分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

马铃薯帚顶病毒(Potato mop-top virus,PMTV)是植物杆状病毒科(Virgaviridae)、马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)的代表种，是拥有三分体基因组的正义单链RNA病毒(ssRNA)，RNA1长约6.0kb，RNA2长约3.5kb，RNA3长约2.5～3.0kb。病毒粒子形态为无包膜的刚直杆状，直径18～20nm，三种典型长度分别为65～80nm、150～160nm、290～310nm。PMTV的RNA1含有一个开放阅读框(ORF)，编码一个148kDa的蛋白和一个可能参与复制的206kDa的通读蛋白，其中148kDa蛋白N端有一个甲基转移酶(Mtr)结构域，C端有一个解旋酶(Hel)结构域。206kDa的通读蛋白C端有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)结构域。RNA2即RNA-CP，编码一个以UAG终止的衣壳蛋白(CP)的ORF，并编码61-79KDa的CP通读蛋白。RNA3编码一个三基因盒(Tripe gene block,TGB)和一个8K蛋白或称之为富含半胱氨酸蛋白(CRP)，TGB由三个部分重叠的ORF组成，即TGBp1、TGBp2和TGBp3。TGB在其他正链RNA病毒如Allexivirus、Benyvirus、Carlavvirus、Fovevirus、Hordeivirus、Pecluvirus和Potexvirus属中也存在。目前的研究证明PMTV的系统移动不依赖衣壳蛋白的表达和病毒粒子的组装，而这些TGB和8K蛋白通过互作参与了病毒的细胞间移动和系统运输。

PMTV侵染后症状取决于马铃薯品种和环境条件。温度较低时，症状可能会较明显，但随着温度升高，症状会减弱。叶片症状包括下部叶片出现亮黄色斑点、亮黄色“V”字形、弧形或环状图案，叶片变形，节间缩短；块茎上的症状通常包括坏死和内部变色，包括铁锈棕色的弧、环或斑点，有时，感染PMTV的块茎也可能不表现出症状；而块茎外部PMTV症状不常见，表现为表面环状隆起。

联合国粮农组织(FAO)数据显示，在2005年，发展中国家的马铃薯产量首次超过发达国家，而目前中国是最大的马铃薯生产国，中国的马铃薯种植面积和马铃薯产量占全球的20％以上。PMTV可导致马铃薯产量的重大损失。一项对苏格兰种薯的研究显示，PMTV引起的产量降幅高达67％。这种病毒还会引起块茎肉的扭曲和坏死造成形态缺陷，产生不美观的土豆，面临加工者和包装商的商业排斥。目前关于马铃薯帚顶病毒的研究在国外相对成熟，而在国内相关研究较少，但是近几年PMTV在国内多地均有报道，随着气候条件变化、种薯和组培苗引进等诸多因素的影响，PMTV的检验检疫亟需引起重视。

目前PMTV风险主要表现在：1)识别检测困难：侵染后症状受品种和气候影响，症状轻微时，易于其他病毒引起的黄叶症状混淆，块茎症状与TRV和PVY相似，不利于田间诊断、掌握疫情、针对性地除去病株；2)易于传播：PMTV主要经粉痂菌的游动孢子传播，而释放游动孢子的休眠孢子在干燥情况下保持2年以上仍可传播病毒，因此即使种薯本身不带毒，只要有带毒的休眠孢子附着在种薯上，就不能排除PMTV随种薯传入的可能性；3)一旦侵入难以根除：粉痂菌的休眠孢子以能抵御不良环境的孢子球形式存在，且其寄主又十分广泛，因此，带毒的粉茄菌一旦传入就很难根除。目前PMTV传毒介体马铃薯粉痂菌在我国内蒙、吉林、甘肃、江西、福建、广东、贵州、云南等地均已发现，而且国内、国际种薯调运和种质资源交换频繁，致使该病毒扩散流行的风险很高。目前我国防止该病毒病的入侵主要策略是加强该病毒的检验检疫，种植无毒的马铃薯种薯种苗。

为强化我国PMTV的检验检疫技术，建立检测PMTV简单快捷、经济有效、高通量的实用检测技术是极其必要的。血清学方法较常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法具有简捷、经济、准确、高通量检测等优点，是植物病毒检测诊断最常用和最实用的方法之一。而血清学的方法的建立依赖于高质量的病毒抗体。本发明以原核表达的PMTV衣壳蛋白(CP)作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌PMTV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PMTV的高通量的dot-ELISA血清学方法及试剂盒，为我国马铃薯中该病毒的检测诊断和口岸检验检疫、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控建立等提供试剂和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

本发明具体采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗的杂交瘤细胞株4D2，它能分泌抗马铃薯帚顶病毒的特异性单抗，所述的杂交瘤细胞株4D2于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45330。

第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体。该单抗腹水间接ELISA效价达10

所述的抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体能与马铃薯帚顶病毒(PMTV)有特异性免疫反应，而不与侵染马铃薯的马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯M病毒(PVM)，马铃薯A病毒(PVA)、烟草花叶病毒(TMV)反应，也不与健康马铃薯植物组织发生免疫反应。

第三方面，本发明提供了一种如上述第二方面所述抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用，它是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗PMTV特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA血清学等检测方法及其检测试剂盒能快速、特异、灵敏、准确地检测PMTV；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测PMTV病毒，对操作人员的技术要求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于田间PMTV的检测诊断及口岸检验检疫，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。

附图说明

图1RT-PCR扩增PMTV CP基因结果；

图2纯化的PMTV CP重组蛋白的SDS-PAGE分析结果；

图3dot-ELISA方法检测PMTV的特异性分析结果；

图4dot-ELISA方法检测PMTV的灵敏度分析结果；

图5ACP-ELISA(A)、RT-PCR(B)、dot-ELISA(C)检测样品中PMTV结果。

生物保藏

分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗杂交瘤细胞株4D2于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.45330。

具体实施方式

分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗杂交瘤细胞株4D2于2022年11月7日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45330，能分泌抗马铃薯帚顶病毒的单抗。

一种由上述杂交瘤细胞株4D2分泌的抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体，该抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10

上述抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体能与马铃薯帚顶病毒(PMTV)有特异性免疫反应，而不与侵染马铃薯的马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯M病毒(PVM)，马铃薯A病毒(PVA)、烟草花叶病毒(TMV)反应，也不与和健康植物组织发生免疫反应。

上述抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立检测PMTV的高通量的血清学方法可应用于田间植物样品中PMTV的检测诊断及口岸检验检疫，从而为我国PMTV的科学防控提供试剂和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞制备及其单克隆抗体的制备

1.免疫原的制备

用以下操作步骤进行PTMV CP基因的原核表达及重组蛋白的纯化：

1)利用Trizol提取PMTV侵染的马铃薯植株总RNA。

2)根据NCBI GenBank中已经报道的PMTV全基因序列(Accession No.KM822700)，设计PMTV CP基因的特异性引物：PMTV-CP-F(5’-gccatggctgatatcggatccATGGCTGAAAACAGAGGTGAGC-3’)和PMTV-CP-R(5’-tgcggccgcaagcttgtcgacCTATGCACCAGCCCAGCG-3’)，小写序列分别是Bam HI和Sal I限制性内切酶酶切位点与载体同源序列。通过RT-PCR方法从PMTV侵染的马铃薯提取的总RNA中扩增出PMTV CP基因(图1)，并经DNA测序和核酸blast比对验证。

3)同源重组：将扩增的PCR产物割胶回收后经Bam HI和Sal I酶切，经同源重组克隆至带有His标签的原核表达载体pET-32a(Novagen,Darmstadt,Germany)中。将重组产物pET-32a-PMTV-CP热激转化到大肠杆菌DH5α中，涂板培养，挑取单菌落进行PCR检测，将筛到pET-32a-PMTV-CP阳性克隆送公司测序。

4)测序后进行序列比对，确认PMTV CP序列无误且阅读框准确后，将构建成功的重组质粒pET-32a-PMTV-CP热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株(GE Healthcare,Bucks,UK)中，恢复培养后，涂板、菌落PCR验证，获得重组子阳性的表达菌株。

5)pET-32a-PMTV-CP表达菌株接种到2mL含氨苄抗生素(Amp)的LB培养基37℃培养12h，将菌液以1:100倍稀释的比例转接到含Amp的LB培养基中，37℃震荡培养2-3h至OD

6)咪唑法纯化PMTV-CP重组蛋白：诱导后的菌液经6000rpm 10min离心后去上清，菌沉淀用50mL PBS重悬，超声波破碎至溶液澄清，离心后将上清与500μL高亲和镍离子树脂High Affinity ni-charge resin FF(GenScript，USA)混合，4℃缓慢滚动孵育结合2h。

7)将上述混合液倒入蛋白纯化柱，流出的过柱液重新倒回过柱一次，液体流尽后，用20mM、50mM浓度的咪唑洗液洗柱，用250mM和300mM浓度的咪唑洗脱液洗脱并收集洗脱液，即获得纯化的PMTV CP重组蛋白。

8)分别取20μL洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，重组蛋白的电泳结果如图2所示，成功纯化该重组蛋白。

9)PMTV CP重组蛋白透析：提前准备2L的0.01M PBS放入4℃冰箱预冷，将纯化的PMTV CP重组蛋白加入干净透析袋中并用夹子夹紧，放入已经预冷的PBS中透析24h，期间每隔2h换一次PBS，透析后进行SDS-PAGE电泳。

2.免疫动物

用纯化的PMTV CP蛋白免疫8周龄BALB/c雌性小鼠：PMTV CP蛋白50μg/只与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹腔加皮下注射，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，腹腔注射进行二免，过3周后用加倍剂量的抗原与生理盐水等体积混合进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行细胞融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)按9:1的比例在无血清的RPMI1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min后去除上清培养基，向含有细胞的离心管加入1mL 50％PEG(分子量1500)融合剂后放在37℃水浴中融合2min，用无血清的RPMI 1640培养基终止融合，1500rpm离心5min后吸去上清，沉淀用含HAT、胎牛血清、青链霉素的RPMI1640培养基悬浮，分装到96孔细胞板孔中，于37℃5％ CO

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及细胞克隆

细胞培养箱中培养6-7d后，用含HT、胎牛血清、青链霉素的培养基换液，等到融合细胞增殖至覆盖孔底15％以上时(大约在第12-13d)，以纯化的PMTV CP蛋白和/或感染PMTV的马铃薯病叶粗提液为包被抗原用间接ELISA方法筛选阳性孔，共获360个阳性孔。对360孔进行特异性分析，筛选出20个特异性好的细胞孔并进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分泌PMTV高度特异和灵敏单抗的杂交瘤细胞株4D2，即前述保藏号为CGMCC No.45330的杂交瘤细胞。经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体腹水制备及纯化

取12周龄左右BALB/c雄性小鼠，腹腔注射300μl降植烷，7-10d后腹腔注入约7×10

取1倍体积腹水加2倍体积生理盐水稀释，室温下边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液(pH 7.2)，搅拌10min后4℃静止过夜，12000rpm离心10min，倒掉上清，用2mL PBS悬浮沉淀，在4℃预冷的PBS中透析24h(每隔4h换一次PBS)后即获纯化的单抗IgG，-80℃冰箱保存。

6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG

7.单克隆抗体的特异性检测

用感染马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯M病毒(PVM)，马铃薯A病毒(PVA)、烟草花叶病毒(TMV)的病叶粗提液包被ELISA板，以马铃薯健康叶片粗提液为阴性对照，感染PMTV的马铃薯病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法分析单抗的特异性。ACP-ELISA方法的步骤：上述病毒感染的病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，5000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃4h；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-40min；加入1:5000倍稀释的单抗100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次后加入1:8 000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色20-30min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD

二、检测PMTV血清学方法的建立

1检测PMTV的ACP-ELISA检测方法

1.1ACP-ELISA方法的步骤：

1)将叶片用ELISA包被液按1:20比例(w/v,g/mL)研磨匀浆至无明显固体，5000rpm离心3min，上清以100μL/孔加入ELISA板，以感染PMTV的马铃薯叶片组织作为阳性对照，以健康马铃薯叶片组织作阴性对照，4℃包被过夜或37℃包被4h；

2)用PBST洗涤ELISA板3次，每次2min，之后每孔加入250μL含3％脱脂奶粉的PBS，37℃封闭30-40min；

3)倒掉上步ELISA板中封闭液，PBST洗涤3次，加入用封闭液适当稀释的单抗腹水100μL/孔，37℃孵育1h；

4)倒掉ELISA板中单抗稀释液，PBST洗涤3次，加入封闭液适当稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃反应1h；

5)PBST洗涤3次，继而PBS洗涤1次，每次3min。加PNPP底物于室温显色20-30min，肉眼观察底物颜色变成黄色的孔为阳性，或2mol/L氢氧化钠终止反应后用Bio-Rad 680酶标仪测OD

1.2检测PMTV ACP-ELISA方法的建立

采用方阵试验确定ACP-ELISA方法中抗体的最适工作浓度，即用1:20倍稀释的(w/v,g/mL)PMTV病叶粗提液作为抗原包被ELISA板；ELISA版横向每列分别加入1:1000-1:512000倍比稀释的PMTV单抗孵育1h，PBST洗涤后ELISA板纵向每行分别加入1:1000-1:512000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗孵育1h，健康马铃薯植物稀释粗提液作为阴性对照，每个处理设3次重复，确定ACP-ELISA中抗体的最适工作浓度。结果显示4D2单抗以1:8000倍稀释和AP标记的羊抗鼠IgG二抗以1:10000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测PMTV的ACP-ELISA方法。

1.3ACP-ELISA方法及PMTV单抗的特异性和灵敏度

以感染PMTV的马铃薯病叶和健康马铃薯叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA和TMV的病叶作为检测样品，加到ELISA板中，重复实验三次，分析PMTV单抗及建立的ACP-ELISA方法的特异性。在最适抗体工作浓度下，该方法检测感染PMTV的病叶均呈强阳性反应，而检测感染PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA、TMV病叶和健康马铃薯叶片粗提液呈阴性反应，且与阳性样品的OD值有极显著性差异，说明该单抗及其建立的ACP-ELISA方法能特异性地检测PMTV。

将感染PMTV的马铃薯病叶和健康马铃薯叶片分别用PBS缓冲液从1:10倍至1:81920倍(w/v,g/mL)倍比稀释的粗提液依次加到ELISA板，分析ACP-ELISA方法检测感染PMTV病叶的灵敏度，实验重复三次。结果表明，ACP-ELISA检测病叶的灵敏度达到1:10240倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。

2dot-ELISA检测方法的建立

2.1dot-ELISA方法的检测步骤

1)在研钵中研磨马铃薯植物组织，按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.01M PBS缓冲液匀浆，5000rpm离心3min，上清即为植物组织粗提液；

2)点样：取2μL粗提液点到硝酸纤维素(NC)膜上，同时设置健康和感染PMTV的马铃薯叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照，37℃恒温箱烘干10min；

3)NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(0.01M PBS含0.05％Tween-20)封闭液中室温封闭30min；然后，NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育1h；

5)洗膜：用PBST洗膜3次，每次3min；

6)NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育1h后PBST洗膜3次，每次3min，再用PBS洗膜1次；

7)配置显色液：66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中混匀。

8)用吸水纸把膜吸干后放入底物液中反应，静止室温显色15-20min。肉眼观察结果，当阳性对照明显现紫色斑点，而阴性对照无显色变化时，将膜置于自来水中漂洗终止反应，拍照并记录结果。

2.2检测PMTV dot-ELISA方法的建立

从1:1000倍开始分别进行倍比稀释PMTV单克隆抗体和AP标记的羊抗鼠IgG二抗，用方阵实验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。实验结果表明，单抗和酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释，以上述抗体的最适工作浓度建立检测植物中PMTV的dot-ELISA方法。

2.3dot-ELISA方法检测PMTV的特异性和灵敏度

以感染PMTV的马铃薯病叶和健康马铃薯叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，以感染感染PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA、TMV的病叶作为检测样品，进行dot-ELISA方法的特异性分析。该方法检测感染PMTV的病叶粗提液呈强阳性反应，而检测感染PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA、TMV的植物病叶粗提液以及健康马铃薯叶片粗提液均呈阴性反应(图3)，说明该方法和单抗的特异性优异。

取感染PMTV的病叶在研钵中研磨匀浆，用0.01M PBS从1:10至1:2560倍倍比稀释(w/v,g/mL)，同样对健康马铃薯叶片粗提液作相同处理。用dot-ELISA方法检测感染PMTV马铃薯病叶的灵敏度。灵敏度分析表明，当PMTV病叶粗提液稀释到1:1280倍(w/v,g/mL)时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:1280倍稀释(图4)。

3.建立的血清学方法的检测应用

用建立的ACP-ELISA、dot-ELISA方法对24个样品进行PMTV检测，发现其中有7个样品产生阳性反应(图5)。样品同时用RT-PCR方法进行分析，结果表明所有血清学方法检测阳性样品中均扩增到PMTV特异性的基因片段，而所有血清学检测阴性的样品中均未扩增到特异性基因片段(图5)，PCR产物核酸测序及序列比对分析表明，RT-PCR阳性样品确实感染PMTV，表明2种血清学方法的检测结果与RT-PCR完全一致。说明ACP-ELISA、dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物中PMTV的检测(图5)。

5.马铃薯帚顶病毒dot-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃

硝酸纤维素膜(NC)10张

脱脂奶粉30g

10X PBST 1瓶100mL

底物缓冲液1瓶100mL

2)检测植物样品的操作步骤：

a.马铃薯植物组织称重后研磨，按1:20-50比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后匀浆；

b.匀浆液5000rpm离心3min；

c.取2μL上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染PMTV的植物组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥5-10min；

d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST封闭液中室温30min；

e.NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育1h；

f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育1h；

g.PBST洗膜4次，每次3min；

h.66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液中混匀,将膜放入其中显色15-20min，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时，自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期：

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)0.01M磷酸盐缓冲液(PBS pH7.4)配方：

加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1000mL。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。