMT的逆转在表达E-钙粘蛋白、波形蛋白或两者的肿瘤类器官中评估，其中波形蛋白的剂量依赖性减少和E-钙粘蛋白表达的剂量依赖性增加表明EMT的逆转或抑制。在具体实施方案中，EMT的剂量依赖性逆转或抑制在0.1μM至100μM的化合物浓度进行测量。在具体实施方案中，EMT的剂量依赖性逆转在0.3μM至50μM的化合物浓度进行测量。

在具体实施方案中，评估CHD1L抑制剂抑制克隆源性的集落形成的能力，克隆源性的集落形成是一种用于测量癌症干细胞干性的公认测定。在实施方案中，在铺板之前用选定浓度的CHD1L抑制剂对细胞进行预处理。在实施方案中，以低密度培养细胞，使得在10天的培养中仅CSC形成集落。在实施方案中，细胞预处理12-36小时。在实施方案中，细胞预处理24小时。在实施方案中，细胞用浓度范围为0.5μM-50μM的CHD1L抑制剂进行预处理，并有适当的对照。在实施方案中，对于40μM的CHD1L浓度，与无化合物对照相比，CHD1L抑制剂表现出40％或更多的克隆源性的集落计数的抑制。在实施方案中，对于20μM的CHD1L浓度，与无化合物对照相比，CHD1L抑制剂表现出40％或更多的克隆源性的集落计数的抑制。在实施方案中，对于2μM的CHD1L浓度，与无化合物对照相比，CHD1L抑制剂表现出对40％或更多的克隆源性的集落计数的抑制。在实施方案中，对克隆源性的集落形成的抑制在10天的培养中持续存在。

在具体实施方案中，采用任何已知方法，特别是采用本文实施方案中所述的方法，针对侵袭潜能的损失进一步评估CHD1L抑制剂。

在具体实施方案中，进一步评估CHD1L抑制剂的抗肿瘤活性，如通过在肿瘤类器官中诱导细胞毒性所测量。在实施方案中，用选定浓度的CHD1L抑制剂(1μM-100μM)对细胞处理选定的时间(例如，24-96h，优选72h)。在实施方案中，使用本领域已知的多种细胞毒性试剂中的任何一种来测量细胞毒性，例如进入受损细胞并在进入时表现出可测量变化的小分子(例如荧光，例如CellTox

在实施方案中，可用于本文治疗方法的CHD1L抑制剂是式I-XX和XXX-XLII的那些或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在实施方案中，本发明提供了本文任一式、特别是式I-XX、XXXV-XLII的新型化合物或其盐或其溶剂化物。在实施方案中，CHD1L抑制剂是式I的那些。在实施方案中，CHD1L抑制剂是式XX的那些。在实施方案中，CHD1L抑制剂是式I-IX、Xi-XiX、XX或XXXV-XLII的那些。

在具体实施方案中，本发明的方法施用CHD1L抑制剂，其选自化合物1-73中的一种或多种或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在本文的方法中，可以联合使用两种或更多种CHD1L抑制剂。在具体实施方案中，本发明中使用的CHD1L抑制剂选自化合物6-39中的一种或多种或其药学上可接受的盐。在具体实施方案中，本发明方法中使用的CHD1L抑制剂选自化合物40-51的一种或多种或其药学上可接受的盐或溶剂化物中。在具体实施方案中，本发明方法中使用的CHD1L抑制剂选自化合物52-68中的一种或多种或其药学药上可接受的盐或溶剂化物。在具体实施方案中，本发明方法中使用的CHD1L抑制剂选自化合物70-73中的一种或多种或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在具体实施方案中，本发明方法中使用的CHD1L抑制剂是化合物6、8、52、54、56、61、62、65或66或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在具体实施方案中，本发明方法中使用的CHD1L抑制剂是化合物6、8或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在具体实施方案中，本发明方法中使用的CHD1L抑制剂是化合物52、54或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在具体实施方案中，本发明方法中使用的CHD1L抑制剂是化合物22、23、26或27或其药学上可接受的盐。

在具体实施方案中，本发明的方法采用式XX的CHD1L抑制剂，并包括本文针对式XX描述的所有实施方案。本发明还提供了式XX的新型化合物、其盐、以及含有此类化合物和盐的药物组合物。

本发明还涉及本发明的CHD1L抑制剂和包含任何此类抑制剂的药学上可接受的组合物。在实施方案中，本发明涉及如本文化学式中所述的任何新颖化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。具体而言，本发明涉及如本文式中所述的CHD1L抑制剂及其药学上可接受的盐，例外的是CHD1L抑制剂不是化合物1-8或其盐或其溶剂化物。具体而言，本发明涉及如本文式中所述的CHD1L抑制剂及其药学上可接受的盐，例外的是CHD1L抑制剂不是化合物1-9或其盐。在实施方案中，本发明涉及化合物9-39、40-68、69-73或其药学上可接受的盐或溶剂化物中的任何一种，或包含此类化合物、盐或溶剂化物的药学上可接受的组合物。在实施方案中，本发明涉及化合物10-39或40-73或其药学上可接受的盐或溶剂化物中的任何一种，或包含此类化合物、盐或溶剂化物的药学上可接受的组合物。在实施方案中，本发明涉及化合物52-73或其药学上可接受的盐或溶剂化物中的任何一种，或包含此类化合物、盐或溶剂化物的药学上可接受的组合物。在实施方案中，本发明的CHD1L抑制剂具有5或更小的Clog P。在实施方案中，本发明的CHD1L抑制剂具有3-4的Clog P。

在具体的实施方案中，本发明涉及以下化合物以及本文使用这些化合物治疗癌症(特别是CRC和mCRC)的方法：化合物52-73；化合物52或53；化合物54、55或67；或化合物57、58或59；或其药学上可接受的盐或溶剂化物；化合物8、化合物52、化合物53、化合物54、化合物55、化合物56、化合物57、化合物58、化合物59、化合物61、化合物62、化合物65、化合物66或化合物67中的任何一种。

本发明还涉及CHD1L抑制剂在制造用于治疗癌症、特别是用于治疗癌症(CHD1L驱动的癌症、TCF驱动的癌症或EMT驱动的癌症，特别是GI癌症，以及更特别地CRC或mCRC)的药物中的用途。本发明还涉及本文中的CHD1L抑制剂，其用于治疗癌症、CHD1L驱动的癌症、TCF驱动的癌症或EMT驱动的癌症，特别是GI癌症，以及更特别地CRC或mCRC。

本发明的其他实施方案和方面对于本领域的普通技术人员在审阅本文中的附图、具体实施方案和实施例时将是显而易见的。

附图说明

图1A-B：由HTS鉴定的CHD1L抑制剂的验证。(图1A)击中1-7的cat-CHD1L ATP酶C50剂量响应。由三个独立实验计算平均IC

图2A-2D：CHD1L抑制剂在CRC中逆转EMT和恶性表型。通过对(图2A)VimPro-GFP报告基因的下调和(图2B)EcadPro-RFP报告基因的上调的高含量成像测量来调节EMT的CHD1L抑制剂的剂量响应。平均EC

图3A-C：化合物6在CRC细胞系和PDTO中诱导细胞凋亡。(图3A)使用Ecad-ProRFP报告基因测定的E-钙粘蛋白表达的诱导和使用Cell-Tox

图4：化合物6在SW620异种移植肿瘤中的累积。化合物6通过i.p.注射施用至无胸腺裸鼠QD 5天以测量SW620异种移植肿瘤中的累积。

图5：CHD1L介导的TCF转录的拟议作用机制。CHD1L通过结合TCF复合体成员PARP1和TCF4被激活[Abbott等人,2020]。(1)一旦激活，CHD1L被引导至位于染色质上的受阻WRE。(2)染色质重塑和DNA易位的发生会暴露WRE位点。(3)由CHD1L促进TCF复合体结合至暴露WRE，促进EMT基因和其他与mCRC相关的基因。CHD1L ATP酶抑制剂有效阻止步骤1，导致CRC的EMT和其他恶性特性的逆转。

图6A-E：化合物8的评估。(图6A)化合物8显示出基于在SW260细胞培养物中以2D和超过24小时的时间进程中报道的TOPFlash的TCF转录的有效低μM剂量依赖性抑制。化合物8在72小时有效逆转双重报告基因SW620肿瘤类器官中的EMT，其由波形蛋白以剂量依赖性方式的下调(图6B)和E-钙粘蛋白启动子活性以剂量依赖性方式的上调(图6C)得以证明。化合物8在预处理24小时后在10天显著抑制(图6D)克隆源性的集落形成，以及在48小时显著抑制(图6E)HCT116的侵袭潜能。students t-检验表明*＝P≤0.05

图7A-B：用示例性CHDIL抑制剂处理后结肠直肠癌肿瘤类器官的活力。这些图说明了随着所示化合物的对数浓度变化的活力％的代表性图表。(图7A)用化合物6.9处理；(图7B)用化合物6.11处理；方案1中使用的替代化合物的编号在括号中给出。每个图中都提供了IC

图8A-B：CHD1L介导的DNA修复和单独的CHD1L抑制剂6以及与伊立替康(SN38的前药)的联合的“靶向”效应的评估。已知CHD1L对PARP-1介导的DNA修复至关重要，导致对DNA损伤的化学疗法的抗性[Ahel等人,2009；Tsuda等人,2017]。使用与工程化为过表达CHD1L(DLD1过表达，OE)的DLD1细胞相比具有低水平表达的CHD1L(DLD1空载体，EV)的DLD1 CRC细胞。图8A是比较CHD1L在DLD1(EV)和DLD1(OE)中的表达，以及β-微管蛋白在这些细胞中的对照表达的蛋白质印迹。图8B显示了单独的化合物、单独的SN38和两者的联合在DLD1空载体细胞和DLD1过表达细胞中的γ-H2AX强度(相对于DMSO)的图表。单独的化合物6不诱导显著的DNA损伤，也不会与SN38在CHD1L低表达的DLD1细胞中发挥协同作用。该图表证明了CHD1L抑制剂与SN38的协同作用发挥“靶向”效应，在过表达CHD1L的DLD1细胞中诱导DNA损伤。

图9A-9C：示例性CHD1L抑制剂和伊立替康(SN38的前药)的协同作用研究。(图9A)与化合物6和6.3在SW620结肠直肠癌(CRC)肿瘤类器官中的协同作用研究。(图9B)与化合物6.9在SW620结肠直肠癌(CRC)肿瘤类器官中的协同作用研究。(图9C)与化合物6.11在SW620结肠直肠癌(CRC)肿瘤类器官中的协同作用研究。SN38与6和6.3的联合在杀死结肠SW620肿瘤类器官方面的效力是单独的SN38的50倍和150倍。SN38与6.9和6.11的联合的效力是单独的SN38的100倍以上。化合物6、6.3、6.9和6.11中的每种都与伊立替康(和SN38)表现出杀死SW620肿瘤类器官的协同作用。

图10：化合物6与伊立替康的联合在小鼠中的体内协同作用研究。图10包括相比于用对照(1)，SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随着用单独的化合物6(2)、单独的伊立替康(3)或其联合(4)治疗的天数(最高达28天)变化的图表。还提供了示出数据统计显著性的数据表。与单剂治疗组相比，伊立替康和化合物6的联合在治疗的28天内显著抑制结肠SW620肿瘤异种移植物至几乎没有肿瘤体积。

图11：CHD1L抑制剂化合物6和伊立替康的体内协同作用在治疗后继续。图11包括SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随着用单独的伊立替康(1)、或化合物6和伊立替康的联合(2)治疗的天数(最高达41天)变化的图表。还提供了示出数据统计显著性的数据表。与单独的伊立替康相比，伊立替康和化合物6的联合在最后一次治疗(第28天)后显著抑制结肠SW620肿瘤至几乎没有肿瘤体积。在最后一次单独的伊立替康治疗的2周内，肿瘤体积上升到最后一次治疗的体积以上，表明肿瘤复发。相反，该联合治疗保持了较低的肿瘤体积。

图12：与单独的载体和伊立替康相比，单独的化合物6和与伊立替康的联合显著增加了荷CRC肿瘤的小鼠的存活率。图12包括相比于用对照(1)，用单独的化合物6(2)、单独的伊立替康(3)或其联合(4)进行第28天的最后一次治疗后至最高达第52天，存活率(％)随时间变化的图表。还提供了示出数据统计显著性的数据表。与单剂量化合物或对照相比，联合治疗的存活率显著更高。

图13：化合物6.11与伊立替康的联合在小鼠体内的协同作用研究。图13包括相比于对照(1)，SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随着用单独的化合物6.11(2)、单独的伊立替康(3)或其联合(4)治疗的天数(最高达20天)变化的图表。还提供了示出数据统计显著性的数据表。与单独的伊立替康相比，伊立替康和化合物6.11的联合在治疗的20天内显著抑制结肠SW620肿瘤异种移植物至几乎没有肿瘤体积。

图14：CHD1L抑制剂化合物6.11和伊立替康的体内协同作用在治疗后继续。图14包括SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随着用单独的伊立替康(1)、或化合物6和伊立替康(2)的联合治疗的天数(最高达41天)变化的图表。在第33天停止治疗(Tx释放)。与单独的伊立替康相比，伊立替康和化合物6.11的联合在最后一次治疗(第33天)之后显著抑制结肠直肠SW620肿瘤。

图15：CHD1L抑制剂6.11和伊立替康的体内协同作用显著增加了生存益处。与单独的载体和伊立替康相比，化合物6.11与伊立替康的联合显著提高了荷CRC瘤小鼠的存活率。图15包括相比于对照(1)，用单独的化合物6(2)、单独的伊立替(3)或其联合(4)进行第33天的最后一次治疗后至最高达第50天，存活率(％)随时间变化的图表(1)。还提供了示出数据统计显著性的数据表。与单独的伊立替康或对照相比，联合治疗的存活率显著更高。

具体实施方式

本发明总体上涉及一种相对新的癌基因CHD1L作为与CRC的不良预后和存活率相关的致瘤因子的表征。CHD1L作为促进TCF驱动的EMT和其他恶性特性所需的TCF转录复合体的DNA结合因子的新生物学功能已经得到证实。Abbott et al.,2020和这篇文章的补充信息(可从杂志网站(mct.aacrjournals.org)获得)提供了本文所述的一部分实验和数据的描述，并且每个都通过引用整体并入本文。

CHD1L在许多类型的癌症中扩增(Chr1q21)并过表达[Ma等人,2008；Cheng等人,2013]。CHD1L过表达被认为是许多癌症的不良预后和转移的标志物[Ma等人,2008；Cheng等人,2008；Hyeon等人,2013；Su等人,2014]。虽然共同的文献证明CHD1L是致癌基因和恶性肿瘤的驱动因子是令人信服的，但本文测试了先前研究的严谨性和CHD1L可能作为CRC分子靶标的癌基因的假设。报道了对15年间获得的585例CRC患者的大队列的转录组数据进行的计算机分析[Marisa等人,2013]。值得注意的是，CHD1L表达与生存率差相关，低CHD1L患者的生存期明显长于高CHD1L患者。使用同一队列，Marisa et al.,2013鉴定了用于改善CRC临床分层的六种不同的亚型，CHD1L在所有六种亚型中普遍表达，表明其作为CRC治疗靶标的潜力。CHD1L也与肿瘤淋巴结转移相关，其表达从N0(无区域扩散)增加至N3(远端区域扩散)。对UCCC患者队列(n＝25)的转录组数据进行分析，发现CHD1L表达与IV期和mCRC显著相关。文献报道和本文的工作表明，CHD1L是一种促进恶性CRC的癌基因，其高表达与CRC患者的不良预后和低生存率相关。

CHD1L作为促进TCF驱动的EMT和其他恶性特性所需的TCF转录复合体的DNA结合因子的新生物学功能已经得到证实。使用HTS药物发现，已经鉴定并表征了第一个已知的CHD1L抑制剂，其在基于细胞的CRC模型(包括PDTO)中显示出良好的药理学效果。CHD1L抑制剂有效预防CHD1L介导的TCF转录，导致EMT和其他恶性特性(包括CSC干性和侵袭潜能)的逆转。值得注意的是，CHD1L抑制剂6表现出诱导细胞死亡的能力，这与EMT的逆转和通过死亡受体诱导切割的E-钙粘蛋白介导的外源性细胞凋亡一致。此外，与单独使用SN38相比，化合物6与SN38(即，伊立替康)的协同作用显示出有效诱导DNA损伤的作用，其与抑制PARP1/CHD1L介导的DNA修复一致。已经鉴定出具有类似药物的理化性质、良好的体内PK/PD分布、并且没有急性肝毒性的CHD1L抑制剂。

基于本文呈现的数据，示出了参与CRC肿瘤进展和转移的CHD1L介导的TCF驱动的EMT的作用机制(图5)。在这种机制中，TCF复合体特异性地招募CHD1L来动态调节转移基因的表达。该机制的核心是，CHD1L当被TCF复合体经由与PARP1和TCF4的蛋白相互作用引导时，会与核小体受阻的WRE结合。重要的是，PARP1被表征为通过宏结构域结合的CHD1L的主要细胞激活剂，其释放自动抑制[Lehmann等人,2017；Gottschalk等人,2009]。此外，PARP1是TCF复合体与β-连环蛋白和TCF4形成相互作用的必需组成部分[Idogawa等人,2005]。因此，该机制表明CHD1L被TCF复合体招募并被PARP1和TCF4激活。一旦激活，CHD1L通过核小体易位暴露WRE，促进TCF复合体与WRE结合并促进EMT的恶性基因的转录。CHD1L抑制剂具有通过抑制CHD1L ATP酶活性的独特的作用机制，其防止WRE暴露于TCF复合体，抑制与EMT(特别是mCRC)相关的TCF靶标基因的转录。

本文所述的CHD1L小分子抑制剂已在基于抑制CHD1L ATP酶活性的筛选中得到鉴定。某些已鉴定的抑制剂表现出类似药物的理化性质和良好的体内PK/PD分布，并且没有急性肝毒性。这种抑制剂可有效治疗CRC和mCRC(转移性CRC)以及其他CHD1L驱动的癌症。

已知的用于评估成药性的方法可用于进一步评估本发明的活性化合物，以应用于给定的治疗应用。术语“成药性”涉及潜在药物的施用、分配、代谢和排泄的药学性质。本领域以各种方式评估成药性。例如，可以应用“Lipinski五倍率法则”来确定分子中与体内吸收和渗透性相关的类药物特性[Lipinski et al.,2001；Ghose,et al.,1999]。

本发明提供了联合治疗的方法，其中将施用CDH1L抑制剂与施用一种或多种非CDH1L抑制剂的抗癌剂相联合。在实施方案中，其他抗癌剂是拓扑异构酶抑制剂、铂基抗肿瘤剂、PARP抑制剂、或两种或多种此类抑制剂和剂的联合。在实施方案中，联合疗法将CDH1L抑制剂与拓扑异构酶抑制剂的施用相联合。在实施方案中，联合疗法将CDH1L抑制剂与铂基抗肿瘤剂的施用相联合。在实施方案中，联合疗法将CDH1L抑制剂与PARP抑制剂的施用相联合。在实施方案中，联合疗法将CDH1L抑制剂和拓扑异构酶抑制剂的施用以及PARP抑制剂的施用相联合。在实施方案中，联合疗法将CDH1L抑制剂的施用与用于所治疗的具体癌症的化疗相联合。在本文的实施方案中，CDH1L抑制剂和另一种抗肿瘤剂的联合在联合中表现出协同活性。

在本文的实施方案中，采用CDH1L的疗法可以与适合给定癌症的放射疗法相联合。

各种PARP抑制剂是本领域已知的[参见，Rouleau等人,2010；Yi等人,2019；Zhou等人,2020；Wahlberg等人,2012；D’Andrea,2018]。这些参考文献中的每个都通过引用整体并入本文，用于描述PARP抑制剂、PARP抑制剂的作用机制、使用PARP抑制剂治疗的癌症、以及对PARP抑制剂的抗性。在本文的具体实施方案中，用CDH1L抑制剂和PARP抑制剂的联合治疗PARP抗性癌症。

各种拓扑异构酶抑制剂是本领域已知的，并且已经在临床上使用(例如，参见Hevener,2018)。该参考文献通过引用整体并入本文，用于描述拓扑异构酶抑制剂的类型、特异性拓扑异构酶抑制剂、拓扑异构酶抑制的机制、使用拓扑异构酶抑制剂治疗的癌症和使用拓扑异构酶抑制剂的联合疗法。在实施方案中，可用于本文方法的拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱(camptothecin)及其前药、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、贝洛替康(belotecan)、吲哚替康(indotecan)、或因帝米替康(indimitecan)。在实施方案中，可用于本文方法的拓扑异构酶抑制剂包括依托泊苷(etoposide)或替尼泊苷(teniposide)。在实施方案中，可用于本文方法的拓扑异构酶抑制剂包括奈米替康(namitecan)、西拉替康(silatecan)、沃沙罗辛(vosaroxin)、阿多柔比星(aldoxorubicin)、贝克卡林(becatecarin)、或伊多替卡林(edotecarin)。

各种铂基抗肿瘤剂(也称为铂类抗肿瘤剂)在本领域是已知的，并且已经在临床上使用或处于临床试验中[参见，例如，Wheate et al.,2010]。该参考文献通过引用整体并入本文，用于描述铂基抗肿瘤剂的类型、特定的铂基抗肿瘤剂、此类剂的作用机制、使用此类剂治疗的癌症以及使用铂基抗肿瘤剂的联合疗法。在实施方案中，用于本文方法的铂基抗肿瘤剂包括顺铂、碳铂、奥沙利铂、奈达铂、洛铂或庚铂。在实施方案中，铂基抗肿瘤剂包括赛特铂(satraplatin)或吡铂(picoplatin)。铂基抗肿瘤药物可以是脂质体包裹的(例如Lypoplatin

各种胸苷酸合成酶抑制剂在本领域中是已知的，并且已经在临床上采用，特别是在CRC的治疗中[Papamichael,2009；Lehman,2002]。胸苷酸合成酶抑制剂包括叶酸类似物和核苷酸类似物。在具体实施方案中，胸苷酸合成酶抑制剂是雷替曲塞(raltitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、诺拉曲塞(nolatrexed)或ZD9331。在更具体的实施方案中，胸苷酸合成酶抑制剂是5-氟尿嘧啶或卡培他滨(capecitabine)。

本发明提供了下式的CHD1L抑制剂：

可用于本发明的方法的化合物包括式I的化合物：

或其盐或其溶剂化物，

其中：

B环是具有一个、两个或三个5元或6元环的杂芳环或环体系，其中任何两个或三个环可以是稠环，其中环是碳环、杂环、芳环或杂芳环，并且至少一个环是杂芳基；

在B环中，每个X独立地选自N或CH，并且至少一个X是N；

R

Y是选自由-O-、-S-、-N(R

L

A环是具有一个、两个或三个环的碳环或杂环或环体系，其中的两个或三个环可以稠合，每个环具有3-10个碳原子和任选的1-6个杂原子，并且其中每个环任选是饱和的、不饱和的或芳族的；

Z是含有至少一个被R′基团取代的氮的二价基团，

其中在实施方案中，Z是选自以下的二价基团：–N(R′)-、–CON(R′)-、–N(R′)CO-、–CSN(R′)-、–N(R′)CS-、-N(R′)CON(R′)-、–SO

或二价Z基团包含具有至少一个氮环成员的5元或6元杂环，例如，

L

R选自由氢、脂族基团、碳环基基团、芳基基团、杂环基基团和杂芳基基团组成的组，其中的每个基团任选地被取代；

每个R’独立地选自由氢、脂族基团、碳环基基团、芳基基团、杂环基基团和杂芳基基团组成的组，其中的每个基团任选地被取代；

R

R

R

R

每个R

R

其中任选取代包括用一个或多个卤素、硝基、氰基、氨基、单-或二-C1-C3烷基取代的氨基、C1-C3烷基、C2-C4烯基、C3-C6环烷基、C3-C6环烯基、C1-C3卤代烷基、C6-C12芳基、C5-C12杂芳基、C3-C12杂环基、C1-C3烷氧基、C1-C6酰基、-COOR

每个R

在式I的实施方案中：

R选自氢、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个基团任选地被取代；

每个R’独立地选自氢、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个基团任选地被取代；

R

R

R是氢或C1-C3烷基；

每个R’独立地是氢或C1-C3烷基；

R

R

R

在式I的具体实施方案中：

环A是任选取代的苯基；

环A是任选取代的萘基；

环B是任选取代的吡啶基，

环B是任选取代的嘧啶基；

环B是任选取代的吡嗪基；

环B是任选取代的三嗪基；

环B是任选取代的喹唑啉基；

环B是任选取代的蝶啶基；

环B是任选取代的喹啉基；

环B是任选取代的异喹啉基；

环B是任选取代的萘啶基；

环B是任选取代的吡啶并嘧啶基；

环B是任选取代的嘧啶并吡啶基；

环B是任选取代的吡喃并吡啶基；

环B是任选取代的吡喃并嘧啶基；

环B是任选取代的嘌呤基；

环A是任选取代的苯基，环B是任选取代的嘧啶基；或者

环A是任选取代的苯基，环B是任选取代的蝶啶基。

优选的A和B环取代基包括一个或多个C1-C3烷基、C3-C7环烷基、C4-C10环烷基取代的烷基、C2-C4烯基、C1-C3烷氧基、C1-C3酰基、卤素、羟基、C1-C3卤代烷基、单或二取代的苯基、或单或二取代的苄基。更具体的A和B环取代基包括甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丙基甲基、甲氧基、乙氧基、苯基、苄基、卤代苯基、卤代苄基、Cl、Br、F、CF

在更具体的实施方案中，B环具有如方案4中的式RBI所示的结构，其中X

在式I的实施方案中：

x是1，以及L

x是0，以及L1不存在；

y是1，以及L

y是1，以及L

y是1，以及L

x和y两者均是0；

x是1，以及y是0，以及L

y是1，以及x是0，以及L

x和y两者均是1，以及L

在式I的实施方案中：

Y是–O–、–S–、–N(R

Y是–N(R

R

R

R

Y是–N(R

Y是–NH–、–CONH–或–NHCO–；

Y是–N(R

Y是–N(R

在式I的实施方案中，x和y两者均是0，Y是–N(R

在式I的实施方案中：

Z是–N(R′)-、–CON(R′)-、或–N(R′)CO-；

Z是-CH(CF

Z是–SO

Z是-N(R′)CON(R′)-；

Z是-N(R′)CH

Z是

Z是

Z是

R’是氢、C1-C6烷基或C1-C3卤代烷基，特别是C1-C3氟烷基；

R’是氢或C1-C3烷基；

R’是氢、甲基或CF3-；

R’是氢或甲基；

R’是氢；

Z是–N(R′)-、–CON(R′)-、或–N(R′)CO-，R’是氢或甲基；

Z是–CON(R′)-、或–N(R′)CO-，R’是氢或甲基；

Z是-N(R′)CON(R′)-，两个R’都是氢；

Z是

Z是

在式I的实施方案中：

x是0；

x是1，L

y是0，x是1，L

x是0，z是–N(R′)-、–CON(R′)-或–N(R′)CO-；

x是0，z是–N(R′)-、–CON(R′)-或–N(R′)CO-，R’是氢或甲基；

x是0，z是–CON(R′)-；

x是0，z是–CON(R′)-，R’是氢或甲基；

x是0，z是–CON(R′)-，R’是氢；

x是1，L

x为1，L

x是1，L

x是1，L

x是0或1，L

x是0或1，L

y是0，x是0或1，L

y是0，Y是–N(R

y是0，Y是–N(R

在式I的实施方案中，

R

当R

当R

在式I的实施方案中，R

–N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)-N(R

–(M)

–(M)-P基团，其中P是芳基或杂芳基基团，M是任选取代的连接基团-(CH

–(M)-P基团，其中P是芳基或杂芳基基团，M是任选取代的连接基团-N(R)(CH

–(M)-P基团，其中P是芳基或杂芳基基团，M是任选取代的连接基团-(CH

P是任选取代的苯基或萘基；

P是任选取代的苯基或萘基，并且任选取代是用一个或多个卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基或C1-C3卤代烷基取代；

P是任选取代的杂芳基基团，其具有5元或6元环或两个稠合的5元或6元环；

P是任选取代的杂芳基基团，其具有5元或6元环或两个稠合的5元或6元环并具有1至3个氮环成员；

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

在式I的具体实施方案中，R

方案2的R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

未取代的R

在式I的实施方案中，R

任选取代的苯基；

未取代的苯基；

任选取代的萘基；

未取代的萘基；

任选取代的萘-2-基；

任选取代的萘-1-基；

萘-2-基；

萘-1-基；

任选取代的噻吩基；

卤素取代的噻吩基；

溴取代的噻吩基；

任选取代的噻吩-2-基；

卤素取代的噻吩-2-基；

溴取代的噻吩-2-基；

4-卤代噻吩-2-基；

4-溴代噻吩-2-基；

任选取代的呋喃基；

任选取代的呋喃-2-基；

任选取代的吲哚基；

未取代的吲哚基；

吲哚-3-基；

吲哚-2-基；

吲哚-1-基；

任选取代的吡啶并吡咯基；

任选取代的吡啶并吡咯-2-基；

任选取代的苯并咪唑基；

在具体的实施方案中，R

在实施方案中，R

其中，

X

在实施方案中，R

其中，

X

在实施方案中，R

R12-3、R12-4、R12-5、R12-7、R12-8、R12-10、R12-23、R12-25、R12-27、R12-29或R12-31；或

R12-12、R12-13、R2-145、R12-15、R12-16、R12-17、R12-18、R12-19、R12-20、R12-21、R12-21或R12-22，其中p是0；或

R12-33、R12-34、R12-35、R12-36、R12-37、R12-38、R12-39、R12-40、R12-41、R12-42，其中p是0；或

R12-70或R12-71，其中p是0。

在实施方案中，R

其中：

T、U、V和W选自O、S、C(R″)(R″)、C(R″)-/、C(R″)、C-/、N(R″)、或N-/；

其中该基团包含一个或两个双键，这取决于T、U、V和W的选择；

其中R

其中R″表示N或C上的任选取代。

更具体地，R

其中，

T是C(R″)、C-/、或N；或

U是O、S、C(R″)(R″)、C(R″)-/、N(R″)、或N-/；

V是CR″、C-/、或N，以及

W是CR″、C-/、N，其中R

其中R

其中R″表示N或C上的任选取代。符号“-/”表示杂环基团通过其键合到本文化合物中的单价键，例如，C-/表示来自环碳的杂环基团通过其键合到本文的化合物中的单价键。

在实施方案中，R

其中，

U、V和W选自O、S、N、C(R″)(R″)、C(R″)-/、C(R″)、C-/、N(R″)、或N-/；

T′、U'、V′和W选自C(R″)、C-/、N(R″)、或N-/；

其中R

其中该基团包含取决于U、V和W的选择的键；以及

其中R″表示N或C上的任选取代。

更具体地，R

其中，

U和V选自N、C(R″)、或C-/、/；

W选自O、S、C(R″)(R″)、C(R″)-/、N(R″)、或N-/；

T′、U'、V′和W'选自C(R″)、C-/、N(R″)、或N-/；

其中，R

其中，R″表示N或C上的任选取代。

每个R”独立地选自氢、卤素、硝基、氰基、氨基、单-或二-C1-C3烷基取代的氨基、C1-C3烷基、C2-C4烯基、C3-C6环烷基、C3-C6环烯基、C1-C3卤代烷基、C6-C12芳基、C5-C12杂芳基、C3-C12杂环基。C1-C3烷氧基、C1-C6酰基、-COOR

其中每个R

在更具体的实施方案中，R

其中：

R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在具体实施方案中，R

在式I的具体实施方案中，-Z-(L

在式I的实施方案中，R

在式I的实施方案中，R

在式I的具体实施方案中，-N(R

在式I的实施方案中，R

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式II的那些：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键。在实施方案中，x是1，y是1。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，R

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式III的那些：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键。

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，R

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式IV的那些：

或其盐或其溶剂化物；

其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键。

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，R

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式V的那些：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键。

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，R

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式VI的那些：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键。

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，x是1和-N-(CH

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式VII的那些：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键。

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，x是1和-N-(CH

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式VIII的那些：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键，R

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，x是1和-N-(CH

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式IX的那些：

或其盐或其溶剂化物，其中变量如式I中所定义，虚线代表单键或双键，R

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，x是1且M是-N-(CH

在其他实施方案中，本发明提供了式XI的化合物：

或其盐或其溶剂化物，

其中：

每个X独立地选自N或CH，并且至少一个X是N；

A环是具有3-10个碳原子和任选的1-6个杂原子的碳环或杂环，并且其任选是饱和的、不饱和的、或芳族的；

L

R

R

R

R

R

其中虚线是单键或双键，这取决于R

R

R

R

每个R

每个R

其中，任选的取代包括用一个或多个卤素、硝基、氰基、氨基、单-或二-C1-C3烷基取代的氨基、C1-C3烷基、C2-C4烯基、C3-C6环烷基、C3-C6-环烯基、C6-C12芳基和C6-C12杂环基取代。

在实施方案中，该化合物具有式XII：

或其盐或其溶剂化物，其中变量如式XI所定义。

在实施方案中，该化合物具有式XIII：

或其盐或其溶剂化物，其中变量如式XI中所定义，其中：

每个Y独立地选自N或CH；

R

在实施方案中，该化合物具有式XIV或XV：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式XI、XII或XIII中所定义。

在实施方案中，该化合物具有式XVI或XVII:

或其盐或其溶剂化物

其中变量如式XI或XV中所定义，以及

R

在实施方案中，该化合物具有式XVIII：

或其盐或其溶剂化物，

其中：

R

R

R

R

虚线是单键或双键，这取决于R

R

L是任选的1-6个原子的连接基团，其中x是1或0，表示存在或不存在L基团；以及

R

例如，L是2-6个原子的连接基团；(例如，-CH

在实施方案中，该化合物具有式XIX：

或其盐(或溶剂化物)，

其中：

R

y是0或1-3(包括端值)的整数；以及

R

在实施方案中，CDH1L抑制剂是式XX的化合物：

或其盐或其溶剂化物，其中R

在实施方案中，R

在式XX的更一般的实施方案中：

R

R

R

R

R

每个R

其中任选取代包括用一个或多个卤素、硝基、氰基、氨基、单-或二-C1-C3烷基取代的氨基、C1-C3烷基、C2-C4烯基、C3-C6环烷基、C3-C6-环烯基、C6-C12芳基、C6-C12杂环基、-OR

在式XX的实施方案中，R

在式XX的具体实施方案中，R

在式XX的实施方案中，R

在本文式XX的实施方案中，R

在实施方案中，该化合物具有式XXX:

或其盐(或溶剂化物)，

其中，

R

R

R

Y是0或1-3(包括端值)的整数；

R

R

在具体实施方案中，可用于本文方法的化合物包括式XXXI的化合物：

或其盐或其溶剂化物；其中变量如式I中所定义，R

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，x是1，以及M是-N-(CH

在实施方案中，可用于本发明方法的化合物包括式XXXII的化合物：

或其盐或其溶剂化物，

其中变量如式I中所定义，R

在实施方案中，y是1。在实施方案中，y是0。在实施方案中，两个X都是氮。在实施方案中，x是1，M是-N-(CH

式XXXV-XLII的化合物可用于本文的方法中：

其中变量如以上式I-XIX中所定义，X

本发明提供了盐，特别是以下式I-IX、XI-XIX、XXX-XXXII、XXXV-XLII和式XX中的任一个的每个化合物的药学上可接受的盐。本发明提供了其溶剂化物和其盐，特别是以下式I-XIX、XXX-XXXII、XXXV、XXXV-XLII和式XX中的任一个的每个化合物的药学上可接受的溶剂化物和其盐。优选的溶剂化物是水合物。本发明提供了包含本文任一式的任何化合物的药物组合物。

脂肪族化合物是一种有机化合物，其包含以直链、支链或非芳环连接在一起的碳和氢，并且可以包含单键、双键或三键。脂肪族化合物不同于芳族化合物。术语脂族基在本文中是指含有碳和氢的非芳族的单价基团。脂族基包括烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基，以及被其他脂族基取代的脂族基，例如，被烷基基团取代的烯基基团、被环烷基基团取代的烷基基团。

术语烷基或烷基基团是指直链或支链饱和烃的单价基团。烷基基团包括直链和支链烷基基团。除非另有说明，烷基基团具有1-8个碳原子(C1-C8烷基基团)，优选含有1-6个碳原子的那些(C1-C6烷基基团)，更优选含有1-3个碳原子的那些(C1-C3烷基基团)。烷基基团任选被如本文所述的一个或多个非氢取代基取代。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、各种支链戊基、正己基、各种支链己基，所有这些都任选被取代，其中取代在本文别处定义。取代的烷基基团包括完全卤化或半卤化的烷基，例如一个或多个氢被一个或多个氟原子、氯原子、溴原子和/或碘原子替代的烷基基团。取代的烷基基团包括全氟化或半氟化的烷基。

环烷基基团是具有至少一个3元或更高元碳环的烷基。环烷基基团包括具有3-12元碳环的那些。环烷基基团包括具有3-20个碳原子的那些和具有3-12个碳原子的那些。更具体地，环烷基基团可以具有至少一个3-10元碳环。环烷基基团可以具有单个碳环，其在环中具有3-10个碳。环烷基基团任选地被取代。环烷基基团可以是具有6-12个碳的双环。示例性的环烷基基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基和环癸基。双环烷基基团包括稠合双环基团和桥接双环基团。示例性的双环烷基基团包括双环[2.2.2]辛基、双环[4.4.0]癸基(萘烷基)和双环[2.2.2]庚基(降莰烷基)。

环烷基烷基基团是被如本文所述的环烷基基团取代的如本文所述的烷基基团。更具体地，烷基基团是甲基基团或乙基基团，环烷基基团是环丙基基团、环丁基基团、环戊基基团或环己基基团。环烷基基团任选地被取代。在具体实施方案中，任选取代包括用一个或多个卤素、具有1-3个碳原子的烷基、具有1-3个碳原子的烷氧基、羟基和硝基取代。

术语亚烷基是指直链或支链饱和烃的二价基团。除非另有说明，亚烷基基团可以具有1-12个碳原子。亚烷基基团包括具有2-12、2-8、2-6或2-4个碳原子的那些。本文的连接基团(L1)包括亚烷基基团，特别是直链的未取代的亚烷基基团，-(CH2)n-，其中n是1-12，n是1-10，n是1-9，n是1-8，n是1-7，n是1-6，n是1-5，n是1-4，n是1-3，n是2-10，n是2-9，n是2-8，n是2-7，n是2-6，n是2-5或n是2-4。

烷氧基基团是如上广泛讨论的与氧相连的烷基基团(R烷基-O-)。烷氧基基团是一价的。

亚烯基基团是具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链亚烷基基团的二价基团。在具体实施方案中，同一碳原子不会是两个双键的一部分。在亚烯基基团中，亚烷基基团的一个或多个CH2-CH2部分被碳-碳双键取代。在具体的实施方案中，亚烯基基团包含2-12个碳原子或更优选3-12个碳原子。在具体实施方案中，亚烯基基团包含一个或两个双键。在具体实施方案中，亚烯基基团包含一个或两个反式双键。在具体实施方案中，亚烯基基团包含一个或两个顺式双键。示例性的亚烯基基团包括：

-(CH

-(CH

烷氧基烷基基团是其中一个或多个不相邻的内部-CH

烷氧基亚烷基基团是二价烷氧基烷基基团。该基团可以描述为其中一个或多个内部-CH

术语酰基基团是指基团-CO-R，其中R是氢、烷基基团或芳基基团，如本文所述。

芳基基团包括具有一个或多个5元或6元芳环的单价基团。芳基基团可以包含一个、两个或三个6元芳环。芳基基团可以包含两个或多个稠合芳环。芳基基团可以包含两个或三个稠合芳环。芳基基团任选被一个或多个非氢取代基取代。取代的芳基基团包括被烷基或烯基基团取代的那些，这些基团又可以任选地被取代。具体的芳基基团包括苯基、联苯基和萘基，所有这些都如本文所述任选地被取代。取代的芳基基团包括完全卤化的或半卤化的芳基基团，例如一个或多个氢被一个或多个氟原子、氯原子、溴原子和/或碘原子替代的芳基基团。取代的芳基基团包括全氟化的或半氟化的芳基基团，例如一个或多个氢被一个或多个氟原子替代的芳基基团。

烷基基团包括其中烷基基团被芳基基团取代的芳基烷基基团。芳基烷基基团包括苄基基团和苯乙基基团等。如本文所述，芳基烷基基团任选地被取代。取代的芳基烷基基团包括其中芳基基团被1-5个非氢取代基取代的那些，特别是被1、2或3个非氢取代基取代的那些。有用的取代基包括甲基、甲氧基、羟基、卤素和硝基。特别有用的取代基是一个或多个卤素。具体的取代基包括F、Cl和硝基。

杂环基团是具有一个或多个饱和的或不饱和的碳环的单价基团，并且其每个环包含一至三个杂原子(例如，N、O或S)。这些基团任选含有一个、两个或三个双键。为了满足化合价要求，环原子可以键合至一个或多个氢，或者如本文所述被取代。杂环中的一个或多个碳可以是-CO-基团。杂环基团包括具有3-12个碳原子和1-6个杂原子的那些，其中1或2个碳原子被-CO-基团替代。杂环基团包括具有3-12个或3-10个环原子的那些，其中最高达三个可以是除碳以外的杂原子。杂环基团可以包含一个或多个环，其中的每个是饱和的或不饱和的。杂环基团包括双环和三环基团。优选的杂环基团具有5元或6元环。如本文所述，杂环基团任选地被取代。具体而言，杂环基团可以被一个或多个烷基取代。杂环基团包括具有含有一个或两个氮和一个或两个双键的5元和6元环的那些。杂环基团包括具有含有氧或硫和一个或两个双键的5元和6元环的那些。杂环基团包括具有5元或6元环和两个不同杂原子(例如N和O、O和S或N和S)的那些。具体的杂环基团包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、噻吩基、吗啉基、

杂环烷基基团是被一个或多个杂环基团取代的烷基基团，其中烷基基团任选地带有另外的取代基，并且杂环基团任选地被取代。具体的基团是杂环基取代的甲基或乙基基团。

杂芳基基团是具有一个或多个芳环的单价基团，其中至少一个环包含杂原子(非碳环原子)。杂芳基基团包括具有一个或两个带有1、2或3个杂原子的杂环的那些，并且任选地具有一个6元芳环。杂芳基基团可以包含5-20个、5-12个或5-10个环原子。杂芳基基团包括具有一个含杂原子的芳环和一个含碳环原子的芳环的那些。杂芳基基团包括具有一个或多个5元或6元杂芳环和一个或多个6元碳芳环的那些。杂芳环可以在环中包括一个或多个N、O或S原子。杂芳环可以包括具有一个、两个或三个N的那些，具有一个或两个O的那些，以及具有一个或两个S的那些，或者一个或两个或三个N、O或S的组合。具体的杂芳基包括呋喃基基团、吡啶基基团、吡嗪基基团、嘧啶基基团、喹啉基基团、嘌呤基基团、吲哚基基团。在一个具体实施方案中，杂芳基是吲哚基，更具体地是吲哚-3-基基团。

杂原子包括O、N、S、P或B。更具体地，杂原子是N、O或S。在具体实施方案中，一个或多个杂原子取代芳环或碳环中的碳。为了满足化合价，在这种芳环或碳环中的任何杂原子可以键合至H或取代基基团，例如烷基基团或其他取代基。

杂芳基烷基基团是被一个或多个杂芳基基团取代的烷基基团，其中烷基基团任选带有另外的取代基，并且芳基基团任选地被取代。具体的烷基基团是甲基基团和乙基基团。

术语氨基基团是指-N(H)

本文中的基团任选地被取代。最通常地，任何烷基基团、环烷基基团、芳基基团、杂芳基基团和杂环基团可以被一个或多个卤素、羟基基团、硝基基团、氰基基团、异氰基基团、氧代基团、硫代基团、叠氮基基团、氰酸酯基基团、异氰酸酯基基团、酰基基团、卤代烷基基团、烷基基团、烯基基团或炔基基团(特别是具有1-4个碳的那些)、苯基基团或苄基基团(包括被卤素或烷基取代的那些)、烷氧基、烷硫基或巯基(HS-)取代。在具体实施方案中，任选取代是用1-12个非氢取代基取代。在具体实施方案中，任选取代是用1-6个非氢取代基取代。在具体实施方案中，任选取代是用1-3个非氢取代基取代。在具体实施方案中，任选的取代基包含6个或更少的碳原子。在具体实施方案中，任选取代是用一个或多个卤素、羟基基团、氰基基团、氧代基团、硫代基团、未取代的C1-C6烷基基团或未取代的芳基基团取代。术语氧代基团和硫代基团是指碳原子被a＝O或a＝S取代，分别形成–CO-(羰基)或–CS-(硫代羰基)基团。

具体的取代的烷基基团包括卤代烷基基团，特别是三卤甲基基团，特别是三氟甲基基团。具体的取代的芳基基团包括单卤代、二卤代、三卤代、四卤代和五卤代苯基基团；单卤代、二卤代、三卤代、四卤代、五卤代、六卤代和七卤代萘基基团；3-卤代或4-卤代苯基基团，3-烷基或4-烷基取代的苯基基团，3-烷氧基或4-烷氧基取代的苯基基团，3-RCO或4-RCO取代的苯基，5-卤代或6-卤代萘基基团。更具体地，取代的芳基基团包括乙酰基苯基基团，特别是4-乙酰基苯基基团；氟苯基，特别是3-氟苯基基团和4-氟苯基基团；氯苯基，特别是3-氯苯基基团和4-氯苯基基团；甲基苯基基团，特别是4-甲基苯基基团；和甲氧基苯基基团，特别是4-甲氧基苯基基团。

应用于环状基团的术语“芳族的”是指包含双键的环结构，该双键可能通过一个或多个杂原子如氧原子、硫原子或氮原子在整个环结构周围共轭。芳基基团和杂芳基基团是芳族基团的实例。芳族基团的共轭体系包含特征数量的电子，例如，占据构成共轭体系的电子轨道的6或10个电子，其通常为未杂化的p-轨道。

术语碳环是指具有碳环或环体系的单价基团，其包含3至12个碳原子，并且可以是单环、双环或三环的。该环不含任何杂原子。该环可以是不饱和的、部分不饱和的或饱和的。

本文的式的化合物和取代基是任选地被取代的。取代基是指单个原子(例如，卤素原子)或两个或更多个相互共价键合的原子的基团，其通常替代氢原子共价结合至分子中的一个或多个原子，以满足分子中一个或多个原子的化合价要求。取代基的实例包括烷基基团、羟基基团、烷氧基基团、酰氧基基团、巯基基团和芳基基团。取代基本身可以被取代。

取代的或取代是指用一个或多个另外的取代基替代分子或化学基团或部分的氢原子，所述取代基例如但不限于卤素、烷基、烷氧基、烷硫基、三氟甲基、酰氧基、羟基、巯基、羧基、芳氧基、芳基、芳烷基、杂芳基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、吗啉基、哌啶基、吡咯烷-1-基、哌嗪-1-基、硝基、硫酸根合或其他R-基团。

碳环或杂环任选地被取代，如对其他基团的一般描述，如本文中的烷基基团和芳基基团。如果存在，取代通常在环C、环N或两者上。此外，碳环和杂环可以任选地在环中包含-CO-、-CO-O-、-CS-或-CS-O-部分。

至于本文中任何被取代的化学基团，即含有一个或多个非氢取代基，应当理解，这些基团不含有任何空间上不切实际和/或合成上不可行的取代或取代模式。此外，本发明的化合物包括由这些化合物的取代产生的所有立体化学异构体。

还考虑了所公开化合物的受保护衍生物。与所公开的化合物一起使用的各种合适的保护基团公开在Greene and Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis；3rdEd.；John Wiley&Sons,New York,1999中。一般来说，保护基团在不影响分子剩余部分的条件下被除去。这些方法是本领域众所周知的，包括酸水解、氢解等。一种优选的方法包括除去酯，例如使用路易斯酸性条件裂解膦酸酯，例如在TMS-Br介导的酯裂解中，以产生游离膦酸酯。第二种优选的方法包括除去保护基团，例如在合适的溶剂体系如醇、乙酸等或其混合物中利用碳载钯通过氢解除去苄基基团。基于叔丁氧基的基团，包括叔丁氧基羰基保护基团，可以在合适的溶剂体系如水、二

本发明提供了靶向TCF驱动的EMT的新治疗策略，这是一种促进肿瘤细胞异质性、MDR和转移的方法。发明人基于结构的药物设计产生了新的有效的CHD1L抑制剂，其在实施方案中靶向TCF驱动的EMT。当与细胞毒性化疗和靶向抗肿瘤药物以及放射治疗联合使用时，CHD1L抑制剂逆转EMT会是一种有效的治疗方法。这些EMT靶向剂还可以使原发性肿瘤和转移病灶对临床相关治疗敏感，并潜在地抑制肿瘤细胞转移。

因此，本发明的一个方面是CHD1L抑制剂，其可以用于治疗或预防多种晚期实体瘤和血癌的转移。还考虑了本发明所有CHD1L抑制剂化合物的药学上可接受的盐、前药、立体异构体和代谢物。

本发明明确包括根据本文的式的化合物的药学上可使用的溶剂化物。具体地说，有用的溶剂化物是水合物。式I的化合物或其盐可以被溶剂化(例如水合)。溶剂化可以在制备过程中发生，或者可以发生(例如，由于本文的式的初始无水化合物的吸湿性(水合作用))。

本发明的化合物可以具有前药形式。本发明化合物的前药可用于本发明的方法中。将在体内转化以提供本发明化合物的生物学、药学或治疗活性形式的任何化合物都是前药。前药的各种实例和形式在本领域中是众所周知的。前药是一种活性或非活性化合物，在将前药施用于受试者后，通过体内生理作用如水解、代谢等，将其化学修饰成活性化合物。本文中使用的术语“前药”是指药理学上可接受的衍生物，如酯、酰胺和磷酸盐，这样得到的衍生物的体内生物转化产物是本文所述化合物中定义的活性药物。前药优选地具有优异的水溶性、增加的生物利用度，并且在体内容易代谢成活性TOP2A抑制剂。本文所述化合物的前药可以通过修饰化合物中存在的官能团来制备，以修饰物通过常规操作或在体内可裂解为母体化合物的这种方式。制备和使用前药所涉及的适宜性和技术是本领域技术人员众所周知的。前药的实例可见于Design of Prodrugs,H.Bundgaard编辑，(Elsevier,1985),Methods in Enzymology,第42卷,第309-396页,K.Widder et al.编辑(AcademicPress,1985)；A Textbook of Drug Design and Development,Krosgaard-Larsen和H.Bundgaard编辑,第5章,"Design and Application of Prodrugs,"由H.Bundgaard编辑,第113-191页,1991)；H.Bundgaard,Advanced Drug Delivery Reviews,第8卷,第1-38页(1992)；H.Bundgaard et al.,Journal of Pharmaceutical Sciences,第77卷,第285页(1988)；以及Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,OxfordUniversity Press,New York,第388-392页)。

化合物或组合物的施用和施用化合物或组合物应理解为提供化合物或其盐、化合物的前药或包含化合物的药物组合物。该化合物或组合物可以由另一个人向患者施用(例如静脉内施用)，或者可以由受试者自己施用(例如片剂或胶囊)。术语“患者”指哺乳动物(例如，人类和兽医动物，如狗、猫、猪、马、羊和牛)。考虑将本文的CHD1L抑制剂与其他剂(例如替代的抗癌、抗肿瘤或癌症细胞毒性药物)联合施用。这种联合施用包括同时或在相隔几分钟、几小时或几天的时间施用两种或多种活性成分，这被认为是有效的，并且与CHD1L抑制剂要联合的任何已知替代治疗的施用一致。联合施用还包括通过相同的方法和/或患者身体的相同部位，或者通过不同的方法在不同部位施用，这也与CHD1L抑制剂要联合的已知替代治疗的施用一致。

本文的药物组合物包含指定的活性成分，其量对于给定患者的给定施用形式而言可有效实现所需的生物活性，并任选地包含药学上可接受的载体。药物组合物可以包括一定量(例如，单位剂量)的一种或多种公开的化合物以及一种或多种无毒的药学上可接受的添加剂，包括载体、稀释剂和/或佐剂，以及任选的其他生物活性成分。这种药物组合物可以通过标准药物制剂技术制备，例如在Remington'sPharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.(19th Edition)中公开的那些。

药学上可接受的载体是那些与制剂中的其他成分相容并且生物学上可接受的载体。载体可以是固体或液体。目前预期优选载体是液体载体。载体可以包括还可以用作增溶剂、悬浮剂、填料、助流剂、压缩助剂、粘合剂、片剂-崩解剂或包封材料的一种或多种物质。液体载体可以用于制备溶液、混悬液、乳剂、糖浆和酏剂。活性成分可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体如水(适当纯度，例如无热原、无菌等)、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可以含有其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于口服施用的组合物可以是液体或固体形式。

用于口服和胃肠外施用的液体载体的合适实例包括适当纯度的水、水溶液(特别是含有添加剂，例如纤维素衍生物、羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物、和油。对于肠胃外施用，载体也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物中。用于加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。无菌溶液或混悬液形式的液体药物组合物可以通过例如经肌内、腹腔或皮下注射施用。无菌溶液也可以经静脉注射。用于口服施用的组合物可以是液体或固体形式。载体也可以是乳膏和软膏、糊剂和凝胶的形式。乳膏和软膏可以是水包油型或油包水型的粘性液体或半固体乳剂。

所公开的化合物的“治疗有效量”是足以实现所需治疗效果(如抗肿瘤或抗转移效果)的化合物的剂量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以在类似于显示为在组织培养、体外或体内调节TCF转录和/或上皮-间充质转化(EMT)的那些的作用位点实现组织浓度的量。例如，化合物的治疗有效量可以是使得受试者接受约0.1μg/kg体重/天至约1000mg/kg体重/天的剂量，例如约1μg/kg体重/天至约1000μg/kg体重/天的剂量，例如约5μg/kg体重/天至约500μg/kg体重/天的剂量。

术语“调节”是指所公开的化合物改变生物功能的量、程度或速率、疾病的发展、或病症的改善的能力。例如，调节可以指化合物引起血管生成增加或减少、抑制TCF转录和/或EMT、或抑制肿瘤转移或肿瘤发生的能力。

治疗是指在疾病或病理状况开始发展后，改善其体征或症状的治疗性干预。如本文所用，术语“改善”，就疾病或病理状况而言，是指治疗的任何可观察到的有益效果。这种有益效果可以例如通过易感受试者的疾病的临床症状的延迟发作、疾病的部分或全部临床症状严重性的降低、疾病进展的减缓、受试者整体健康或幸福的改善，或者通过本领域公知的特定疾病具有的特定其他参数来证明。短语“治疗疾病”包括例如在有患病风险的受试者中，或患有疾病如癌症或与免疫系统受损相关的疾病的受试者中抑制疾病或病症的完全发展。预防疾病或病症是指对没有表现出疾病迹象或仅表现出疾病的早期迹象的受试者预防性地施用组合物，目的是降低发展成病理或病症的风险，或减轻病理或病症的严重性。

本申请中的所有参考文献，例如专利文献，包括已发布或授予的专利或等同物；专利申请公布文件；和非专利文献文件或其他原始材料；其全部内容通过引入并入本文，就像通过引用单独并入一样。说明书中提到的所有专利和公布文件表明了本发明所属领域的技术人员的技术水平。本文引用的参考文献通过引用整体并入本文，以表明在某些情况下截至其申请日的现有技术的状态，并且如果需要，本文旨在使用该信息来排除(例如，放弃)现有技术中的具体实施方案。例如，当要求保护化合物时，应当理解，现有技术中已知的化合物，包括本文公开的参考文献(特别是引用的专利文件)中公开的某些化合物不旨在包括在权利要求中。

Abbott et al.,2020和该期刊文章的补充信息均通过引用整体并入本文，用于描述可用于制备和评估本文CHD1L抑制剂的活性和性质的生物和化学方法。

当本文公开一组取代基时，应当理解为该组的所有单个成员和所有亚组，包括该组成员的任何异构体和对映异构体，以及可以使用取代基形成的化合物的种类被分别公开。当要求保护化合物时，应当理解，并不旨在包括本领域已知的化合物，这些化合物包括本文公开的参考文献中公开的化合物。当本文使用马库什组或其它分组时，该组的所有单个成员以及该组的所有可能组合和亚组合都旨在单独包括在本发明中。

当本文描述化合物使得例如在式或化学名称中没有指定该化合物的特定异构体、对映异构体或非对映异构体时，该描述旨在包括所述化合物的每种异构体和对映异构体(例如顺式/反式异构体、R/S对映异构体)的单独或任意组合。此外，除非另有说明，本文公开的化合物的所有同位素变体旨在包括在本发明中。例如，应当理解，所公开的分子中的任何一个或多个氢都可以被氘或氚替代。分子的同位素变体通常可用作该分子的分析以及与该分子或其用途相关的化学和生物学研究中的标准。同位素变体(包括携带放射性同位素的变体)也可用于诊断分析和治疗。制备这种同位素变体的方法是本领域已知的

本文公开的分子可以含有一个或多个可电离的基团[可以从其中除去质子的基团(例如-COOH)或加入质子的基团(例如胺)，或者可以季铵化的基团(例如胺)]。这些分子及其盐的所有可能的离子形式均旨在单独包括在本发明中。关于本文化合物的盐，本领域普通技术人员可以从多种可用的抗衡离子中选择适于制备用于给定应用的本发明的盐的那些。在具体应用中，选择给定的阴离子或阳离子来制备盐可能会导致该盐的溶解度增加或降低。

本发明的CHD1L抑制剂是商业上可获得的，或者可以通过本文公开的方法或通过使用商业上可获得的或可以通过已知方法制备的原料和试剂对这些方法进行常规调整来制备，而无需过度的实验。应当理解，根据要合成的化合物，可能有必要保护原料中潜在的反应性基团避免不希望的共轭。对于反应性基团，有用的保护基团是本领域已知的，例如Wutts&Greene,2007中所述。

本文的化合物可以是盐的形式，例如铵盐，具有选定的阴离子或季铵化的铵盐。如本领域已知的，可以通过向游离碱中加入酸来形成该盐。可以与无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成该盐，或者可以与有机酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰半胱氨酸等形成该盐。

在具体实施方案中，本发明的化合物可以含有一个或多个带负电的基团(游离酸)，其可以是盐的形式。游离酸的示例性盐是与无机碱形成的，其包括但不限于，碱金属盐(例如Li

所描述和要求保护的本发明的范围包括化合物的外消旋形式以及其单个对映异构体和其非外消旋混合物。本发明的化合物可以含有一个或多个不对称碳原子，因此这些化合物可以以不同的立体异构形式存在。该化合物可以是例如外消旋体或旋光形式。光学活性形式可以通过外消旋体的拆分或通过不对称合成获得。在本发明的优选实施方案中，本发明的对映异构体表现出+(正)的比旋度。优选地，(+)对映异构体基本上不含相应的(-)对映异构体。因此，基本上不含相应对映异构体的对映异构体是指通过分离技术分开或分离的化合物，或制备的不含相应对映异构体的化合物。“基本上不含”是指该化合物由显著更大比例的一种对映异构体构成。在优选的实施方案中，该化合物由至少约90重量％的优选对映异构体构成。在本发明的其他实施方案中，该化合物由至少约99重量％的优选对映异构体构成。优选的对映异构体可以通过本领域技术人员已知的任何方法从外消旋混合物中分开，包括高效液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶，或者通过本文描述的方法制备[参见，例如，Jacques et al.,1981；Wilen et al.,1977；Eliel,1962；Wilen,1972]。

本发明的化合物及其盐可以以它们的互变异构体形式存在，其中氢原子被置换到分子的其他部分，因此分子的原子之间的化学键重排。应该理解，所有可能存在的互变异构体形式都包括在本发明中。

除非另有说明，本文描述或举例说明的每种制剂、化合物或组分的组合都可以用于实施本发明。化合物的具体名称是示例性的，因为已知本领域普通技术人员可以不同地命名相同的化合物。当本文描述化合物使得例如在式或化学名称中没有指定该化合物的特定异构体或对映异构体时，该描述旨在包括所述化合物的每种异构体和对映异构体的单独或任意组合。

本领域普通技术人员将理解，在本发明的实践中可以使用除了具体示例的那些以外的方法、替代疗法、原料和合成方法，而无需求助于过度的实验。任何此类方法、装置元件、原料和合成方法的所有本领域已知的功能等同物都旨在包括在本发明中。无论何时在说明书中给出范围例如温度范围、时间范围或组成范围、所有中间范围和子范围，以及所给范围中包括的所有单个值都旨在包括在本发明中。

单数术语不定冠词(“a”、“an”)和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确指示。类似地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下文另有明确指示。术语“包含(comprises)”意味着“包括(includes)”。此外，“包含A或B”意味着包括A或B，或者A和B，除非上下文中另有明确说明。还应理解，为化合物给出的所有分子量或分子质量值都是近似值，并且是为了描述而提供的。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料，但合适的方法和材料将在下文中描述。此外，材料、方法和实施方案仅是说明性的，而不是限制性的。

如本文所用，“包含(comprising)”与“包括(including)”、“包含(containing)”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”排除了权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由……组成”不排除实质上不影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。术语“包含(comprising)”在本文中的任何叙述，特别是在组合物的组分的描述中或在装置的要素的描述中，应理解为包括基本上由所记载的组分或要素组成和由所记载的组分或要素组成的那些组合物和方法。这里说明性描述的本发明可以在不存在本文中未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下实施。

不希望被任何特定的理论所束缚，这里可以讨论与本发明相关的基本原理的概念或理解。应该认识到，不管任何机械解释或假设的最终正确性如何，本发明的实施方案仍然是可操作的和有用的。

已经采用的术语和表达用作描述性术语而非限制性术语，并且使用这些术语和表达并不旨在排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应该理解，尽管本发明已经通过优选实施方案和任选的特征被具体公开，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化，并且这些修改和变化被认为在本发明的范围内。

实施例

实施例1：CRC患者中CHD1L的临床病理表征

在一些癌症中，CHD1L表达与不良预后相关，但仅已知关于CRC中CHD1L的病理学的有限信息。该实施例描述了CRC患者中CHD1L的致病表征和病理机制。通过Cartes d’Identite des Tumeurs(CIT)项目分析了585例CRC患者的CHD1L表达(GEO:GSE39582)的临床病理特征[Marisa et al.,2013]。这些特征在Abbott etal.,2020年补充信息中进行了总结。

本实施例的其他数据参见Abbott et al.,2020年及其补充信息。可获得CIT队列中的所有患者15年间的随访信息。对于整个患者队列，高CHD1L患者的高CHD1L表达与较低OS(P＝0.0167)和8.8年的中位生存期(MS)相关。低CHD1L队列未达到中位生存期，因为72％(115/159)的患者被截尾(censored)，26％(42/159)的患者死亡。使用TNM分期系统评估患者数据。由于I期和IV期患者分别具有高存活或高死亡的可能性，因此对II期和III期CRC患者的生存期进行了评估。对于II期和III期CRC，高CHD1L表达与较低OS(P＝0.0191)和11年的MS相关，低CHD1L队列同样未达到中位生存期。还针对CRC的每个时期分析了CHD1L表达的生存期。II期患者的生存期表现出显著差异(P＝00319)，M.S.为11年，对于I期、III期或IV期患者没有观察到显著差异。对CHD1L表达的分析表明在表达癌症阶段具有显著差异。对患有I期和II期结肠直肠癌的患者与患有III期和IV期的患者进行了评估，并且显示出与早期队列相比，III期和IV期中CHD1L表达显著增加(P＝0.0051)。针对淋巴结转移的CHD1L表达的分析表明，CHD1L在区域淋巴结转移增加的患者中过表达(与N0相比，N1 P＝0.0128，N2 P＝0.05)。尽管N3队列的CHD1L表达的趋势是相同的，但由于可用的患者样本数量有限，因此未确定显著性。针对肿瘤大小、转移或位置，CHD1L表达没有显著差异。

研究了CHD1L表达与CRC的六种分子亚型[Marisa et al.,2013]:C1(免疫系统下降，n＝116)、C2(错配修复缺陷，n＝104)、C3(KRAS突变，n＝75)、C4(CSC，n＝59)、C5(激活的WNT通路，n＝152)和C6(染色体不稳定性，n＝60)的相关性。CHD1L在六种分子亚型中的表达具有显著差异(P<0.001)。CHD1L在C5、C4和C3中高表达，在C2和C6中低表达。C2亚型与WNT信号传导通路的减少和错配修复缺陷有关。与其他亚型相比，C4和C6亚型与较差的无复发生存率相关。C4亚型与CSC干性增加相关，而C5亚型与激活的WNT信号传导和去调节的EMT通路相关。C2(错配修复缺陷)亚型中较低的CHD1L表达与其在DNA损伤响应中的已知功能一致[Ahel et al.,2009]。此外，错配修复缺陷的患者的CHD1L表达低于无错配修复缺陷的患者(P<0.001)。KRAS突变患者的CHD1L表达也较高(P＝0.049)。CHD1L在C3、C4和C5分子亚型中的表达推动了对CHD1L表达在EMT、CSC干性和WNT/TCF通路中的功能的进一步研究。

利用来自UCCC GI肿瘤组织库的CRC患者的较小队列(n＝26)，观察到类似的趋势，与早期和原发性CRC相比，较大的CIT队列的CHD1L表达与晚期和转移性CRC显著相关(Abbott et al.,2020，补充信息)。将表达量化为FPKM(每千个碱基外显子每百万片段映射的片段)。转移性肿瘤样本的CHD1L显著多于原发性肿瘤。此外，与II/III期患者队列相比，IV期的CHD1L水平更高。当用参与KEGG WNT通路的基因分析CHD1L表达时，使用Spearman相关性，观察到与125个基因中的65个显著正相关。其中包括参与TCF介导的转录的公认基因，如拓扑异构酶IIα(TOP2A)(r＝0.65，P＝0.004[Zhou et al.,2016；Abraham et al.,2019]，以及TCF4(r＝0.61，P＝0.0012)(Abbott et al.,补充图2)。基因的相关值P<0.05。通过FPKM(每千个碱基外显子每百万片段映射的片段)对转录物表达进行Log

在已知的CSC标志物CD44(r＝0.43，P＝0.038)、LGR5(r＝0.55，P＝0.0075)和CHD1L之间观察到显著正相关。当比较CIT队列和UCCC队列时，观察到TOP2A(r＝4040.1275，P＝0.0020)和TCF4(r＝0.1050，P＝0.011)显著相关。与此结果一致，已经表明TOP2A是TCF-复合体的必需成分，促进CRC中的EMT[Zhou et al.,2016；Abraham et al.,2019]。因此，CHD1L似乎与CRC患者的TCF转录和EMT有关。

实施例2：CHD1L介导CRC中的TCF-转录

基于CHD1L与TCF-复合体成员的相关性，CHD1L可能在TCF转录中具有机制作用。为了评估这种作用，利用了分别具有高和低内源性CHD1L表达的SW620和DLD1细胞系。本实施例的其他数据参见Abbott et al.,2020及其补充信息。小发夹RNA(shRNA)用于敲除SW620细胞中的CHD1L(SW620

TCF转录的激活是一个动态过程，涉及共阻遏蛋白的脱落、共激活蛋白的结合和染色质景观的重塑[Lorch et al.,2010，Shitashige et al.,2008]。进行了与TCF4的共免疫沉淀(Co-IP)研究，证明了CHD1L直接结合至TCF复合体[Abbott et al.,2020]。

CHD1L已被很好地表征为在DNA损伤响应中的PARP1的结合伴侣[Pines，2012；Ahelet al.,2009]。PARP1也是与TCF4和β-连环蛋白结合的TCF复合体的成分[Idogawa et al.,2005]。本文的结果表明，CHD1L结合至TCF复合体，这可能是通过TCF4和PARP1之间的相互作用。

为了进一步表征CHD1L是TCF复合体的组分，在SW620细胞中进行了CHD1L对TCF复合体WNT响应元件(WRE)的染色质免疫沉淀(ChIP)[Abbott et al.,2020]。CHD1L富集在c-Myc、波形蛋白、slug、LEF1和N-钙粘蛋白WRE处，进一步支持了CHD1L直接与TCF复合体发挥作用。综上所述，这些数据表明CHD1L是TCF转录的关键组分。

以前，TCF转录被认为是CRC中EMT的主要调节因子[Zhou etal.,2016]。此外，CHD1L定位于EMT效应基因的WRE处[Abbott etal.,2020]。因此，测量SW620

进行克隆源性的集落形成试验[Abbott et al.,2020]以表征CHD1L表达对干性的影响[Franken et al.,2006]。通过集落形成测量到DLD1

实施例3：CHD1L的小分子抑制剂的鉴定

如本文实施例1和2中所述的，CHD1L是TCF介导的EMT的驱动因子。基于此，本文描述了鉴定CHD1L的小分子抑制剂的测定法。药物发现的目标是靶向CHD1L DNA易位或与DNA的相互作用，其依赖于CHD1L的催化结构域ATP酶的活性[Ryan&Owen-Hughes,2011；Flauset al.,2011]。

CHD1L属于染色质重塑者的SNF2(蔗糖非发酵剂2)ATP酶超家族，包含双叶ATP酶结构域[Abbott et al.,2020及其补充信息]。CHD1L也具有宏结构域，其相对于其他染色质重塑者是独特的，其通过宏结构域和ATP酶结构域之间的相互作用促进自动抑制状态[Lehmann et al.,2017；Gottschalk et al.,2009]。然而，宏结构域结合至CHD1L的主要激活剂PARP1，缓解了自身抑制[Lehmann et al.,2017；Gottschalk et al.,2009]。

使用Lehmann et al.,2017的方法纯化全长CHD1L(fl-CHD1L)和催化ATP酶结构域(cat-CHD1L)[Abbott et al.,2020及其补充信息]。蛋白质构建体用于体外HTS的CHD1L的重组表达和纯化，如Abbott et al.,2020所述。SDS page凝胶显示纯化的cat-CHD1L(68kD)和fl-CHD1L(101kD)。比较了cat-CHD1l与fl-CHD1L的酶动力学。与fl-CHD1L相比，cat-CHD1L提供了更强大的ATP酶分析，这与Lehman et al.,2017的报告一致。因此，为了鉴定CHD1L ATP酶的直接抑制剂，描述了TCF转录背景下的示例性高通量筛选(HTS)分析，其包括：cat-CHD1L、c-Myc DNA、ATP、和结合无机磷酸盐(Pi)时发荧光的磷酸盐结合蛋白。

该分析得到了验证，并针对临床相关的激酶抑制剂进行了试验筛选[Abbott etal.,2020及其补充信息]。试验筛选没有发现击中，表明CHD1L不是激酶抑制剂的可能靶点。验证后，使用Life Chemicals Diversity Set中的20,000种化合物进行了初步HTS，其在1％DMSO中以20μM进行了筛选，并以10mM EDTA作为阳性对照[Abbott etal.,2020及其补充信息]。该筛选提供了稳健的统计数据，在64个板上的平均Z’-因子值为0.57±0.06。平均化合物活性为92.3％±17.8。结果是，击中限制被设置为39％ATP酶活性时的平均值的3个标准偏差。这个严格的击中限制确定了64个击中，其中53个击中被证实针对重组CHD1L ATP酶活性。

实施例4：示例性抑制剂

购买了七个经确认的击中(化合物1-7，参见方案1)的子集，代表对cat-CHD1L ATP酶具有大于50％抑制的一系列药效基因。对化合物1-7进行了针对cat-CHD1L ATP酶的剂量响应研究，其验证了这些击中是有效的CHD1L抑制剂，其活性为900nM至5μM(图1A)。方案1中提供了另外的示例性化合物8-73的结构，其中SEM代表保护基团三甲基甲硅烷基乙氧基甲基。请注意，在方案1的许多情况下，括号中给出了额外的化合物编号，其可用于本文的表格和图中，或Abbott et al.,2020及其补充信息中。

使用TOPflash报告基因系统测试化合物1-7在HCT116、SW620和DLD1

在验证了针对CHD1L介导的TCF转录的击中5-7之后，评估了这些化合物在CRC中逆转EMT和其他恶性性质的能力。E-钙粘蛋白和波形蛋白分别是上皮和间质表型的推定生物标志物[McDonald et al.,2015]。E-钙粘蛋白的缺失和波形蛋白的获得也是预后不良的临床生物标志物[Yun et al.,2014；Richardson et al.,2012；Dhanasekaran et al.,2001；Kashiwagi et al.,2010；Toiyama et al.,2013]；因此，开发了E-钙粘蛋白(pCDH1-EcadPro-RFP)和波形蛋白(pCDH1-VimPro-GFP)的慢病毒启动子驱动的报告基因，其分别忠实地报告了E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达[Zhou et al.,2016；Abraham et al.,2019]。用EcadPro-RFP或VimPro-GFP转导的SW620细胞作为肿瘤类器官培养72小时，达到600μm的直径。用化合物5-7处理该肿瘤类器官另外72小时，以确定调节启动子活性的有效浓度50％(EC

化合物5-7有效地下调波形蛋白启动子活性，其EC

为了证实CHD1L抑制剂逆转EMT，评估了EMT的另外两种推定生物标志物——slug(间充质)和紧密连接蛋白-1(ZO-1，上皮)的蛋白表达。slug和ZO-1中的变化被认为是EMT的主要标准[Zeisberg&Neilson，2009]。用CHD1L抑制剂治疗的SW620肿瘤类器官下调slug并上调ZO-1，进一步表明EMT的逆转。Abbott et al.,2020中示出了显示另外的EMT生物标志物slug和ZO1的蛋白质表达变化的蛋白质印迹分析。

EMT的特征是CSC干性和细胞侵袭的增加。因此，测试了化合物5-7在HCT-116和DLD1

方案1：式I或式XX的示例性化合物

实施例5：抑制CHD1L对DNA损伤药物的效力

已知CHD1L在PARP1介导的DNA损伤响应修复中起作用，这是使DNA损伤化疗的耐药性增加的机制[Li et al.,2019；Ahel et al.,2009；Gottschalk et al.,2009]。例如，在过表达CHD1L的细胞中观察到肺癌对顺铂的耐药性。CHD1L敲除后顺铂的疗效恢复[Li Y.etal.,2019]。另外，单独敲除CHD1L并不会增加DNA损伤[Ahel D et al.,2009]。为了确定CHD1L抑制剂是否可以增加DNA损伤药物对用空载体(DLD1CHD1L-EV)转导的低CHD1L表达DLD1细胞和在CRC细胞中过表达DLD1CHD1L-OE的效力，将化合物6单独作为单剂以及与SN-38(前药伊立替康的活性药效团)、奥沙利铂和依托泊苷联合进行评估。为了评估DNA损伤，如Abbott et al.,2020及其补充信息所示，通过免疫荧光测定H2AX(γ-H2AX)的磷酸化，其是DNA损伤化疗的生物标志物[Ahel D.et al.,2009]。单独的化合物6示出当以10μM处理细胞并测量γ-H2AX活性时，没有显著的DNA损伤，其与先前报道的CHD1L敲除研究一致[AhelD.et al.,2009]。然而，在DLD1CHD1L-OE细胞中，与单独的依托泊苷和单独的SN-38相比，化合物6与依托泊苷(10μM)和SN-38(1μM)协同作用的联合处理显著增加了DNA损伤。在DLD1CHD1L-EV细胞中，仅依托泊苷和化合物6的联合表现出显著的协同作用。在所用的实验条件下，我们观察到与奥沙利铂没有协同作用。尽管如此，被称为FOLFIRI的SN-38(即，伊立替康)联合疗法是治疗CRC的标准治疗。因此，化合物6与SN-38联合时出现的增强的DNA损伤支持了这样的假设，即CHD1L抑制剂可以增加DNA损伤化疗的CRC标准治疗的功效。

实施例6:CHD1L抑制剂在诱导细胞死亡之前逆转EMT。

据报道，CHD1L通过抑制半胱天冬酶(caspase)依赖性细胞凋亡的激活而赋予抗细胞凋亡活性[Li et al.,2013；Sun et al.,2016]。此外，已知逆转或抑制EMT可恢复癌细胞的细胞凋亡活性[Lu et al.,2014]。为了确定CHD1L抑制剂是否在诱导细胞死亡之前逆转EMT，通过EcadPro-RFP报告基因活性监测E-钙粘蛋白表达，并使用CellTox

为了确定CHD1L抑制剂是否能够诱导CRC中的细胞凋亡，进行了SW620肿瘤类器官的蛋白质印迹，并且观察到E-钙粘蛋白在用5和6处理后被切割[Abbott et al.,2020]。E-钙粘蛋白的切割是细胞凋亡的标志[Steinhusen et al.,2001]。

相对于DMSO对照，更有效的CHD1L抑制剂6表现出切割的PARP1、切割的半胱天冬酶8和切割的半胱天冬酶3的增加[Abbott etal.,2020]。这些结果表明化合物6诱导外源性细胞凋亡，这与E-钙粘蛋白通过死亡受体介导的细胞凋亡一致[Lu et al.,2014]。

为了进一步表征CHD1L抑制剂的细胞凋亡活性，对SW620细胞经12小时的膜联蛋白-V染色进行了检查。与单独的DMSO相比，化合物6诱导了显著的细胞凋亡，并且具有与阳性对照SN-38(伊立替康的活性代谢物)相似的活性(图3B)。

CHD1L抑制剂对患者来源的肿瘤类器官(PDTO)有效。PDTO在临床前药物开发中的应用已被确立为临床疗效的预测性体外细胞模型[Drost J&Clevers H,2018]。在使用基于细胞系的模型确定了化合物6逆转EMT和诱导细胞凋亡的能力之后，在从科罗拉多大学癌症中心(University of Colorado Cancer Center，UCCC)的胃肠道(GI)组织库获得的患者样本CRC102产生的PDTO中评估了化合物6的效力(图3C)。与CRC细胞系中的结果一致，化合物6在PDTO中显示出有效的细胞毒性，EC50为11.6±2μM。

实施例7：示例性抑制剂化合物6的体外和体内PK、PD和肝毒性。

为了在计算机中评估化合物6的类药物潜力和性质，进行了体外和体内PK研究，评估了CLogP、水溶性、在小鼠肝微粒体中的稳定性和CD-1小鼠中的PK。

表1提供了化合物6的体内和体外药代动力学参数的总结。共识LogP(CLogP)值是使用SwissADME网络工具获得的[Daina et al.,2017]。化合物6通过腹腔注射施用于无胸腺裸鼠QD 5天，以测量在SW620异种移植肿瘤中的累积(图4)并评估肝毒性的组织病理学。Abbott et al.,2020示出了载体和化合物6处理的动物肝脏的代表性H&E染色显微照片切片(放大5倍)。图像显示正常的肝索和小叶结构，没有肝细胞变性、坏死、增生或实质炎症的证据。化合物6具有对肝代谢酶相对稳定的亲脂性(CLogP＝3.2)和水溶性的优异平衡，并且当施用至CD-1小鼠时具有优异的PK分布(disposition)。化合物6经腹腔(i.p.)施用后达到高血浆药物浓度C

在最初的研究中，化合物6在肝微粒体中的半衰期小于20分钟。在随后用不同的肝微粒体制剂进行的类似体外肝微粒体半衰期实验中(数据未显示)，化合物6表现出67分钟的更长半衰期，化合物6.3表现出98分钟的改善的(超过6)体外半衰期，化合物6.11表现出130分钟的进一步改善的(超过6)体外半衰期。化合物6的最初半衰期研究是用不同的肝微粒体制剂进行的，与后来的体外微粒体半衰期实验没有可比性。表2提供了第二系列体外和体内半衰期测量的结果，其中包括所示的几种另外的化合物的数据。

第二个急性体内实验使用6的最大耐受剂量(50mg/kg)经腹腔注射QD对无胸腺裸鼠施用五天。该实验的目的是(1)确定化合物6是否对肝造成急性毒性，(2)在VimPro-GFPSW620异种移植肿瘤中累积，和(3)确定PD效应。化合物6以10,533±5,579ng/mL(n＝4)的浓度在SW620肿瘤中累积。正如所预期的，当比较组织/血浆中化合物6累积的比率时，观察到其在肝中的累积是肿瘤中的2.7倍(图4)。然而，在施用的剂量和方案下，化合物6没有产生明显的肝毒性(表3)。总的来说，载体或化合物6处理的小鼠的肝之间没有显著的组织学差异。在载体和化合物6处理的动物中，观察到的主要组织学变化是肝包膜的最小纤维化和炎症。这表明是非常低级别的亚临床腹膜炎，与继发于腹腔药物施用的腹膜炎一致。

根据化合物6在肿瘤中的累积，通过蛋白质印迹分析测量PD对肿瘤组织的影响，表明间充质标志物波形蛋白、波形蛋白报告基因(VimPro-GFP)和slug的显著下调[Abbott etal.,2020]。虽然没有统计学意义，但也观察到上皮标志物ZO-1的上调和对切割的半胱天冬酶3(细胞凋亡的推定生物标志物)的诱导。总之，化合物6的PD作用的这些观察表明体内EMT的逆转和细胞凋亡，这与化合物6的基于细胞的体外抗肿瘤活性一致。化合物6显示出良好的PK类药物特性和改变EMT并在体内诱导细胞凋亡的能力，而没有观察到肝毒性。

相反，与化合物6相比，化合物6.11经腹腔(i.p.)施用后表现出显著更长的半衰期(T

表1：化合物6的PK参数

表2：CHD1L抑制剂药代动力学

表3：用载体或化合物6(50mg/kg)QD处理无胸腺裸鼠的肝脏5天的组织学评估原始评分。

实施例8：化合物8的生物学评估

在上述许多生物检测中评估了化合物8。结果显示在图7A-E中。与化合物6相比，化合物8表现出更有效的对CHD1L介导的TCF转录的剂量依赖性抑制(图7A)。同样，化合物8逆转EMT，这由波形蛋白的下调和E-钙粘蛋白启动子活性的上调所证明(分别为图7B和7C)。化合物8在10天显著抑制克隆源性的集落形成(图7D)。化合物8在48小时显著抑制对HCT116的侵袭潜能(图7E)。

实施例9：本文实施例中应用的方法

抗体。单克隆小鼠抗TCF4抗体购自EMD Millipore(Billerica，MA，USA)(目录#05-511)，1∶1000稀释用于蛋白质印迹，2μg抗体/300μg蛋白质用于IP。单克隆兔抗CHD1L抗体购自Abcam(Cambridge，MA，USA)(目录#ab197019)，1∶5000稀释用于蛋白质印迹，1.5μg抗体/300μg蛋白质用于IP。单克隆兔抗波形蛋白(目录#5741)、抗Slug(目录#9585)、抗E-钙粘蛋白(目录#3195)、抗ZO-1(目录#8193)、抗组蛋白H3(目录#4620)购自Cell Signaling(Danvers，MA，USA)，并且小鼠抗α-微管蛋白(目录#3873)购自Cell Signaling，1:1000稀释用于蛋白质印迹。单克隆兔抗β-连环蛋白(目录#9582)购自Cell Signaling，1:1000稀释用于蛋白质印迹。单克隆兔抗磷酸-β-连环蛋白购自Cell Signaling(目录#5651)。单克隆兔抗TCF4(目录#2569)和抗组蛋白H3(目录#4620)购自Cell Signaling，2μg抗体/1mg蛋白质用于ChIP。抗兔IgG HRP连接的二抗(目录#7074)购自Cell Signaling，1∶3000稀释用于蛋白质印迹。抗山羊和抗小鼠IgG HRP连接的二抗(目录#805-035-180和#115-035-003)来自Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA)，1∶10,000稀释用于蛋白质印迹。

来自CIT队列(GEO:GSE39582)的585名CRC患者的转录组表达数据用于计算机验证(GSE39582)[Marisa et al.,2013]。基因表达分析由Affymetrix GeneChip

CHD1L截止值和临床病理特征通过多重cox回归分析来评估。只有在单变量分析中具有显著性的变量才整合到cox回归模型中，使用Wald正向算法进行显著性测定。对包括多于2组的所有变量进行分类，协变量的逐步进入标准为P<0.05，去除标准为P>0.1。使用

来自CRC患者肿瘤异种移植物的RNA-seq数据从UCCC(University of ColoradoCancer Center)GI肿瘤组织库获得，并如前所述进行分析[Scott et al.,2017]。简言之，基因表达由Log2标准化，并通过FPKM(每千个碱基的转录每百万映射读取的片段)来测量。由Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)定义的Wnt信号传导通路用作本研究中的基因集。CHD1L表达<1FPKM的样品被认为是低表达，并从本研究中去除。使用matrix2png(基因Z标准化的)将具有显著的Spearman相关性(P<0.05)的基因显示为热图[参见Abbott etal.,2020及其补充信息]。

在pGEX-6P-1质粒(GenScript，Piscataway，NJ)中合成全长CHD1L。将侧翼为EcoRI和NotI的CHD1L序列消化掉，并连接至慢病毒骨架，以创建pCDH1-CMV-CHD1L-EF1-puro质粒，用于在人类CRC细胞中过表达CHD1L。

将CRC细胞系和来自小鼠的均质化的肿瘤组织样本重悬于RIPA裂解缓冲液(20mMTris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM Na

TOPflash试验(Millipore，Billerica，MA)用于评估CRC细胞中的TCF转录活性。将总共20,000个细胞/孔接种在96孔白板中，并用

核细胞裂解物由未处理的SW620细胞产生138。对于输入对照，保存100μL的1mg/mL的核提取物，并用作输入。免疫沉淀(IP)利用Dynabeads

使用先前描述的详细方法[Zhou et al.,2016]，用1.42％甲醛交联细胞15分钟，并用125mM甘氨酸淬灭5分钟。用Szak的RIPA(放射免疫沉淀分析缓冲液)缓冲液溶解细胞并进行超声处理。IP步骤在4℃如下进行：50μL蛋白A/G琼脂糖珠用冷的Szak的RIPA缓冲液预洗涤，并与1mg裂解物一起孵育2小时。加入0.3mg/mL鲑鱼精子DNA，并孵育2小时。将裂解物(100μL)留作输入对照。向剩余物中加入抗-CHD1L(2μg)并孵育过夜。洗涤珠子，吸上清液至100μL，然后加入200μL的1.5x-Talianidis洗脱缓冲液(70mM Tris-Cl pH 8.0，1mM EDTApH 8.0，1.5％w/v SDS)。为了洗脱免疫复合体和反向交联，添加12μL 5M NaCl，并将混合物在65℃孵育16小时。将上清液与20μg蛋白酶K混合，并在37℃孵育30分钟。用苯酚/氯仿提取DNA，并用乙醇沉淀。使用已知的公开引物，用PowerUp

如前所述，CHD1L在SW620细胞中被敲除或在DLD1细胞中过表达后评估集落形成[Zhou et al.,2016；Abraham et al.,2019]。将细胞以1000个细胞/孔铺在6孔板中，并在10天的时间过程中每周更换2次培养基。也如前所述进行集落形成分析[Zhou et al.,2016；Abraham et al.,2019]。

为了评估CHD1L抑制剂抑制CSC干性的能力，将HCT-116或CHD1L过表达的DLD1细胞系在单层培养物中用载体对照(0.5％DMSO)或图2C所示浓度的CHD1L抑制剂预处理24小时。将预处理的活细胞以1,000个细胞/孔铺在6孔板中，或以200个细胞/孔铺在24孔板中。使用

将细胞系培养[Zhou et al.,2016；Abraham et al.,2019]为肿瘤类器官，使用含5％FBS的无酚红RPMI-1640，并以5,000个细胞/孔接种到未包被的96孔U形底超低吸附微孔板(Perkin-Elmer，Hopkinton，MA)中，随后以1,000rpm离心15分钟以促进细胞聚集。加入终浓度为2％的

如先前报道的，使用pCDH imPro-GFP-EF1-puro病毒或pCDH-EcadPro-mCherry-EF1-puro病毒产生稳定的VimPro-GFP或EcadPro-RFP SW620报告基因细胞[Zhou et al.,2016；Abraham et al.,2019]。如本文所述，稳定的荧光标记的报告基因细胞用于产生肿瘤类器官。用10μM的CHD1L抑制剂将肿瘤类器官再处理72小时。处理后，用16μM的Hoechst33342将肿瘤类器官染色1小时(细胞核染色)。图像是用5倍空中物镜拍摄的。对于总共15个光学切片，Z-堆叠被设置为相隔26.5μm。使用Opera Phenix

如本文所述培养SW620肿瘤类器官。CellTox

将HCT116细胞以60,000个细胞/孔铺在

Cat-CHD1L(残基16-61)和fl-CHD1L(残基16-879)构建体是由卡罗林斯卡学院医学生物化学和生物物理系(Karolinska Institute,Department of MedicalBiochemistry and Biophysics)的Helena Berglund慷慨赠予的。蛋白质在TerrificBroth(ThermoFischer,Waltham,MA)中的Rosetta

所有反应均使用低体积非结合表面384孔板(Corning Inc.,Corning NY)进行。将cat-CHD1L或fl-CHD1L(100nM)和200nM c-Myc DNA或单核糖体(Active Motif,Carlsbad,CA)加入到含有50mM Tris pH 7.5、50mM NaCl、1mM DTT、5％甘油的缓冲液中，通过加入10μM ATP(New England Biolabs,Ipswich,MA)至总体积为10μL来引发反应，并在37℃孵育1小时。通过加入500nM的磷酸根传感器(Life Technologies,Carlsbad,CA)测定ATP酶活性，该传感器含有标记的磷酸根结合蛋白，用荧光团MDCC特异性标记，并在

测定组合物与上述使用cat-CHD1L的相同，除了改变反应混合物的体积以适应药物或DMSO的加入。使用

CRC患者肿瘤组织获自UCCC GI组织库，并按照既定方案进行扩增[Morin et al.,1997]。简言之，将细胞以5,000个细胞/孔接种在96孔板中，并通过既定方法培养[Frankenet al.,2006]，使PDTO经72小时形成。PDTO用DMSO(0.5％)或不同浓度的化合物6另外处理72小时，以获得剂量响应。使用

将SW620细胞以30,000个细胞/孔铺在96孔板中。用DMSO(阴性对照)、SN-38(细胞凋亡阳性对照)和指定浓度的化合物6处理细胞12小时。然后用冷PBS冲洗细胞2次，用冷Annexin-V染色缓冲液(10mM HEPES、pH 7.4、140mM NaCl、2.5mM CaCl

将DLD1

使用最近报道的详细方法[Abraham et al.,2019]测量化合物6的水溶性。将PBSUV吸收光谱与1-丙醇中的完全饱和溶液进行比较，并使用线性回归分析确定化合物6在含10％DMSO的PBS(pH 7.4)中的溶解度。在重复实验中进行在PBS中的溶解度的测量。共识LogP(CLogP)值是使用SwissADME网络工具获得的[Daina et al.,2017]。

按照最近报道的方法[Abraham et al.,2019]，使用购自Sekisui XenoTech(Kansas City,KS)的雌性CD-1小鼠微粒体(M1500)测定化合物6的微粒体稳定性。样品以20,000g离心10分钟，将上清液转移到至自动进样器小瓶，用于LCMS分析。监测化合物6(分子量＝393.5)的以下质量转变(m/z，amu)。

所有动物研究均按照科罗拉多大学安舒茨医学校区(University of ColoradoAnschutz Medical Campus)(Aurora,CO)和科罗拉多州立大学(Colorado StateUniversity)(Fort Collins,CO)的实验动物管理和使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)(IACUC)批准的动物协议程序进行。

使用最近报道的方法[Abraham et al.,2019]将购自Charles River(Wilmington，MA)的9周龄雌性CD-1小鼠用于PK研究。简言之，PK研究设计为覆盖0.25-24小时的范围，3只小鼠/时间点，总共21只小鼠/化合物6。每只小鼠经腹腔注射在100％DMSO中制备的50mg/kg化合物6一次。在具体的时间点采集全血，分离出的血浆在-80℃冷冻保存或用于LC-MS/MS分析。

将悬浮在100μL的

使用Welch校正统计分析对数据进行非配对双尾Student t检验，或者使用Prism8(GraphPad,LaJolla,CA)对数据进行检验。所有实验重复3次(n＝3)或如方法中所述。

实施例10：评估化合物活性的其他实验方法

图7A和7B说明了代表性单剂在SW620结肠直肠癌(CRC)的肿瘤类器官中的细胞毒性的剂量响应研究，并提供了所示的示例性化合物的IC

图4A：肿瘤类器官的细胞毒性

表4B提供了所示的代表性CHD1L抑制剂(CHD1Li)与SN38或Olaparib的联合治疗的结果。在四种不同的CRC肿瘤类器官类型中进行治疗。CHD1L抑制剂的浓度如所示变化。与单独的SN38和Olaparib相比，联合治疗的IC

表4B:肿瘤类器官细胞毒性联合治疗

图8B显示了单独的化合物6、单独的伊立替康(SN38)和两者的联合在DLD1空载体(EV)细胞和DLD1(OE)过表达细胞中的γ-H2AX强度(相对于DMSO)的图。图8A是示出相比β-微管蛋白在这些细胞中的对照表达，DLD1(EV)细胞相比DLD1(OE)细胞的CHD1L的相对表达的蛋白质印迹。已知CHD1L对PARP-1介导的DNA修复至关重要，可导致对DNA损伤化疗的抗性[Ahel el al.,2009；Tsuda el al.,2017]。图8B中的数据证明了CHD1L抑制剂与SN38协同诱导DNA损伤的“靶向”效应。

图9A-9C说明了在SW620结肠直肠癌(CRC)肿瘤类器官中与示例性CHD1L抑制剂6、6.3、6.9和6.11的协同作用研究的结果。SN38与6和6.3的联合在杀死结肠SW620肿瘤类器官方面的效力分别是单独SN38的50倍和150倍。SN38与6.9和6.11的联合都是单独SN38的100倍以上。化合物6、6.3、6.9和6.11中的每种都显示出与伊立替康(和SN38)在杀死SW620肿瘤类器官方面的协同作用。

示例性CHD1L抑制剂的协同作用评分，其中评分根据De Veroli et al.,2016的报告中所述进行确定，并在表5中提供。为了解释协同作用的评分值，由于SynergyFinder已将输入数据标准化为抑制百分比，它们可以直接解释为可以归因于药物相互作用的细胞响应的比例(例如，协同作用评分20对应于超出预期的20％的响应)。根据我们的经验，接近0的协同作用评分对协同作用或拮抗作用的置信有限。当协同作用评分为：

小于-10：两种药物之间的相互作用很可能是拮抗作用；

从-10到10：两种药物之间的相互作用很可能是相加作用；

大于10：两种药物之间的相互作用很可能是协同作用。

表5：SN38与代表性化合物的示例性的协同作用评分

图10包括SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随用单独的化合物6、单独的伊立替康、或其联合治疗的天数(最高达28天)而变化的图表。与单剂治疗组或对照相比，伊立替康和化合物6的联合在治疗28天内显著抑制结肠SW620肿瘤异种移植物至几乎没有肿瘤体积。

图11包括SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随用单独的伊立替康(1)、或化合物6和伊立替康的联合(2)治疗的天数(最高达28天)而变化的图表。与单独的伊立替康相比，伊立替康和化合物6的联合在最后一次治疗后显著抑制结肠SW620肿瘤至几乎没有肿瘤体积。在最后一次单独的伊立替康治疗的2周内，肿瘤体积上升到最后一次治疗的体积以上，表明肿瘤复发。相反，该联合保持了较低的肿瘤体积。

图12示出了与载体(1)、单独的化合物6(2)和单独的伊立替康(3)相比，单独的化合物6和与伊立替康(4)的联合显著增加了荷CRC肿瘤的小鼠的存活率。

图13包括SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随用单独的化合物6.11、单独的伊立替康、或其联合治疗的天数(最高达20天)而变化的图表。与单独的伊立替康或对照相比，伊立替康和化合物6.11的联合显著抑制结肠直肠癌SW620肿瘤异种移植物。

图14包括SW620肿瘤异种移植物的肿瘤体积(倍数)随用单独的伊立替康、或化合物6.11与伊立替康的联合治疗的天数(最高达33天)而变化的图表。与单独的伊立替康相比，伊立替康和化合物6.11的联合在最后一次治疗(第33天)后显著抑制结肠直肠SW620肿瘤。治疗后8天(Tx释放)，单独的伊立替康治疗的肿瘤体积增加了约3倍，表明肿瘤复发。相反，6.11和伊立替康的联合治疗的肿瘤体积在治疗后继续下降(约1.5倍)。治疗后8天的单独的伊立替康治疗与6.11和伊立替康的联合治疗之间的肿瘤体积差异为3.4倍。

图15显示与单独的伊立替康和对照相比，化合物6.11与伊立替康的联合显著增加了荷CRC肿瘤的小鼠的存活率。

实施例11：抑制剂的目前优选的结构活性关系的总结

基于本发明的CDH1L抑制剂的式I，目前优选的结构活性关系如下:

对于B环，目前优选的环是6元芳环或稠合的6,6元芳香环，并且两个X都是N。如果存在第二个稠合环的话，该稠合环可以含有一个或两个额外的N。优选的R

在一个实施方案中，CHD1L的HTS筛选鉴定了式XX所示的苯基氨基嘧啶药效团：

及其盐，其中R

在实施方案中，R

本发明的示例性化合物在方案1中示出。

示例性的R

示例性的R

式I的示例性B环在方案4中示出。

方案1：式I或式XX的示例性化合物

方案1(续)

方案1(续)

方案1(续)

方案1(续)

方案1(续)

方案1(续)

方案1(续)

方案1(续)

方案1(续)

方案2(示例性的R

方案2(续)

方案2(续)

方案3：示例性R

方案3(续)

方案3(续)

方案3(续)

方案3(续)

方案3(续)

方案4(用于式I的示例性B环)

其中X

实施例12：示例性合成方法

式XX的化合物以及本发明的许多其他化合物通过例如方案5中示出的方法制备，其中变量如上所定义。这种三步合成始于用对苯二胺B在2,4-二氯-嘧啶A(例如2,4-二氯-6-甲基嘧啶，其中R

各种取代的原料A、B、D和F是可商购的或可以使用已知方法制备。在实施方案中，可以使用已经被R

方案5

N-(4-氨基苯基)-2-氯-6-甲基-嘧啶-4-胺(102)。在0℃，向溶解在10mL乙醇中的0.5g(3.06mmol)2,4-二氯-6-甲基嘧啶(100)中加入513.7μL(1.2当量、372.5mg、3.68mmol)的三乙胺(TEA)和330.5mg(3.06mmol)的对苯二胺(101)。将反应混合物升温至室温并在该温度下搅拌过夜。真空除去溶剂并将所得残余物在硅胶上使用40％己烷的乙酸乙酯溶液作为洗脱剂进行色谱分离，得到500mg(70％产率)的纯产物(102)。

N-(4-氨基苯基)-6-甲基-2-(吡咯烷-1-基)嘧啶-4-胺(104)。在室温，向溶解在120mL DMF中的1.2g N-(4-氨基苯基)-2-氯-6-甲基-嘧啶-4-胺(102)中加入777.3mg(5.62mmol)碳酸钾和3.63mg(4.12mL、51.1mmol)的吡咯烷(103)。将反应混合物在80℃加热8小时。将反应冷却至室温并用水稀释。用乙酸乙酯(3×100mL)萃取产物。将有机层合并并用盐水洗涤，然后用Na

N-(4-((6-甲基-2-(吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-2-(噻吩-2-基)乙酰胺(6)。在0℃，向700mg(2.60mmol)N-(4-氨基苯基)-6-甲基-2-(吡咯烷-1-基)嘧啶-4-胺(104)(15mL)中加入406mg(2.86mmol)2-噻吩乙酸(105)、906.8μL(657.5mg、6.50mmol)TEA和3.06mL(1.65mg、5.20mmol)T3P(乙酸乙酯溶液中的50重量％)。将混合物升温至室温并搅拌15小时。通过逐步加入水淬灭反应，并用DCM(3×150mL)萃取产物，然后用盐水洗涤。合并有机层，用Na

Boc保护的吲哚-3-羧酸106-boc用于在T3P和TEA存在下与化合物104的肽偶联方法，以实现boc保护的吲哚衍生物8-boc的合成，其通过boc保护基团的TFA脱保护以良好的产率转化为吲哚衍生物8。注意boc保护基是-COO-t-丁基K2Co3、KI、EtOH。

N-(4-{[6-甲基-2-(1-吡咯烷基)-4-嘧啶]氨基}苯基)-1-{[(2-甲基-2-丙基)氧基]羰基}-1H-吲哚-3-甲酰胺(8-boc)。在0℃向80mg(0.297mmol)化合物104的8mL DCM中添加85.36mg(0.3267mmol)boc-保护的吲哚-3-羧酸(106-boc)、103.6μL(75.13mg、0.742mmol)TEA、350μL(189mg、0.594mmol)T3P。将混合物升温至室温并搅拌20小时。通过逐步加入水淬灭反应，并用DCM(3×50mL)萃取产物，然后用盐水洗涤。合并有机层，用Na

N-(4-{[6-甲基-2-(1-吡咯烷)-4-嘧啶]氨基}苯基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(8)。将70mg(0.136mmol)N-(4-{[6-甲基-2-(1-吡咯烷)-4-嘧啶]氨基}苯基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(8-boc)溶解在25％TFA 的DCM(5mL)中。将溶液在室温搅拌3小时。减压除去溶剂，粗产物使用硅胶和10％甲醇的DCM纯化，得到43.78mg(78％产率)纯产物。

方案6

方案7示出了针对化合物6的产率优化的另一种合成方法。在该方法中，叔丁基保护氨基甲酸酯，例如，化合物35与所选择的芳族羧酸如化合物36反应，形成保护氨基甲酸酯的中间体如化合物37。如本领域已知的，例如用三氟乙酸(TFA)将中间体去保护，并且去保护的氨基甲酸酯与带有伯胺或仲胺基团(例如吡咯烷基基团)的氯化杂环基团如化合物38反应，以形成期望的式XX的化合物如化合物6。该方法还可以用于通过选择起始芳族羧酸和带有伯胺或仲胺基团的氯化杂环化合物来制备式XX的各种化合物。

在方案7中，示出了用于合成化合物6的试剂，其中第一个反应中DCC是N,N'-二环己基碳二亚胺，DMAP是二甲基氨基吡啶，溶剂是DCM二氯甲烷。在第二个反应中，在TFA脱保护后，使用碳酸钾和碘化钾的乙醇溶液。本领域普通技术人员可以容易地调整用于制备期望的式XX的化合物的试剂和反应条件。

方案7

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