用于治疗神经系统疾病的补体组分4抑制剂以及使用它们的相关组合物、系统和方法

相关专利申请的交叉引用

本申请与2020年5月11日提交的题为“Complement Component C1R InhibitorsFor Treating A Neurological Disease,And Related Compositions,Systems AndMethods Of Using Same”的美国临时申请和2020年5月11日提交的题为“ComplementComponent C1S Inhibitors For Treating A Neurological Disease,And RelatedCompositions,Systems And Methods Of Using Same”的美国临时申请有关，其内容均以引用方式整体并入本文。本申请要求2020年5月11日提交的题为“Complement ComponentC4 Inhibitors For Treating A Neurological Disease,And Related Compositions,Systems And Methods Of Using Same”的美国临时申请号63/023103的优先权，其内容以引用方式整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且因此以引用方式整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年5月6日，命名为P36089-WO_C4_SequenceList_ST25.txt，并且大小为218,918个字节。

技术领域

本发明涉及在神经系统疾病的治疗中使用的补体组分4(C4)抑制剂。本发明特别地涉及C4抑制剂用于C4表达的下调的用途。本发明还涉及与C4A和/或C4B互补并能够降低C4A和/或C4B mRNA的水平的核酸分子。本发明还包括一种药物组合物及其在神经系统疾病的治疗中的用途。

背景技术

补体系统是先天免疫系统的一部分，可增强吞噬细胞清除微生物或受损细胞并促进炎症。补体系统还参与大脑中的突触修剪，补体系统的经典途径介导突触去除。该过程涉及通过补体组分1(C1)复合物(由C1Q、C1S和C1R组成)启动经典途径，导致补体组分2(C2)和补体组分4(C4)的切割，进而导致补体组分3(C3)的切割，随后小胶质细胞吞噬突触。除了在早期发育过程中对正常脑回路细化的作用之外，众所周知，经典补体途径的异常活性可以介导各种神经系统疾病中的突触丢失和神经退行性变。对患者样品中升高的补体水平以及在小鼠模型中减少或消除补体组分的有益作用的观察已确定了补体在包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿病、帕金森病、病毒引起的认知障碍、青光眼、黄斑变性、重症肌无力、格林-巴利综合征、视神经脊髓炎、中枢神经系统红斑狼疮和精神分裂症在内的病症中的损害作用。

本领域仍然需要治疗和预后剂来解决这些病症。本发明满足了这些和其他需要。

发明目的

本发明提供了补体组分4(C4)的核酸抑制剂，其可以在体内和体外两种情况下用于C4表达的下调以及用于神经系统疾病的预防和治疗干预。本发明进一步鉴定了能够在体外和体内抑制C4的表达的新核酸分子，诸如反义寡核苷酸。

发明内容

本发明涉及靶向核酸并且能够调节C4的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于例如治疗或预防与C4功能有关的疾病。

因此，在第一方面，本发明提供了在神经系统疾病诸如Tau蛋白病或精神分裂症的治疗和/或预防中使用的C4抑制剂，特别地，C4抑制剂能够减少C4，例如C4 mRNA和/或C4蛋白的量。此类抑制剂有利地为长度为12个至60个核苷酸的核酸分子，该核酸分子能够降低C4 mRNA水平。在一些实施例中，C4为C4A和/或C4B。

在另一方面，本发明涉及12个至60个核苷酸(诸如12个至30个核苷酸)的核酸分子，该核酸分子包含与哺乳动物C4(例如人C4A和/或C4B、小鼠C4b和/或C4a或食蟹猴C4)至少90％互补(诸如90％至95％、95％至98％互补，或完全互补)的至少10个核苷酸(特别是16个至20个核苷酸)的连续核苷酸序列。此类核酸分子能够在表达C4A和/或C4B的细胞中抑制C4A和/或C4B的表达。C4A和/或C4B表达的抑制允许减少细胞中存在的C4A和/或C4B蛋白的量。核酸分子可以选自单链反义寡核苷酸、双链siRNA分子或shRNA核酸分子(特别是通过化学方法产生的shRNA分子)。

本发明的另一方面涉及抑制C4A和/或C4B的表达和/或活性的单链反义寡核苷酸或siRNA。特别地，减少C4A和/或C4B mRNA的包含一个或多个2'糖修饰的核苷和一个或多个硫代磷酸酯键合的修饰的反义寡核苷酸或修饰的siRNA为有利的。

在另一方面，本发明提供药物组合物，该药物组合物包含本发明的C4抑制剂，诸如本发明的反义寡核苷酸或siRNA以及药学上可接受的赋形剂。

在一些实施例中，C4抑制剂选自由C4A抑制剂、C4B抑制剂和泛C4抑制剂组成的组。

在另一方面，本发明提供了用于调节表达C4A和/或C4B的靶细胞中的C4A和/或C4B表达的体内或体外方法，该方法通过以有效量向所述细胞施用本发明的C4抑制剂(诸如本发明的反义寡核苷酸或组合物)来实施。在一些实施例中，与未经任何处理或用对照处理的水平相比，靶细胞中的C4A和/或C4B表达降低至少50％，例如50％至60％；或至少60％，例如60％至70％；或至少70％，例如70％至80％；或至少80％，例如80％至90％；或至少90％，例如90％至95％。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防与C4的体内活性相关联的疾病、疾患或功能障碍的方法，该方法包括向患有或易患该疾病、疾患或功能障碍的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的C4抑制剂(诸如本发明的反义寡核苷酸或siRNA)。

在一些实施例中，C4抑制剂选自由C4A抑制剂、C4B抑制剂和泛C4抑制剂组成的组。

定义

化合物

在本文中，关于本发明的化合物，术语“化合物”是指能够抑制C4表达或活性的任何分子。本发明的特别化合物是核酸分子，诸如根据本发明的RNAi分子或反义寡核苷酸或包含这种核酸分子的任何缀合物。例如，本文中化合物可以是靶向C4A和/或C4B的核酸分子，特别是反义寡核苷酸或siRNA。在一些实施例中，该化合物在本文中也称为“抑制剂”或“C4抑制剂”。在一些实施例中，C4抑制剂选自由C4A抑制剂、C4B抑制剂和泛C4抑制剂组成的组。如本文所用，术语“C4A抑制剂”是指能够特异性抑制C4A的表达或活性的分子。如本文所用，术语“C4B抑制剂”是指能够特异性抑制C4B的表达或活性的分子。如本文所用，术语“泛C4抑制剂”是指能够抑制C4A和C4B两者的表达或活性的分子。

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为诸如包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。寡核苷酸在本文中也称为“核酸”或“核酸分子”。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。说明书和权利要求书中提及的寡核苷酸通常是长度小于70个核苷酸的治疗性寡核苷酸。寡核苷酸可以是或者可以包含单链反义寡核苷酸，或者可以是另一种核酸分子，诸如CRISPR RNA、siRNA、shRNA、适体或核酶。治疗性寡核苷酸分子通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化和分离来制备。shRNA通常使用慢病毒载体传递至细胞中，然后从慢病毒载体中转录以产生单链RNA，该单链RNA将形成茎环(发夹)RNA结构，该结构能够与RNA干扰机制(包括RNA诱导沉默复合物(RISC))交互作用。在本发明的实施例中，shRNA是通过化学方法产生的shRNA分子(不依赖于来自质粒或病毒的基于细胞的表达)。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。通常，本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。尽管在一些实施例中，本发明的寡核苷酸是在进入靶细胞时从载体转录的shRNA。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸。

在一些实施例中，本发明的术语寡核苷酸还包括药学上可接受的盐、酯、溶剂化物和前药。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包含或由长度为10个至70个核苷酸组成，诸如长度为12个至60个、诸如13个至50个、诸如14个至40个、诸如15个至30个、诸如16个至25个、诸如16个至22个、诸如16个至20个连续核苷酸。因此，在一些实施例中，本发明的寡核苷酸长度可为12个至25个核苷酸。替代地，在一些实施例中，本发明的寡核苷酸长度可为15个至21个核苷酸。

在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含24个或更少的核苷酸，诸如22个，诸如20个或更少的核苷酸，诸如14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸或由其组成。应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。因此，如果说核酸分子包含15至20个核苷酸，则15和20个核苷酸长度均包含在内。

在一些实施例中，连续核苷酸序列在长度上包含12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个连续核苷酸或由其组成。

寡核苷酸可以调节哺乳动物或哺乳动物细胞中靶核酸的表达。在一些实施例中，核酸分子(诸如siRNA、shRNA和反义寡核苷酸)抑制靶核酸的表达。

在本发明的一个实施例中，寡核苷酸选自RNAi剂，诸如siRNA或shRNA。在另一个实施例中，寡核苷酸是单链反义寡核苷酸，诸如与RNA酶H交互作用的高亲和力修饰的反义寡核苷酸。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。

在一些实施例中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键。

寡核苷酸文库应理解为不同寡核苷酸的集合。寡核苷酸文库的目的可以变化。在一些实施例中，寡核苷酸文库由具有重叠核碱基序列的寡核苷酸组成，该序列靶向一个或多个哺乳动物C4A和/或C4B靶核酸，设计目的是识别寡核苷酸文库中的有效序列，例如最有效的序列。在一些实施例中，寡核苷酸文库是亲代或祖代寡核苷酸的寡核苷酸设计变体(子核酸分子)文库，其中寡核苷酸设计变体保留了亲代核酸分子的核心核碱基序列，例如亲代的保守序列。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”或“ASO”定义为能够与靶核酸(特别是靶核酸上的连续序列)杂交的寡核苷酸，例如以调节相应靶基因的表达。通常，本发明的核酸分子为反义核酸。反义寡核苷酸基本上不为双链的，并且不需要为siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应理解的是，本发明的单链寡核苷酸可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，例如，其中在寡核苷酸的整个长度上，序列内或序列间自身互补的程度低于50％。

有利地，在一些实施例中，本发明的单链反义寡核苷酸不包含RNA核苷，因为这将降低核酸酶抗性。

有利地，在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。此外，有利的是，一些、大部分或所有未修饰的核苷是DNA核苷，例如50％、75％、95％或100％的未修饰核苷是DNA核苷。

RNAi分子

在本文中，术语“RNA干扰(RNA interference,RNAi)分子”是指含有RNA核苷的短双链寡核苷酸，该短双链寡核苷酸经由例如RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex,RISC)介导RNA转录物的靶向切割，其中它们与催化性RISC组分argonaute交互作用。RNAi分子调节(例如，抑制)靶核酸在细胞(例如受试者，诸如哺乳动物受试者体内的细胞)中的表达。RNAi分子包括单链RNAi分子(Lima等人2012Cell150:883)和双链分子(例如siRNA)或部分双链的分子，以及短发夹RNA(shRNA)。在本发明的一些实施例中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列是RNAi剂，诸如siRNA。

siRNA

术语“小干扰核糖核酸”或“siRNA”是指通常干扰mRNA的表达的小干扰核糖核酸RNAi分子。该术语是指一类双链RNA分子，在本领域中也称为短干扰RNA或沉默RNA。siRNA通常包含正义链(也称为过客链)和反义链(也称为引导链)，其中一条或两条链的长度为17至30个核苷酸，通常长度为19至25个核苷，其中反义链与靶核酸(合适地成熟mRNA序列)互补，诸如至少90％，例如90％至95％互补，或诸如完全互补，并且正义链与反义链互补，使得正义链和反义链形成双链体或双链体区域。siRNA链可以形成平末端双链体，或者有利地，正义链和/或反义链3'端可以形成例如1、2或3个核苷的3'突出端(例如，类似于通过Dicer产生的产物，其在体内形成RISC底物。Dicer底物的有效扩展形式已在US 8,349,809和US 8,513,207中进行了描述，在此通过引用并入。在一些实施方案中，正义链和反义链均具有2nt3'突出端。因此，双链体区域的长度可以为例如17至25个核苷酸，诸如长度为21至23个核苷酸。

一旦进入细胞内，反义链可以被掺入到RISC复合物中，该RISC复合物介导靶核酸的靶降解或靶抑制。siRNA除了RNA核苷外，通常还包含修饰的核苷。在一个实施例中，siRNA分子可以使用修饰的核苷酸间键和2'糖修饰的核苷进行化学修饰，诸如2'-4'双环核糖修饰的核苷(包括LNA和cET)或2'取代的修饰，如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA，2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA。特别地，可以将2'氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基掺入siRNA。

在一些实施例中，可以用2'糖修饰的核苷(诸如LNA)修饰siRNA正义(过客)链的一些、大部分或所有(例如，75％至90％、80％至95％、90％至99％或100％)核苷酸(例如，参见WO2004/083430和WO2007/085485)。在一些实施例中，siRNA的过客链可以是不连续的(例如，参见WO2007/107162)。在一些实施例中，siRNA的反义链的种子区域中的热去稳定核苷酸可用于减少siRNA的脱靶活性(例如，参见WO2018/098328)。在一些实施例中，siRNA在反义链的5'端包含5'磷酸酯基团或5'-磷酸酯模拟物。在一些实施例中，反义链的5'端是RNA核苷。

在一个实施例中，siRNA分子进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷间键合可以在一条或两条链(例如，反义链和/或正义链)的3'-末端上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷间键合可以在一条或两条链(例如，反义链和/或正义链)的5'末端上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷间键合可以在一条或两条链(例如反义链和/或正义链)的5'-末端和3'-末端二者上。在一些实施例中，剩余的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，siRNA分子包含一个或多个硫代磷酸酯核苷间键合。在siRNA分子中，硫代磷酸酯核苷间键合可以减少或抑制RICS中的核酸酶切割。因此，在一些实施例中，并非反义链中的所有核苷间键合都被修饰，例如，在一些实施例中，反义链中10％至90％、20％至80％、30％至70％或40％至60％的核苷间键合被修饰。

siRNA分子可以进一步包含配体。在一些实施例中，配体缀合至正义链的3'端。

对于生物学分布，可将siRNA缀合至靶向配体和/或配制成脂质纳米颗粒。在特定实例中，核酸分子缀合至靶向脑细胞或CNS的其他细胞的部分。因此，核酸分子可以缀合至促进跨血脑屏障递送的部分。例如，核酸分子可以缀合至靶向转铁蛋白受体的抗体或抗体片段。

本发明的其他方面涉及药物组合物，特别是包含适合用于治疗用途的dsRNA(诸如siRNA分子)的药物组合物，以及通过施用dsRNA分子(诸如本发明的siRNA)来抑制靶基因表达的方法，例如用于治疗如本文所公开的各种疾病。

shRNA

术语“短发夹RNA”或“shRNA”是指这样的分子，所述分子的长度通常介于40个与70个核苷酸之间，诸如长度介于45个与65个核苷酸之间，诸如长度介于50个与60个核苷酸之间，并形成茎环(发夹)RNA结构，该结构可与称为Dicer的核酸内切酶交互作用(据信将dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3'突出端的19-23个碱基对的短干扰RNA，然后可将其掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中)。与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一个或多个核酸内切酶切割靶以诱导沉默，shRNA寡核苷酸可以使用修饰的核苷酸间键和2'糖修饰的核苷进行化学修饰，诸如2'-4'双环核糖修饰的核苷(包括LNA和cET)或2'取代的修饰，如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA，2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA。在一些实施例中，shRNA分子包含一个或多个硫代磷酸酯核苷间键合。在RNAi分子中，硫代磷酸酯核苷间键合可以减少或抑制RICS中的核酸酶切割。因此，并非shRNA分子的茎环中的所有核苷间键合都被修饰，例如在一些实施例中，反义链中10％至90％、20％至80％、30％至70％或40％至60％的核苷间键合被修饰。硫代磷酸酯核苷间键合可以有利地位于shRNA分子茎环的3'和/或5'端，特别是在分子的与靶核酸不互补的部分。然而，shRNA分子的与靶核酸互补的区域也可以在预计通过Dicer切割后会成为3'和/或5'末端部分的例如前2个至3个核苷间键合中被修饰。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”是指核酸分子的与靶核酸互补的区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，连续核苷酸序列包括在siRNA分子的前导链中。在一些实施例中，连续核苷酸序列是shRNA分子的部分，其与靶核酸95％、98％、99％、或100％互补。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F'gapmer区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团(例如用于靶向的缀合物基团)连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸的核碱基序列是连续核苷酸序列。在一些实施例中，连续核苷酸序列与靶核酸100％互补。

核苷酸和核苷

核苷酸和核苷是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。有利地，在一些实施例中，修饰的核苷中的一个或多个修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(Watson Crick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。

修饰的核苷间键合

如技术人员通常所理解的，术语“经修饰的核苷间键合”定义为例如为除磷酸二酯(PO)键合以外的键合，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键，或一个或多个二硫代磷酸酯核苷间键。

对于本发明的寡核苷酸，有利的是使用硫代磷酸酯核苷间键合，例如对于10％至90％、20％至80％、30％至70％或40％至60％的核苷间键合。

硫代磷酸酯核苷间键合由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键合是硫代磷酸酯，诸如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少60％，例如60％至80％；诸如至少70％，例如70％至85％；诸如至少75％，例如75％至90％；诸如至少80％，例如80％至95％；或诸如至少90％，例如90％至99％的核苷间键合是硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。

在一些有利实施例中，寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键均为硫代磷酸酯，或寡核苷酸的所有核苷间键均为硫代磷酸酯键。

在一些实施例中，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键合(除磷酸二酯和硫代磷酸酯外)，例如膦酸烷基酯/膦酸甲酯核苷间键合，其可在另外的DNA硫代磷酸酯间隙区域中被耐受(例如，如在EP 2742135中)。

核碱基

术语“核碱基”包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，它们在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊371.4.1中。

在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA gapmer，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

修饰的寡核苷酸

术语“修饰的寡核苷酸”描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键合和/或修饰的核碱基。术语“嵌合寡核苷酸”是已经在文献中用于描述包含修饰的核苷和DNA核苷的寡核苷酸的术语。本发明的反义寡核苷酸优选地是嵌合寡核苷酸。

互补性

术语“互补性”或“互补”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊371.4.1)。

如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸的比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5'-3’和3'-5’的寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和删除。应当理解，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5'-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

术语“完全互补”是指100％互补性。

同一性

如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数×100)/比对区域的长度(例如，连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

杂交

如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为是指两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常用解链温度(Tm)来描述，解链温度(Tm)定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm与亲和力并非严格成正比(Mergny和Lacroix,2003,Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(Kd)通过ΔG°＝-RTln(Kd)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间的强杂交。ΔG°为与反应相关的能量，其中水性浓度为1M，pH为7并且温度为37℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交为自发反应，并且对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验测量，例如，通过利用如Hansen等人,1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等人，2005,Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。本领域的技术人员将知道商业设备可用于ΔG°测量。ΔG°也可以通过使用如SantaLucia,1998,Proc NatlAcad Sci USA.95:1460–1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人，2004,Biochemistry43:5388–5405描述的推导的热力学参数进行估计。为了具有通过杂交调节核酸靶标的可能性，对于长度为10个至30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸与靶核酸以低于-10kcal/mol的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态Gibbs自由能ΔG°测量。对于长度为8个至30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可以与靶核酸以低于-10kcal/mol，诸如低于-15kcal/mol、诸如低于-20kcal/mol以及诸如低于-25kcal/mol的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸与靶核酸以-10至-60kcal/mol，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal/mol或-16至-27kcal/mol、诸如-18至-25kcal/mol的范围的估计ΔG°值杂交。

靶核酸

根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物C4A或哺乳动物C4B的核酸，并且可以例如是基因、RNA、mRNA和前体mRNA、成熟的mRNA或cDNA序列。该靶标因此可以称为C4A靶核酸或C4B靶核酸。

本发明的治疗性寡核苷酸可以例如靶向哺乳动物C4A和/或C4B的外显子区域(特别是siRNA和shRNA，但也可以是反义寡核苷酸)，或者可以例如靶向C4A和/或C4B前体mRNA中的任何内含子区域(特别是反义寡核苷酸)。

表1a和1b列出了SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4(即，人C4A和C4B前体mRNA序列)的预测外显子区域和内含子区域。

表1a.人C4A前体mRNA中的外显子内含子。

表1b.人C4B前体mRNA中的外显子和内含子。

在一些实施例中，靶核酸编码C4A蛋白，特别是哺乳动物C4A蛋白，诸如人C4A蛋白。在一些实施例中，靶核酸编码C4B蛋白，特别是哺乳动物C4B蛋白，诸如人C4B蛋白。参见例如表2和表3，该表提供了关于人、食蟹猴和小鼠C4的基因组序列(表2)以及关于人、食蟹猴和小鼠C4的前体mRNA序列和关于人C4的成熟的mRNA(表3)的概述。

在一些实施例中，靶核酸选自由以下项组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7或其天然存在的变体(例如，编码哺乳动物C4A和/或C4B的序列)。

表2.多个物种的C4A和C4B的基因组和组装信息。

Fwd＝正向链。Rev＝反相链。基因组坐标提供了前体mRNA序列(基因组序列)。

如果在研究或诊断中采用本发明的核酸分子，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

对于体内或体外应用，本发明的治疗性核酸分子通常能够在表达C4A和C4B靶核酸的细胞中抑制C4A和/或C4B靶核酸的表达。本发明的核酸分子的核碱基的连续序列通常与C4A和/或C4B靶核酸的保守区互补，如在核酸分子的整个长度上测量的，任选地除了一个或两个不匹配之外。在一些实施例中，靶核酸是信使RNA，诸如编码哺乳动物C4A蛋白的前体mRNA，诸如小鼠C4a，例如小鼠C4a前体mRNA序列，诸如作为SEQ ID NO：2公开的序列，人C4A前体mRNA序列，诸如作为SEQ ID NO：3公开的序列，或食蟹猴C4前体mRNA序列，诸如作为SEQID NO：5公开的序列，或成熟C4A mRNA，诸如作为SEQ ID NO:6公开的人成熟mRNA的序列。在一些实施例中，靶核酸是信使RNA，诸如编码哺乳动物C4B蛋白的前体mRNA，诸如小鼠C4b，例如小鼠C4b前体mRNA序列，诸如作为SEQ ID NO：1公开的序列，人C4B前体mRNA序列，诸如作为SEQ ID NO：4公开的序列，或食蟹猴C4前体mRNA序列，诸如作为SEQ ID NO：5公开的序列，或成熟C4B mRNA，诸如作为SEQ IDNO:7公开的人成熟mRNA的序列。SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7是DNA序列-应当理解，靶RNA序列具有代替胸苷碱基(T)的尿嘧啶(U)碱基。

已知存在上述序列的不同的(即更短的)带注释的mRNA同工型。同工型在本领域中是众所周知的并且可以源自已知的序列数据库。

表3提供了有关示例性靶核酸的其他信息。

表3.关于靶核酸的概述。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:1。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:2。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:3。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:4。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:5。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:6。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:7。

靶标

如本文所用，术语“靶标”是指补体组分4(C4)，在本公开的上下文中，其可以是C4A和/或C4B。此外，术语“靶标”可以指C4A靶核酸和/或C4B靶核酸，以及C4A蛋白和/或C4B蛋白。例如，本文所述的反义寡核苷酸的一部分靶向C4A靶核酸和C4B靶核酸二者，即此类反义寡核苷酸通过结合C4A/C4B同源区靶向C4A靶核酸和和C4B靶核酸二者(泛-C4反义寡核苷酸)。如本领域已知的，术语“C4A”和“C4B”(大写A/B)涉及人靶标。术语“C4a”和“C4b”(小写a/b)与涉及小鼠靶标。

靶序列

本文所用的术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸或核酸分子互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列包含靶核酸上具有与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域或由其组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，靶序列比本发明的核酸分子的互补序列更长，并且可以例如代表靶核酸的可以被本发明的若干核酸分子所靶向的优选区域。本领域众所周知，C4A和C4B基因在个体之间表现出高的变异性水平。术语“靶序列”包括所有C4A和C4B的公开注释的变体。

在一些实施例中，靶序列是选自由以下项组成的组的序列：人C4AmRNA外显子，诸如选自由Ea1-Ea41(参见例如上表1a)组成的组的人C4A mRNA外显子。在一些实施例中，靶序列是选自由以下项组成的组的序列：人C4B mRNA外显子，诸如选自由Eb1-Eb41(参见例如上表1b)组成的组的人C4B mRNA外显子。

因此，本发明提供了寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的外显子区域至少90％互补(诸如90％至95％互补或完全互补)的连续序列，所述外显子区域选自由Ea1-Ea41和Eb1-Eb41(参见表1a和1b)组成的组。

在一些实施例中，靶序列是选自由以下项组成的组的序列：人C4AmRNA内含子，诸如选自由Ia1-Ia40(参见例如上文表1a)组成的组的人C4A mRNA内含子。在一些实施例中，靶序列是选自由以下项组成的组的序列：人C4B mRNA外显子，诸如选自由Ib1-Ib40(参见例如上文表1b)组成的组的人C4B mRNA内含子。

因此，本发明提供了寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的内含子区域至少90％互补(诸如90％至95％互补或完全互补)的连续序列，所述内含子区域选自由Ia1-Ia40和Ib1-Ib40(参见表1a和1b)组成的组。

在一些实施例中，靶序列选自由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7组成的组。在一些实施例中，如本文所指的连续核苷酸序列与选自由SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7组成的组的靶序列至少90％(例如90％至95％)互补，诸如至少95％(例如95％至98％)互补。在一些实施例中，该连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7组成的组的靶序列完全互补。

本发明的寡核苷酸包含与靶核酸上的区域(诸如本文所述的靶序列)互补或杂交的连续核苷酸序列。

与寡核苷酸互补或杂交的靶核酸序列通常包含一段至少10个核苷酸的连续核碱基。该连续核苷酸序列的长度介于12个至70个核苷酸，诸如12个至50个、诸如13个至30个、诸如14个至25个、诸如15个至21个连续核苷酸之间。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸靶向表4a和4b中所示的区域。

表4a：SEQ ID NO：3上的示例性靶区域

表4b：SEQ ID NO：4上的示例性靶区域

靶细胞

如本文所用，术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。对于本发明的治疗用途，如果靶细胞是脑细胞则是有利的。在一些实施例中，脑细胞选自由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成的组。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞或土拨鼠细胞，或者灵长类细胞，诸如猴细胞(例如食蟹猴细胞)或人类细胞。

在一些实施方案中，靶细胞表达C4A mRNA，如C4A前体mRNA或C4A成熟mRNA。在一些实施方案中，靶细胞表达C4B mRNA，如C4B前体mRNA或C4B成熟mRNA。对于反义寡核苷酸靶向作用，通常不考虑C4A mRNA或C4B mRNA的聚腺苷(poly A)尾部。

天然存在的变体

术语“天然存在的变体(naturally occurring variant)”是指与靶核酸源自相同基因座但可有差异的C4A和/或C4B基因或转录物的变体，所述差异可例如是出于遗传密码的简并性造成多重密码子编码同一个氨基酸，或因前体mRNA的可变剪接，或多态性的存在，如单核苷酸多态性(SNP)，以及等位基因变体。基于寡核苷酸的足够互补序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。

在一些实施例中，天然存在的变体与哺乳动物C4A靶核酸具有至少95％(例如95％至98％)，诸如至少98％(例如99％至99％)或至少99％(例如99％至100％)的同源性，该靶核酸为诸如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:5的靶核酸。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO:3的人C4A靶核酸具有至少99％(例如99％至100％)的同源性。在一些实施例中，天然存在的变体与哺乳动物C4B靶核酸具有至少95％(例如95％至98％)，诸如至少98％(例如98％至99％)或至少99％(例如99％至100％)的同源性，该靶核酸为诸如SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的靶核酸。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO:4的人C4B靶核酸具有至少99％(例如99％至100％)的同源性。在一些实施例中，天然存在的变体是已知的多态性。

表达的抑制

如本文所用，术语“表达的抑制”应理解为，C4抑制剂抑制靶细胞中C4的数量或活性的能力的总称。表达或活性的抑制可以通过测量C4前体mRNA或C4 mRNA的水平，或通过测量细胞中C4蛋白的水平或活性来进行确定。可以体外或体内地确定表达的抑制。通过参考对照来确定抑制。通常理解，对照是用盐水组合物处理的个体或靶细胞。在一些实施例中，C4为C4A和/或C4B。

术语“抑制剂”、“抑制(“inhibition”或“inhibit”)”也可以是指下调、减少、压制、减轻、降低或减弱C4的量、表达和/或活性。

C4A和/或C4B的表达的抑制可以例如通过例如使用募集RNA酶H的寡核苷酸(诸如gapmer)或经由RNA干扰途径发挥作用的核酸分子(诸如siRNA或shRNA)来降解前体mRNA或mRNA而发生。替代地，本发明的抑制剂可以与C4A和/或C4B mRNA或多肽结合并且抑制C4A和/或C4B的活性或防止其与其他分子结合。

在一些实施例中，C4A和/或C4B靶核酸表达的抑制导致靶细胞中C4A和/或C4B蛋白的量减少。优选地，与对照相比，C4A和/或C4B蛋白的量减少。在一些实施例中，与对照相比，C4A和/或C4B蛋白的量减少至少20％，至少30％。在一些实施例中，与对照相比，靶细胞中C4A和/或C4B蛋白的量减少至少50％，例如50％至60％，或至少60％，例如60％至70％，或至少70％，例如70％至80％，至少80％，例如80％至90％，或至少90％，例如90％至95％。

糖修饰

本发明的寡核苷酸可以包含一种或多种具有修饰的糖部分的核苷，所述修饰的糖部分即与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时糖部分的修饰。

已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

此类修饰包括其中核糖环结构如下被修饰的那些：例如通过用己糖环(HNA)或通常在核糖环上的C2和C4碳之间具有双基桥的双环(LNA)或通常在C2和C3碳之间缺乏键的未连接的核糖环(例如UNA)替换。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的一个或多个取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2'-OH基团所做出的修饰。例如，可在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。

高亲和力修饰的核苷

“高亲和力修饰的核苷”是一种经修饰的核苷，当并入所述寡核苷酸中时，可增强所述寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一个修饰的核苷的解链温度增加+0.5℃至+12℃的范围，更优选地+1.5℃至+10℃的范围并且最优选地+3℃至+8℃的范围。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2'取代的核苷以及锁定的核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment,2000,3(2),293-213)。

2'糖修饰的核苷

2'糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2'糖取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷掺入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷的实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012,19,937。下面为一些2’取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2'取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2'桥连的核苷。

锁定的核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”为2’-修饰的核苷，其包含联接所述核苷的核糖糖环的C2’和C4’的双基(也称为“2’-4’桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交亲和力的增强(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,Seth etal.J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka et al.,Nucleic AcidsResearch 2009,37(4),1225-1238以及Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667中。

本发明的LNA核苷的特定实例在方案1中给出(其中B如上所定义)。

方案1：

用在本发明分子中的特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。

RNA酶H活性和募集

反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H的能力。WO01/23613例如提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNA酶H的能力。如果在向寡核苷酸提供互补靶核酸序列时具有以下初始速率(以pmol/l/min计)，则一般认为其能够募集RNA酶H，该初始速率是使用WO 01/23613(通过引用在此并入)的实例91至95提供的方法学，使用具有与所测试的经修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但在寡核苷酸中的所有单体之间仅包含具有硫代磷酸酯键合的DNA单体的寡核苷酸确定的初始速率的至少5％，诸如至少10％至15％，或超过20％，例如20％至25％，或20％至30％。为了用于确定RNA酶H活性，可从Creative

Gapmer

本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是gapmer，也称为gapmer寡核苷酸或gapmer设计。反义gapmer一般用于通过RNA酶H介导的降解来抑制靶核酸。gapmer寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，分别为“5->3”方向的5'侧翼、缺口和3'侧翼F-G-F'。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集RNA酶H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5'侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3'侧翼区域(F')。区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施方案中，区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2'糖修饰，诸如独立地选自LNA和2'-MOE。

在gapmer设计中，缺口区域的5'和3'最末端核苷是DNA核苷，分别位于5'(F)和/或3'(F')区域的糖修饰的核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的端，即在5'侧翼的5'端和3'侧翼的3'端，具有至少一个糖修饰的核苷。

区域F-G-F'形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F'的gapmer区域。

gapmer设计F-G-F'的总长度可以为例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如15至21个核苷。

举例而言，本发明的gapmer寡核苷酸可由下式代表：

F

F

前提条件是gapmer区域F-G-F'的总长度为至少12个(例如12个至15个核苷酸)，诸如至少14个核苷酸(例如14个至20个核苷酸)。

在本发明的一个方面，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式5'-F-G-F'-3'的gapmer组成或包含式5'-F-G-F'-3'的gapmer，其中区域F和F'独立地包含1个至8个核苷或由其组成，其中1个至4个核苷经2'糖修饰且限定F和F'区域的5'和3'端，并且G为介于6个与16个核苷之间的能够募集RNA酶H的区域。

在本发明的一个方面，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式5'-F-G-F'-3'的gapmer组成或包含式5'-F-G-F'-3'的gapmer，其中区域F和F'独立地包含1个至8个核苷或由其组成，其中1个至4个核苷经2'糖修饰且限定F和F'区域的5'和3'端，并且G为介于6个与18个核苷之间的能够募集RNA酶H的区域。在一些实施例中，G区域由DNA核苷组成。

在一些实施例中，区域F和F'独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含糖修饰的核苷的连续序列。在一些实施方案中，区域F的糖修饰的核苷可独立地选自2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元。

在一些实施例中，区域F和F'独立地包含LNA和2'-取代的糖修饰的核苷酸两者(混合型翼设计)。在一些实施例中，2'-取代的糖修饰的核苷酸独立地选自由以下项组成的组：2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元。

在一些实施例中，区域F和F'的所有修饰的核苷均为LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区域F或F'或者F和F'可以任选地包含DNA核苷。在一些实施例中，区域F和F'的所有修饰的核苷均为β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F'或者F和F'可以任选地包含DNA核苷。在这样的实施例中，侧翼区域F或F'，或F和F'两者都包含至少三个核苷，其中F和/或F'区域的5'和3'最末端核苷是LNA核苷。

LNA Gapmer

“LNA gapmer”是其中区域F和F'中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的gapmer。β-D-氧基gapmer是其中区域F和F'中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的gapmer。

在一些实施例中，LNA gapmer具有下式：[LNA]

MOE Gapmer

“MOE gapmer”是其中区域F和F'由MOE(甲氧基乙基)核苷组成的gapmer。在一些实施例中，MOE gapmer的设计为[MOE]

寡核苷酸中的区域D'或D"

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以包含以下项或由其组成：与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列，诸如gapmer区域F-G-F'，并且可以进一步包含5'和/或3'核苷。所述其他的5'和/或3'核苷可与或不与所述靶核酸为完全互补。此类其他的5'和/或3'核苷本文中可称为区域D'和D”。

出于将连续核苷酸序列(诸如gapmer)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D'或D”。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。另选地，其可用于提供核酸外切酶保护或促进合成或制造。

可以将区域D'和D”分别连接到区域F的5'端或区域F'的3'端，以生成下式：D'-F-G-F'、F-G-F'-D”或D'-F-G-F'-D”。在这种情况下，F-G-F'是寡核苷酸的gapmer部分，而区域D'或D”构成寡核苷酸的单独部分。

区域D'或D”可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。在一些实施例中，与F或F'区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D'或D”区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5'和/或3'端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是DNA或RNA。例如WO2014/076195中公开了适合用作区域D'或D”的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。例如WO2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中可生物裂解的接头的用途，其中它们被用于在单个寡核苷酸内连接多个反义构建体(例如gapmer区域)。

在一个实施例中，本发明的寡核苷酸除构成gapmer的连续核苷酸序列外还包含区域D'和/或D”。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以由下式中的一个或多个表示：

F-G-F’；特别是F

D'-F-G-F'，特别是D'

F-G-F'-D”，特别是F

D'-F-G-F'-D”，特别是D'

在一些实施方案中，区域D'与区域F之间的核苷间键合是磷酸二酯键合。在一些实施方案中，区域F'与区域D”之间的核苷间键合是磷酸二酯键合。

治疗

本文所用的术语“治疗”是指既存疾病(例如本文所指的疾病或病症)的治疗或疾病的阻止(即预防)。预防还包括延迟或降低疾病发生的可能性，延迟或降低疾病复发的频率，和/或如果受试者最终患该疾病，则降低疾病的严重性或持续时间。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。在一些实施例中，对已被诊断患有补体介导的神经系统疾病的患者进行治疗，诸如选自由以下项组成的组的神经系统疾病：阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿病、帕金森病、病毒引起的认知障碍、青光眼、黄斑变性、重症肌无力、格林-巴利综合征、视神经脊髓炎、中枢神经系统红斑狼疮和精神分裂症。在一些实施例中，本发明的化合物用在Tau蛋白病，诸如阿尔茨海默病的治疗中。在一些实施例中，本发明的化合物用在精神分裂症的治疗中。

患者

为了本发明的目的，“受试者”(或“患者”)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的手段和方法适用于人类治疗和兽医应用。优选地，受试者是哺乳动物。更优选地，受试者是人。

如本文别处所述，待治疗的患者可能患有或易患神经系统疾病或神经退行性病症。“易患”疾病或病症的患者是预先易患疾病或病症和/或以其他方式处于发展或具有疾病或病症复发风险的患者。易感患者可以被理解为这样的患者：可能发展疾病或病症，达到该患者将从预防性治疗或干预中受益的程度。

“神经系统疾病”是指神经系统的疾病或病症，包括但不限于与癌症相关的神经系统病症和神经退行性疾病。

“神经退行性疾病”是指包括但不限于以下的疾病：阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿病、帕金森病、病毒诱导的认知障碍、青光眼、黄斑变性、重症肌无力、格林-巴利综合征、视神经脊髓炎、中枢神经系统红斑狼疮和精神分裂症。在一些实施例中，待治疗的患者患有Tau蛋白病，诸如阿尔茨海默病。在一些实施例中，待治疗的患者患有精神分裂症。

阿尔茨海默病(AD)，也称为Alzheimer disease或“Alzheimer's”，是一种慢性神经退行性疾病，通常以进行性认知恶化，以及记忆力减退、语言、判断和/或解决问题方面的问题增加为特征，并且可能导致无法执行日常任务，并最终导致痴呆。

具体实施方式

突触去除和神经元损伤可由补体系统的经典途径介导，该途径由C1复合物(由C1Q、C1S和C1R组成)的活化引发，导致C2和C4的切割，进而导致C3的切割，其可以触发吞噬作用以及炎症和进一步下游补体活化。在本发明的上下文中，本发明人已经证明核酸分子(诸如反义寡核苷酸)抑制C4A和/或C4B的表达。C4的表达减少可导致C3的切割减少，从而导致小胶质细胞对突触的吞噬减少和补体活化的其他有害影响。

本发明的一个方面是一种C4抑制剂，其用在神经系统疾病，特别是选自Tau蛋白病和精神分裂症的神经系统疾病的治疗和/或预防中。在一些实施例中，Tau蛋白病为克罗恩病。C4抑制剂可以是例如与C4蛋白特异性结合的小分子，其中所述抑制剂防止或减少C4蛋白的切割。

本发明的一个实施例是一种C4抑制剂，其能够阻止或减少C4A蛋白和/或C4B蛋白的表达，从而导致C3的切割减少。在一些实施例中，C4抑制剂导致小胶质细胞对突触的吞噬的抑制。

在神经系统疾病的治疗中使用的C4抑制剂

不受理论束缚，据信C4参与C3的切割，从而参与小胶质细胞对突触的吞噬。

在本发明的一些实施例中，抑制剂为小分子化合物。在一些实施例中，抑制剂可以为特异性结合C4A和/或C4B蛋白的小分子。在一些实施例中，C4A蛋白由选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列编码。在一些实施例中，C4B蛋白由选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的序列编码。

本发明的核酸分子

治疗性核酸分子可用作C4抑制剂，因为它们可以靶向C4转录本并且例如经由RNA干扰途径或经由RNA酶H切割而促进其降解。替代地，寡核苷酸诸如适体也可以充当C4蛋白的抑制剂。

本发明的一个方面是一种C4靶向核酸分子，其在神经系统疾病的治疗和/或预防中使用。此类核酸分子可以选自由以下项组成的组：单链反义寡核苷酸、siRNA和shRNA。

本章节描述了适用于在神经系统疾病的治疗和/或预防中使用的新型核酸分子。在一些实施例中，神经系统疾病选自由以下项组成的组：阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿病、帕金森病、病毒诱导的认知障碍、青光眼、黄斑变性、重症肌无力、格林-巴利综合征、视神经脊髓炎、中枢神经系统红斑狼疮和精神分裂症。在一些实施例中，神经系统疾病为Tau蛋白病，诸如阿尔茨海默病。在一些实施例中，神经系统疾病为精神分裂症。

本发明的核酸分子能够在体外和体内抑制C4 mRNA和/或抑制C4蛋白的表达。可以通过将寡核苷酸与编码C4A和/或C4B蛋白的靶核酸杂交来实现抑制。在一些实施例中，靶核酸可以为哺乳动物C4A序列。在一些实施例中，靶核酸可以为人C4A前体mRNA序列诸如SEQID NO:3的序列或人成熟C4A mRNA序列诸如SEQ ID NO:6的序列。在一些实施例中，靶核酸可以为哺乳动物C4B序列。在一些实施例中，靶核酸可以为人C4B前体mRNA序列诸如SEQ IDNO:4的序列或人成熟C4B mRNA序列诸如SEQ ID NO:7的序列。在一些实施例中，靶核酸可以为食蟹猴C4序列，诸如SEQ ID NO:5的序列。

在一些实施例中，本发明的核酸分子能够通过抑制或下调靶标的表达来调节靶标的表达。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少20％(例如20％至30％)的表达抑制，更优选地与靶标的正常表达水平相比，至少30％(例如30％至40％)、至少40％(例如40％至50％)、至少50％(例如50％至60％)的抑制。在一些实施例中，通过使用20-50nM核酸分子进行转染，本发明的核酸分子可能能够在体外将C4mRNA的表达水平抑制至少50％(例如50％至60％)或60％(例如50％至60％)。在一些实施例中，通过使用50-350nM核酸分子用于gymnosis，本发明的核酸分子可能能够在体外将C4 mRNA的表达水平抑制至少50％(例如50％至60％)或60％(例如50％至60％)。合适地，实例中提供了可用于测量C4mRNA抑制的测定(例如实例1以及“材料和方法”章节)。C4抑制由寡核苷酸的连续核苷酸序列(诸如siRNA的前导链或反义寡核苷酸的gapmer区域)与靶核酸之间的杂交来进行触发。在一些实施例中，本发明的核酸分子包含寡核苷酸与靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可能足以显示出所需的C4表达抑制。由错配导致降低的结合亲和力可以有利地通过与靶核酸互补的寡核苷酸中核苷酸数量的增加和/或能够增加与靶标结合亲和力的修饰核苷数量的增加来补偿，该修饰核苷为诸如存在于寡核苷酸序列内的2'糖修饰的核苷(包括LNA)。

本发明的一个方面涉及长度为12个至60个核苷酸的核酸分子，其包含长度为至少12个核苷酸，诸如长度为至少12个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与哺乳动物C4靶核酸(特别是人C4mRNA)至少95％互补，诸如完全互补。这些核酸分子能够抑制C4mRNA和/或C4蛋白的表达。

本发明的一个方面涉及长度为12个至30个核苷酸的核酸分子，该核酸分子包含长度为至少12个核苷酸，诸如12个至30个或诸如15个至21个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与哺乳动物C4靶序列至少90％互补，诸如完全互补。

本发明的另一个方面涉及根据本发明的核酸分子，所述核酸分子包含长度为14个至22个或诸如15个至21个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的靶序列至少90％互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，核酸分子包含长度为12个至30个核苷酸的连续序列，其与靶核酸的区域或靶序列至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补。

如果寡核苷酸或其连续核苷酸序列与靶序列的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施例中，所述寡核苷酸与所述靶序列之间可存有一个或两个错配，则是有利的。

在一些实施例中，寡核苷酸序列与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的靶序列的区域100％互补。在一些实施例中，寡核苷酸序列与SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7的靶序列的区域100％互补。

在一些实施例中，本发明的核酸分子或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的靶核酸至少90％或95％互补，诸如完全(或100％)互补。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:5和/或SEQID NO:6和SEQ ID NO:7的靶核酸至少90％或95％互补，诸如完全(或100％)互补。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2和/或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的靶核酸至少90％或95％互补，诸如完全(或100％)互补。

在一些实施例中，本发明的核酸分子的连续序列与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的区域至少90％互补(诸如完全互补)，该区域选自由以下项组成的组：如表4a所示的靶标区域1A至297A和/或如表4b所示的靶标区域1B至297B。

在一些实施例中，本发明的核酸分子包含长度为12个至60个的核苷酸，诸如长度为13个至50个、诸如14个至35个、诸如15个至30个、诸如15个至21个的连续核苷酸或由其组成。在一个优选的实施例中，核酸分子包含长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个的核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，与靶核酸互补的核酸分子的连续核苷酸序列包含长度为12个至30个，诸如13个至25个、诸如15个至21个的连续核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，寡核苷酸选自由以下项组成的组：反义寡核苷酸、siRNA和shRNA。

在一些实施例中，与靶序列互补的siRNA或shRNA的连续核苷酸序列包含长度为18至28个，诸如19至26个、诸如20至24个、诸如21至23个的连续核苷酸，或由其组成。

在一些实施例中，与靶核酸互补的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列包含长度为12个至22，诸如14个至21个、诸如15个至21个、诸如15个、16个、17个个、18个、19个、20个或21个的连续核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，寡核苷酸或连续核苷酸序列包含选自由表7所列序列组成的组的序列，或由其组成。

应当理解的是，可以修饰连续寡核苷酸序列(基序序列)以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。

将修饰的核苷(例如高亲和力修饰的核苷)掺入寡核苷酸序列中的模式通常称为寡核苷酸设计。

本发明的核酸分子可以使用修饰的核苷和RNA核苷(特别是用于siRNA和shRNA分子)或DNA核苷(特别是用于单链反义寡核苷酸)设计。

在有利实施例中，核酸分子或连续核苷酸序列包含一个或多个糖修饰的核苷(诸如2'糖修饰的核苷)，诸如包含一个或多个独立地选自由以下项组成的组2'糖修饰的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)核苷和DNA核苷。

有利地，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的3'最末端核苷为2'糖修饰的核苷。

在另一个实施例中，核酸分子包含至少一个修饰的核苷间键合。合适的核苷间修饰描述于“定义”章节的“修饰的核苷间键合”下。

有利地，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键，诸如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键合是磷酸二酯核苷间键合。

如果在寡核苷酸的5’或3’端的至少2个至3个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，则是优选的。

对于单链反义寡核苷酸，如果连续核苷酸序列内的至少75％，诸如70％至80％，至少90％，诸如90％至95％，或所有的核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合，则是优选的。在一些实施例中，单链反义寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。

在本发明的一个有利实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够募集RNA酶H，诸如RNA酶H1。有利的结构设计是如“定义”章节中，例如在“gapmer”、“LNA gapmer”和“MOE gapmer”下描述的gapmer设计。在本发明中，如果本发明的反义寡核苷酸是具有F-G-F'设计的gapmer，则是优选的。

在一些实施例中，F-G-F'设计可进一步包括区域D'和/或D”，如“定义”章节中“寡核苷酸中的区域D'或D”下所述”。

在一些实施例中，本发明的抑制剂是能够诱导RNA干扰过程的核酸(如例如在WO2014/089121中描述的)。

制造方法

在另一方面，本发明提供了用于制造本发明的寡核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括使核苷酸单元反应并由此形成包含在根据本发明的核酸分子的序列中的寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，该方法使用亚磷酰胺化学方法(参见例如Caruthers et al,1987,Methods in Enzymology vol.154,pages 287-313)。

制造的寡核苷酸可包含如本文所述的一种或多种修饰。例如，制造的寡核苷酸可以包含一个或多个糖修饰的核苷、一个或多个修饰的核苷间键合和/或一个或多个修饰的核碱基。因此，本发明的寡核苷酸的制造方法可以进一步包括将这样的修饰引入寡核苷酸中。

在一些实施例中，可以将一个或多个修饰的核苷间键合(诸如硫代磷酸酯核苷间键合)引入寡核苷酸中。在一些实施例中，可以引入一个或多个糖修饰的核苷，例如2'糖修饰的核苷。在一些实施例中，可以将一个或多个高亲和力修饰的核苷和/或一个或多个LNA核苷引入寡核苷酸中。在一些实施例中，将如本文别处所述的区域D'和/或D”添加至寡核苷酸。

在另一个方面，提供了一种用于制备本发明的药物组合物的方法，该方法包括将本发明的寡核苷酸与药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂混合。

如本文别处更详细描述的，本发明的寡核苷酸可以以药学上可接受的盐、酯、溶剂化物的形式或以前药的形式存在。因此，用于以这样的形式制造本发明的寡核苷酸的方法。

药学上可接受的盐

根据本发明的化合物可以以其药学上可接受的盐的形式存在。术语“药学上可接受的盐”是指保留或基本上保留本发明的化合物的生物学有效性和特性的常规酸加成盐或碱加成盐。例如，可以提及以下盐：碱金属盐，诸如钠盐、钾盐或锂盐；碱土金属盐，诸如钙盐或镁盐；金属盐，诸如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐；胺盐，包括无机盐诸如铵盐和有机盐诸如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐，二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐或三(羟甲基)氨基甲烷盐；无机酸盐，包括氢卤酸盐，诸如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐或氢碘酸盐、硫酸盐或磷酸盐；有机酸盐，包括低级烷烃磺酸盐诸如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐或乙磺酸盐，芳基磺酸盐诸如苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐或马来酸盐；以及氨基酸盐，诸如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐或天冬氨酸盐。这些盐可以通过已知方法制备。

在另一个方面，本发明提供本发明核酸分子或药学上可接受的盐，诸如药用钠盐、铵盐或钾盐。

溶剂化物

根据本发明的化合物可以以溶剂化物的形式存在。术语“溶剂化物”在本文中用于描述包含本发明的寡核苷酸和一种或多种药用溶剂分子例如乙醇或水的分子复合物。如果溶剂是水，则溶剂化物是“水合物”。本发明含义内的药用溶剂化物包括水合物和其他溶剂化物。

前药

此外，本发明的化合物可以以前药的形式施用。前药定义为在体内经历转化以产生母体活性药物的化合物。因为细胞膜在性质上是亲脂的，与中性或亲脂等效物相比，寡核苷酸的细胞摄取通常降低。一种解决方案是使用前药方法(参见例如Crooke,R.M.(1998)于Crooke,S.T.Antisense research and Application.Springer-Verlag,Berlin,Germany,第131卷,第103-140页)。这种前药的实例包括但不限于酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲和磷酸酯。这些前药可以通过已知方法制备。

药物组合物

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物中的任何化合物，特别是前述核酸分子或其盐以及药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施例中，核酸分子以50μM至300μM溶液的浓度在药用稀释剂中使用。用于本发明的合适的制剂可见于《雷明顿药物科学(第十七版)》(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985)中。对于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。WO 2007/031091(通过引用并入本文)例如提供了药用稀释剂、载体和佐剂的其他合适的和优选的实例。例如WO2007/031091中也提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂等。在一些实施例中，本发明的核酸分子或其药学上可接受的盐为固体形式，诸如粉末、诸如冻干粉末。可以将本发明的化合物或核酸分子与药用活性或惰性物质混合，以用于制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性运载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。

施用

本发明的寡核苷酸或药物组合物可经由胃肠外方式给药(诸如静脉内、皮下、肌内、鼻内、脑内、脑室内、眼内或鞘内给药)。

在一些实施例中，所述给药是经由鞘内给药，例如通过腰椎穿刺。

有利的是，例如在治疗神经性疾患时，本发明的寡核苷酸或药物组合物是以鞘内或颅内方式给药，例如经由脑内或脑室内给药。

本发明还提供本发明的寡核苷酸或其缀合物，诸如药学上可接受的盐或组合物，在制造药物上的用途，其中所述药物是用于皮下给药的剂型。

本发明还提供本发明的寡核苷酸，或其缀合物，诸如本发明的药学上可接受的盐或组合物，在制造药物上的用途，其中所述药物是用于鞘内给药的剂型。

在一些实施例中，施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸或药物组合物。

递送平台

寡核苷酸向靶组织的递送可以通过载体介导的递送来增强，包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树枝状大分子、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒、细胞穿透肽和微球(参见例如Dass,C R.J Pharm Pharmacol 2002；54(1):3-27)。

在一些实施例中，本发明的抑制剂(例如本发明的寡核苷酸)靶向大脑。例如，可以通过将所述抑制剂与促进穿过血脑屏障递送的部分(例如靶向转铁蛋白受体的抗体或抗体片段)偶联来实现向大脑的递送。

组合疗法

在一些实施例中，本发明的抑制剂诸如本发明的核酸分子、核酸分子缀合物、药学上可接受的盐或药物组合物在与另一种治疗剂的组合治疗中使用。治疗剂可以例如是上述疾病或疾患的护理标准。

例如，本发明的抑制剂可以与其他活性剂组合使用，例如基于寡核苷酸的治疗剂——例如基于序列特异性寡核苷酸的治疗剂——通过核苷酸序列依赖性作用模式起作用。

作为进一步的实例，本发明的抑制剂可以与一种或多种乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或一种或多种NMDA受体拮抗剂组合使用。胆碱酯酶抑制剂可以是例如多奈哌齐、他克林、加兰他敏或卡巴拉汀。NMDA受体拮抗剂可以是例如美金刚。

作为进一步的实例，本发明的抑制剂可以与一种或多种典型抗精神病药和/或一种或多种非典型抗精神病药组合使用。典型抗精神病药可以是例如氯丙嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇、奋乃静、硫利达嗪、替沃噻吨或三氟拉嗪。非典型抗精神病药可以是例如阿立哌唑、月桂酰阿立哌唑、阿塞那平、依匹哌唑、卡利拉嗪、氯氮平、伊潘立酮、甲苯磺酸芦玛哌酮、鲁拉西酮、奥氮平、帕利哌酮、棕榈酸阿立哌酮或齐拉西酮。

在一些实施例中，本发明的抑制剂与结合补体C4或C4的C4b部分的抗体(例如，如WO 2017/196969中所述)组合使用。

在一些实施例中，本发明的抑制剂与以下一种或多种组合使用：靶向C9ORT72的反义化合物(例如，如WO 2014/062736中所述)；阻断C3转化酶、C5、C6、C7、C8和C9中的一种或多种的表达的反义寡核苷酸、适体、miRNA、核酶或siRNA(例如，如WO 2008/044928中所述)；阻断C3转化酶、C5、C6、C7、C8和C9中的一种或多种的活性的抗体(例如，如WO 2008/044928中所述)；降低补体级联的活性的反义或双链RNA(例如，如WO 2005/060667中所述)；以及结合C1蛋白的抗体，例如，以抑制C1的蛋白水解活性(例如，如WO 2014/066744中所述)。

在一些实施例中，本发明的抑制剂与2020年5月11日提交的题为“ComplementComponent C1R Inhibitors For Treating A Neurological Disease,And RelatedCompositions,Systems And Methods Of Using Same”的美国临时申请以及2020年5月11日提交题为“Complement Component C1S Inhibitors For Treating A NeurologicalDisease,And Related Compositions,Systems And Methods Of Using Same”的美国临时申请中公开的一种或多种核酸分子组合使用。

应用

本发明的核酸分子可作为研究试剂使用，例如用于诊断以及治疗和预防。

在研究中，此类核酸分子可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和动物模型中C4蛋白的合成，从而有助于靶标的功能分析或对其作为治疗干预靶标的可用性的评估。通常，通过降解或抑制对应于蛋白质的mRNA，从而阻止蛋白质形成，或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA的调节剂来实现靶调节。

如果在研究或诊断中采用本发明的核酸分子，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

检测或诊断方法

本发明还包括一种用于诊断疑似患有神经系统疾病的患者中的神经系统疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

a)确定来自受试者的样品中一种或多种C4核酸，诸如C4 mRNA或衍生自C4 mRNA的cDNA的量，其中所述确定包括使样品与本发明的一种或多种寡核苷酸接触，

b)将在步骤a)中确定的量与参考量进行比较，以及

c)基于步骤b)的结果诊断受试者是否患有神经系统疾病。

在一些实施例中，诊断神经系统疾病的方法是体外方法

术语“神经系统疾病”已在本文别处定义。该定义相应地适用。在一些实施例中，待诊断的神经系统疾病为Tau蛋白病，诸如阿尔茨海默病。在一些实施例中，待诊断的神经系统疾病为精神分裂症。

术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或来自组织或器官样品。体液样品可以通过众所周知的技术获得，并且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰、腹水、唾液和泪液的样品。在一些实施方案中，样品为脑脊液样品。

组织或器官样品可以通过例如活检从任何组织或器官获得。在一些实施例中，样品为神经组织样品，诸如脑组织样品或脊髓样品。

在一些实施例中，样品包含神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或小胶质细胞。

受试者可为哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者为食蟹猴。

在上述方法的步骤a)中，应确定样品中存在的C4核酸的量。待确定的C4核酸应为编码C4蛋白(诸如C4A或C4B蛋白)的核酸。在一些实施例中，C4核酸为哺乳动物C4核酸。在一些实施例中，C4核酸为人C4核酸，诸如人C4A或C4B核酸。

C4核酸可以例如为基因、RNA、mRNA和前体mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。在一个实施例中，核酸为C4 mRNA，诸如C4A或C4B mRNA。在另一个实施例中，C4核酸为衍生自C4 mRNA的cDNA。

在上述方法的步骤b)中，应将C4核酸的量与参考(即与参考量)进行比较。术语“参考量”或“参考”被技术人员很好地理解。原则上，可以基于给定生物标志物的平均值或均值，通过施加标准统计方法来计算受试者同期群的合适参考量。合适的参考应允许神经系统疾病的诊断。因此，该参考应允许区分患有神经系统疾病的患者和未患有神经系统疾病的受试者。在一些实施例中，参考是预定值。

在一些实施例中，大于参考量的一种或多种C4核酸的量指示患有神经系统疾病的患者，而低于参考量的一种或多种C4核酸的量指示未患神经系统疾病的患者。

在步骤a)中确定一种或多种核酸的量应包括使样品与一种或多种本发明的寡核苷酸接触。例如，在允许所述一种或多种寡核苷酸与存在于样品中的一种或多种C4核酸(例如C4 mRNA)杂交的条件下，使样品与所述一种或多种寡核苷酸接触，从而形成所述寡核苷酸和所述C4核酸的双链体。在一些实施例中，一种或多种C4核酸的量通过确定形成的双链体的量来确定，例如经由可检测标记。因此，待使用的一种或多种寡核苷酸可包含可检测标记。

本发明还包括用于检测样品(例如如上定义的样品)中的一种或多种C4核酸的方法。该方法可以包括使样品与如上所述的一种或多种本发明的寡核苷酸接触。在另一个实施例中，样品来自患有或疑似患有神经系统疾病的患者。

本发明还包括用于调节表达C4的靶细胞中的C4表达的体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物。

在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，特别是人细胞。靶细胞可以是形成哺乳动物组织的一部分的体外细胞培养物或体内细胞在优选的实施例中，靶细胞存在于脑中。靶细胞可以是脑细胞。在一些实施例中，脑细胞选自由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成的组。

本发明的一个方面涉及用作药物的本发明的核酸分子或药物组合物。

在本发明的一个方面，C4抑制剂(诸如本发明的核酸分子或药物组合物)能够降低表达C4的细胞中C4的量。

例如，与对照相比，抑制C4表达的核酸分子可以将受影响细胞中的C4蛋白减少至少50％(例如50％至60％)，或至少60％(例如60％至70％)，或至少70％(例如70％至80％)，至少80％(例如80％至90％)，或至少90％(例如90％至95％)。对照物可以是未处理的细胞或动物，或用适当的对照物处理的细胞或动物。

C4表达的抑制可通过RT-qPCR测定，例如，如“材料和方法”章节所述。

由于C4水平的降低，本发明的核酸分子或药物组合物可用于抑制神经系统疾病的发展或用于治疗神经系统疾病。

因此，本发明的一个方面涉及C4抑制剂(诸如本发明的核酸分子或药物组合物)降低患有或易患神经系统疾病的个体中的C4蛋白的用途。

用C4抑制剂(诸如本发明的核酸分子或药物组合物)治疗的受试者(或预防性接受本发明的核酸分子或药物组合物的受试者)优选是人类，更优选患有神经系统疾病的人类患者，甚至更优选患有Tau蛋白病的人类患者，甚至更优选患有阿尔茨海默病的人类患者。在一些实施例中，人类患者患有精神分裂症。

因此，本发明涉及一种治疗神经系统疾病的方法，其中该方法包括施用有效量的C4抑制剂，诸如本发明的核酸分子或药物组合物。本发明进一步涉及一种预防神经系统疾病的方法。在一个实施例中，本发明的C4抑制剂不旨在用于治疗神经系统疾病，仅旨在预防。

本发明还提供了C4抑制剂(诸如本发明的核酸分子或药物组合物)用于制备药物的用途，特别是在神经系统疾病的治疗中使用的药物。在优选的实施例中，药物被制备成用于鞘内或颅内施用的剂型。

在一些实施例中，待治疗的受试者未患有心血管病症或疾病(例如，如WO 2014/089121中所述)。在一些实施例中，待治疗的受试者不需要治疗疼痛(例如，如WO 2005/060667中所述)。

本发明还提供了本发明的核酸分子或药物组合物用于制备药物的用途，其中所述药物为用于静脉内施用的剂型。

在一些实施例中，C4为C4A和/或C4B。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，其包含本发明的C4抑制剂，诸如本发明的核酸分子或药物组合物，以及用于施用C4抑制剂的说明书。说明书可表明C4抑制剂可用于治疗本文提及的神经系统疾病或神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病或精神分裂症。

如本文所用，术语“试剂盒”是指包含用于施用本发明的C4抑制剂的组件的包装产品。试剂盒可包括容纳试剂盒的组件的盒子或容器。该试剂盒还可以包括用于施用本发明的本发明的C4抑制剂的说明书。

实例

材料和方法

实例1:在原代小鼠肝细胞中测试靶向C4的反义寡核苷酸的体外功效

细胞按照供应商的建议保存在加湿的孵育箱中。供应商和推荐的培养条件报告在表5中。

表5.细胞培养细节

对于测定，将细胞接种在培养基中的96孔板中，并如报告在表5中所述孵育，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。细胞的接种密度报告在表5中。

以表8中报告的浓度添加寡核苷酸。在添加寡核苷酸后72小时收获细胞(参见表5)。根据制造商的说明，使用RNeasy 96试剂盒(Qiagen)提取RNA，并在200μL水中洗脱。随后将RNA加热至90℃一分钟。

对于基因表达分析，使用qScript

表6.qPCR引物-探针详细信息。

本文提供了以下寡核苷酸化合物(表7)：

表7.寡核苷酸化合物

在表中，大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。

表8中的相对小鼠C4b和小鼠C4a mRNA表达水平显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。标有下划线的C4b列中的值仅基于C4b转录本的检测。标有下划线的C4a和C4b列中的值基于C4a和C4b转录本的检测。

表8.

从表8可以看出，C4池能够在不同浓度下有效地减少C4a mRNA和C4b mRNA。