一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治番茄病害中的应用

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术领域，具体是一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治番茄病害中的应用。

背景技术

番茄常见病害有灰霉病、晚疫病、灰叶斑病、叶霉病、根腐病、颈腐根腐病、青枯病、病毒病等，在设施栽培过程中因常年连作，导致各类病害发生普遍，严重影响番茄的产量及品质。

设施番茄病害防治主要采用综合防治措施，包括选种抗病品种、种子处理、加强田间管理、实行轮作、生态调控、化学防治、生物防治等。众多防治措施中，化学防治具有使用方便、见效快的特点，在生产中应用广泛。但由于过量使用化学农药、频繁用药或者用药方法不当，导致病原菌产生抗药性、农产品农药残留超标、生态环境污染、土壤有益微生物种群减少等问题，严重影响设施农业的可持续发展。生物防治具有对环境友好，对人畜和天敌安全，并且可长期稳定控制有害生物的特点。筛选并开发新的生防菌，利用生防菌进行植物病害防治，对设施农业的可持续发展具有重要作用。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）普遍分布于植物组织、根际土壤、发酵食品等环境，能够产生抗菌肽、抗菌蛋白等多种生物活性代谢物，对植物病原菌具有良好的抑制作用；同时具有繁殖能力强、抗逆性优、环境安全性高等优点，能够通过拮抗、竞争、诱导植物产生抗病性等方式在植物病害生物防治中发挥作用，是一种优良的生防菌，因此亟待开发新的生防菌株用于植物病害生物防治。

发明内容

本发明的目的在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治番茄病害中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002，于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20221086。

如上述所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002在防治番茄病害中的应用。

微生物菌剂，用于防治番茄病害，所述微生物菌剂含有上述所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002。

微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取适量保存的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002菌种接种到种子培养基中，在振荡培养箱中振荡培养，获得种子液；

将种子液接种到发酵培养基中，在振荡培养箱中振荡培养，获得微生物菌剂。

作为本发明的进一步技术方案，所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002菌种保存在NA固体培养基上。

作为本发明的更进一步技术方案，所述种子培养基在振荡培养箱中的转速为150-200rpm，培养24h。

作为本发明的再进一步技术方案，所述种子培养基在振荡培养箱中的温度为25-35℃。

作为本发明的再进一步技术方案，所述种子液接种到发酵培养基的接种量为5%。

作为本发明的再进一步技术方案，所述发酵培养基在振荡培养箱中的转速为150-200rpm，培养48-72h。

作为本发明的再进一步技术方案，所述发酵培养基在振荡培养箱中的温度为25-35℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：首次筛选获得一株抑菌谱广、抑菌效果优异的贝莱斯芽孢杆菌BF017002，并于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20221086；利用该贝莱斯芽孢杆菌BF017002制备的微生物菌剂对番茄灰霉病菌、番茄晚疫病菌、番茄叶霉病菌、番茄灰叶斑病菌、番茄根腐病菌、番茄红粉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜靶斑病菌、茄子褐纹病菌、蔬菜立枯病菌具有抑制作用，表现出防治效果好、使用方便、环境安全性高的特点。

附图说明

图1为基于16S rDNA基因序列构建菌株BF017002的系统发育树图；

图2为gyrA基因序列构建菌株BF017002的系统发育树图；

图3为贝莱斯芽孢杆菌BF017002对不同病原菌的抑菌效果图；

图4为贝莱斯芽孢杆菌BF017002对番茄颈腐根腐病的防治效果图。

具体实施方式

结合附图和实施例说明本发明的具体实施方式，以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

实施例中涉及的仪器设备如无特殊说明，均为常规仪器设备；涉及的试剂如无特殊说明，均为市场销售的常规试剂；所涉及的试验方法如无特殊说明，均为通用常规方法。

一株贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）BF017002，已于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20221086，地址为中国.武汉.武汉大学。

实施例1：芽孢杆菌的分离、纯化

2020年8月12日在山东省寿光市大棚内采集番茄根际土壤，利用土壤稀释平板法，吸取稀释10

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌BF017002的鉴定

（1）菌落形态特征和菌体形态观察

取分离菌株BF017002接种到NA培养基上，37℃培养48h，观察菌落的形态特征和生长情况；并挑取菌落进行革兰氏染色，观察菌体的大小和形态。

菌落为乳白色圆形，表面干燥，有皱褶，边缘不整齐，中部凹陷；菌体杆状，大小为（1.4-4.2）µm×（0.4-0.6）µm，产生椭圆形芽孢，革兰氏染色阳性。

（2）理化性质分析

参照《常见细菌系统鉴定手册》进行分离菌株BF017002的生理生化试验，主要包括甲基红反应、V-P试验、淀粉水解试验、吲哚反应试验、明胶液化试验和碳源利用试验。

理化性质分析结果见如下表1：

注：+为阳性，-为阴性。

（3）菌株BF017002分子生物学及系统发育分析

菌株BF017002的分子生物学分析采用16S rDNA、gyrA基因片段，PCR扩增所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，16S rDNA基因片段扩增引物为27F和1492R，gyrA基因片段扩增引物为42F和1066R；上述16S rDNA基因片段扩增引物和gyrA基因片段扩增引物属于现有技术公开的通用引物，具体引用现有文献“M. Labiadh, R. Aidi, B. M’hamdi, A. Rhouma, S. Flahaut, S. Kallel. Occurrence and functional diversityof bacteria in rhizosphere of citrus trees infested by Tylenchulussemipenetrans in a citrus-growing area of Tunisia [J]. European Journal ofPlant Pathology, 2019, 155:475–488”。

以菌株BF017002的LB液体培养物为模板，分别以27F/1492R、42F/1066R为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物送至华大基因科技有限公司进行序列测定，分别获得大小为1105bp和915bp的序列，测序结果进行BLAST序列同源性分析。将菌株BF017002测序结果在NCBI网站上进行序列比对，下载相关菌株的基因序列，采用MEGA 7.0软件进行序列比对，NJ（Neighbour-joining）法分别构建基于16S rDNA、gyrA基因序列的系统发育树，如图1、图2所示。

菌株BF017002的16S rDNA、gyrA基因序列经BLAST比对分析，与数据库中多个贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株具有高度同源性，同源性达99%以上。分别由菌株BF017002的16S rDNA、gyrA基因序列与多个已知芽孢杆菌的16S rDNA、gyrA基因序列构建系统发育树，结果显示菌株BF017002的16S rDNA、gyrA基因序列与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis 聚为一支。结合形态特征、生理生化分析及序列分析结果，鉴定菌株BF017002为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌BF017002的制备

（1）将保存在NA斜面培养基上的贝莱斯芽孢杆菌BF017002接种到种子培养基中，在25-35℃，转速150-200rpm振荡培养箱中培养24h，获得种子液；种子培养基配方：蛋白胨5g，牛肉浸粉10g，氯化钠5g，水1000ml，调节pH6.5-7.5；分装后，121℃灭菌20min备用。

（2）将上述制备的种子液按照5%接种量接种至发酵培养中，在25-35℃，转速150-200rpm条件下发酵培养48-72h，即获得液体微生物菌剂。发酵培养基配方：蛋白胨40g，红糖30g，氯化钠1g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾1g，水1000ml，调节pH7-8；分装后，121℃灭菌20min备用。

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌BF017002的抑菌谱测定

采用平板对峙培养法测定贝莱斯芽孢杆菌BF017002对不同病原菌的抑制效果，方法如下：

（1）挑取保存在NA斜面培养基上的贝莱斯芽孢杆菌BF017002，接种到NA液体培养基中，在25-35℃，转速150-200rpm振荡培养箱中振荡培养48h，获得菌液，备用；

（2）将活化培养好的病原真菌用打孔器打取直径5mm的菌饼，接种到PDA平板中心，采用十字交叉法在距离病原菌中心2.5-3cm处打孔，取出打孔处的培养基，每个孔内加入上述菌液20µl，25℃培养5-7d，观察抑菌效果并测量菌落直径；

（3）上述实验，每种病原菌株做3次重复，以等量无菌水为对照。

统计并计算菌液对不同真菌病原的抑制效果，抑菌率和抑菌效果分别见表2和图3；结果表明贝莱斯芽孢杆菌BF017002具有较高的抑菌活性，对番茄灰霉病菌等12种病害病原菌的抑菌率超过70%，可以用于番茄相关病害的防治。

实施例5：贝莱斯芽孢杆菌BF017002菌剂防治番茄苗期枯萎病的试验

于2021年5月在潍坊科技学院培养室内进行。供试病原菌为番茄枯萎病菌，由潍坊科技学院微生物实验室分离保存，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂，以清水为空白对照。

供试番茄品种为粉贝贝，种子在25℃催芽后播种在装有育苗基质的育苗盘内，置于25℃左右的温室内育苗。

将番茄枯萎病菌接种到PDA液体培养基中，25℃，120rpm振荡培养的7d，用纱布过滤后获得孢子滤液，制成浓度为1×10

待番茄苗长至3叶一心时，用上述孢子悬浮液灌根。接种后番茄苗在培养室培养2d，然后分别使用稀释10倍、稀释20倍的实施例3的液体菌剂以及50%多菌灵500倍液进行蘸盘，蘸盘时使菌液和药剂完全浸没育苗盘，以清水处理为对照。每个处理30棵番茄苗，重复3次。接种处理25d后观察发病情况并记录病级，计算病情指数和防治效果。

番茄根腐病病害分级为5级，即：

0级：无症状，茎基部无病斑；

1级：子叶黄化或茎基部轻微变褐；

3级：子叶萎蔫或茎基部50%以下变褐；

5级：植株萎蔫或茎基部50%-75%变褐；

7级：植株维管束变褐色，根部坏死。

防治试验结果见表3。结果表明，实施例3的液体菌剂稀释10倍和20倍，通过蘸盘处理防治番茄苗期枯萎病，防治效果达到85%以上，均高于50%多菌灵可湿性粉剂。

实施例6：贝莱斯芽孢杆菌BF017002菌剂对番茄颈腐根腐病的防治试验

于2021年7月在潍坊科技学院培养室内进行。供试病原菌为番茄颈腐根腐病菌，由潍坊科技学院微生物实验室分离保存，对照药剂为30%吡唑醚菌酯悬浮剂（先正达公司）。

供试番茄品种为粉贝贝，种子在25℃催芽后播种在装有育苗基质的育苗盘内，置于25℃左右的温室内育苗。

将番茄颈腐根腐病菌接种到PDA液体培养基中，25℃，120rpm振荡培养7d，用纱布过滤后获得滤液，制成浓度为1×10

待番茄苗长至3叶一心时，洗净幼苗根部后在上述孢子悬浮液中浸根20min，然后将幼苗定植于装有基质的花盆（直径15cm）中，每盆种植3棵。

接种后的番茄苗在培养室培养2d后，然后分别使用稀释10倍、稀释20倍的实施例3的液体菌剂以及30%吡唑醚菌酯1500倍液进行灌根处理，以清水处理为空白对照。每个处理10盆，重复3次。接种后25d后观察发病情况并记录病级，计算病情指数和防治效果。

防治试验结果见表4和图4（A：10倍菌剂处理；B：20倍菌剂处理；C：30%吡唑醚菌酯SC处理；D：空白对照）。结果表明，实施例3的液体菌剂稀释10倍和20倍后进行灌根处理，对番茄颈腐根腐病的防治效果达到75%以上，其中10倍菌剂处理的防效高于30%吡唑醚菌酯悬浮剂，20倍菌剂处理防效略低于30%吡唑醚菌酯悬浮剂。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。