一种畜禽粪污和秸秆深度发酵制备有机肥方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种畜禽粪污和秸秆深度发酵制备有机肥方法。

背景技术

有机肥含有丰富的腐植酸、氨基酸等有机养分，也含有氮、磷、钾等无机养分，在我国农业发展过程中一直发挥着重要的作用。有机肥料一般是指有机固体废物，如畜禽粪便、秸秆、饼粕、农副产品和食品加工产生的固体废物，经微生物发酵和完全腐熟后制得的肥料。实际操作中，以畜禽粪便和秸秆作为主料制备有机肥料居多。由于我国养殖业规模巨大，因此我国每年畜禽粪便的产生量也是十分惊人的；我国农作物秸秆的产生量也很高，传统的农作物秸秆处理方式以焚烧为主，这会造成严重的空气污染。目前，以畜禽粪便、秸秆等材料制备有机肥料，成为回收利用畜禽粪便和秸秆的有效途径。

秸秆是成熟农作物茎叶(穗)部分的总称，秸秆富含氮、磷、钾、钙、镁和有机质等，是一种具有多用途的可再生的生物资源，畜禽粪便主要指畜禽养殖业中产生的一类农村固体废物，包括猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪、鸭粪等，农业生产上常将秸秆与畜禽粪便混合发酵作为有机肥料投入农田进行再次使用，然而现有的秸秆与畜禽粪便混合发酵采用的的方式一般是传统堆肥发酵，堆肥发酵采用翻堆机翻抛，养分损失大，并且堆肥发酵开放，有污染，堆放场地大，并且无法除臭，导致整个环境臭味难闻，并且采用传统堆肥发酵制备的有机肥有机质含量及NPK含量较低，不能满足有机肥的生产需求。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种畜禽粪污和秸秆深度发酵制备有机肥方法，包括以下步骤：

步骤一、将畜禽粪污与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入微生物菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％；得到预发酵物料；

步骤二、将预发酵物料加入智能型密闭式高温好氧发酵罐中，发酵开始后，在送风机提供氧气的条件下，发酵温度在60～70℃下，搅拌发酵5～16天；发酵成品经造粒制备得到有机肥。

优选的是，所述畜禽粪污为猪粪、牛粪、鸡粪、鸭粪中的一种或几种。

优选的是，所述微生物菌剂中的菌为细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌中的一种或几种。

优选的是，所述细长赖氨酸芽孢杆菌的分类命名为细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M24857，保藏地址：中国北京；所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24858，保藏地址：中国北京；所述短芽孢杆菌的分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M24859，保藏地址：中国北京。

优选的是，所述细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)的DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)的DNA基因序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)的DNA基因序列如SEQID NO.3所示。

优选的是，所述细长赖氨酸芽孢杆菌采用细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液，其制备方法为：用接种环挑取两环细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides SWUST-1)斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液；将赖氨酸芽孢杆菌一级种子液以3％(v/v)的接种量接种于250mL优化培养基，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液；

所述芽孢杆菌采用芽孢杆菌二级种子液，其制备方法为：用接种环挑取两环芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得芽孢杆菌一级种子液；芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得芽孢杆菌二级种子液

所述短芽孢杆菌采用短芽孢杆菌二级种子液，其制备方法为：用接种环挑取两环短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得短芽孢杆菌一级种子液；短芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得短芽孢杆菌二级种子液。

优选的是，所述优化培养基的组成为：CMC-Na 5.0g、(NH

优选的是，当所述微生物菌剂中的菌为细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌的混合时，将所述细长赖氨酸芽孢杆菌二级种子液、芽孢杆菌二级种子液和短芽孢杆菌二级种子液按1-1.5：2：2比例组合，得到微生物复合菌剂；所述复合菌液菌落总数达到2.5×10

本发明至少包括以下有益效果：本发明采用在智能型密闭式高温好氧发酵罐中进行密闭高温发酵，发酵方式为罐内发酵无污染，在送风机提供氧气的条件下，好氧微生物迅速繁殖，物料温度迅速升高，当天进入高温期，温度可以达到60℃-70℃，在此阶段内有机物被分解，水分快速减少，病原菌和杂草种子被杀灭，实现物料的无害化和稳定化以及减量化处理；并且采用的微生物菌剂的菌株来源于秸秆堆肥自然发酵过程中的高温优势菌群，经长期筛选、驯化，可以有效地促进以秸秆和畜禽粪污为主要原料的有机肥发酵生产过程，提高有机肥的生产效率和肥效，同时提高秸秆、粪污的无害化处理效果。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明：

图1为本发明菌株的初筛过程中的染色的水解圈；

图2为本发明菌株的复筛过程中的葡萄糖标准曲线。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1：

一种畜禽粪污和秸秆深度发酵制备有机肥方法，包括以下步骤：

步骤一、将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入细长赖氨酸芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％；得到预发酵物料；

步骤二、将预发酵物料加入智能型密闭式高温好氧发酵罐中，发酵开始后，在送风机提供氧气的条件下，发酵温度在65℃下，搅拌发酵12天；发酵成品经造粒制备得到有机肥。

所述细长赖氨酸芽孢杆菌菌剂的制备方法为：用接种环挑取两环细长赖氨酸芽孢杆菌斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液；将细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液以3％(v/v)的接种量接种于250mL优化培养基(CMC-Na 5.0g、(NH

实施例2：

一种畜禽粪污和秸秆深度发酵制备有机肥方法，包括以下步骤：

步骤一、将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％；得到预发酵物料；

步骤二、将预发酵物料加入智能型密闭式高温好氧发酵罐中，发酵开始后，在送风机提供氧气的条件下，发酵温度在65℃下，搅拌发酵12天；发酵成品经造粒制备得到有机肥；

所述芽孢杆菌菌剂的制备方法为：用接种环挑取两环芽孢杆菌斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得芽孢杆菌一级种子液；将芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得芽孢杆菌二级种子液，即芽孢杆菌菌剂菌剂；所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24858；述芽孢杆菌(Bacillus sp.SWUST-3)的DNA基因序列如SEQ ID NO.2所示；

实施例3：

一种畜禽粪污和秸秆深度发酵制备有机肥方法，包括以下步骤：

步骤一、将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入短芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％；得到预发酵物料；

步骤二、将预发酵物料加入智能型密闭式高温好氧发酵罐中，发酵开始后，在送风机提供氧气的条件下，发酵温度在65℃下，搅拌发酵12天；发酵成品经造粒制备得到有机肥；

所述短芽孢杆菌菌剂的制备方法为：用接种环挑取两环短芽孢杆菌斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，制得短芽孢杆菌一级种子液；将短芽孢杆菌一级种子液以6％(v/v)的接种量接种于250mL营养肉汤培养基中，37℃，150r/min，摇瓶培养30h，制得短芽孢杆菌二级种子液；即短芽孢杆菌菌剂；所述短芽孢杆菌的分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)，已于2022年05月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.M 24859；所述短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.SWUST-2)的DNA基因序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例4：

一种畜禽粪污和秸秆深度发酵制备有机肥方法，包括以下步骤：

步骤一、将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入复合微生物菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％；得到预发酵物料；

步骤二、将预发酵物料加入智能型密闭式高温好氧发酵罐中，发酵开始后，在送风机提供氧气的条件下，发酵温度在65℃下，搅拌发酵12天；发酵成品经造粒制备得到有机肥；

所述复合微生物菌剂的制备方法为：用接种环分别挑取两环细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌斜面种子于装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，培养18h，分别制得细长赖氨酸芽孢杆菌一级种子液、芽孢杆菌一级种子液和短芽孢杆菌一级种子液；将赖氨酸芽孢杆菌一级种子液以3％(v/v)的接种量接种于250mL优化培养基(CMC-Na5.0g、(NH

对比例1：

将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入细长赖氨酸芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃；并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能如表1所示；

所述细长赖氨酸芽孢杆菌菌剂的制备方法如实施例1。

对比例2：

将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃；并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能如表1所示；

所述芽孢杆菌菌剂的制备方法如实施例2所示。

对比例3：

将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入短芽孢杆菌菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃；并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能如表1所示；

所述短芽孢杆菌菌剂的制备方法如实施例3所示。

对比例4：

将猪粪与秸秆按重量比为1：3混匀，调节碳氮比为25：1，同时接入复合微生物菌剂，接种量按重量比3％，调节含水量为60％，定期监测温度和含水量，保持温度60℃；并加水保持堆肥含水量为60％左右，待温度明显下降时翻堆，共翻堆3次，待温度不再明显升高后，腐熟10天可制得有机肥；其各项性能如表1所示；所述复合微生物菌剂的制备方法如实施例4所示。

表1

本发明采用的细长赖氨酸芽孢杆菌、芽孢杆菌和短芽孢杆菌的的筛选与鉴定过程：

一、菌株的初筛(高温富集和高温培养)

取禽畜粪便堆肥过程中的粪样10g，在无菌条件下，放入装有100mL无菌生理盐水的250mL锥形瓶中；在50℃条件下，150r/min恒温震荡培养箱中活化富集24h；

将活化后的菌液用无菌水依次进行稀释，直至将菌液释到10

挑取大且明显的单菌落，在平板中反复划线进行分离纯化，革兰氏染色电子显微镜观察，直至没有杂菌为止。取分离纯化的菌落接种在筛选培养基平板30℃条件下培养72h。待菌落长出后，用刚果红染色0.5h，然后用1mol/L的无菌生理盐水浸泡0.5h，根据菌落产生透明水解圈直径大小，评定菌株的产酶能力。通常情况下水解圈越大，菌株的产酶能力越强(如图1)。对得到的菌株以0.7mL菌液：0.3mL甘油混匀，置于-80℃的冰箱中保存备用。

二、菌株的复筛(羧甲基纤维素酶活性测定)

将初筛所得到的纤维素降解菌接种到发酵培养基(羧甲基纤维素钠CMC-Na10.0g，硫酸铵(NH

1、葡萄糖标准曲线的绘制

取7支洗净并烘干的10mL比色管，分别加入总体积为2mL 0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.40mg/mL的葡萄糖柠檬酸混合液。然后加入1.5mL的DNS试剂，沸水浴10min，流水冲洗冷却后加入1.5mL蒸馏水定容至5mL，在540nm波长下以葡萄糖浓度为0的比色管调零，测定不同葡萄糖浓度的吸光度(图2)。

2、粗酶液的制备

取10mL发酵液，放置于洗净并烘干的50mL离心管中，在4℃条件下，5000r/min离心5min，吸取上清液即为粗酶液。

3、酶活性的测定

采用3,5-二硝基水杨酸显色法测定发酵液的酶活性，粗酶液将纤维素降解产生还原糖，还原糖可以将3,5-二硝基水杨酸的硝基还原为氨基生成新的氨基化合物，并发生使溶液变黄的显色反应。在一定的还原糖浓度条件下，混合液的颜色深度随着还原糖浓度的增大而增大，即酶活性的大小与显色反应程度呈正相关。

CMCase活力测定：取4支灭菌且烘干的10mL比色管并编号，0号管加入1.5mL柠檬酸缓冲液作为空白样，另外三支比色管分别加入1.0％ CMC-Na溶液1.5mL。向4支比色管中分别加入0.5mL粗酶液，在50℃条件下水浴30min，水浴结束后加入1.5mL DNS试剂沸水浴10min，自来水冲洗迅速冷却，加入1.5mL蒸馏水。在波长540nm条件下测定其吸光度(表2)。

表2

三、菌株的分子鉴定

选取酶活高的1#、3#和5#菌株进行测序鉴定。采用试剂盒法提取菌落DNA，分别以27F(GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGAC)作为正向和反向引物进行PCR扩增，经电泳检测，这3株菌大约在1500bp处有扩增条带。1#菌株序列如SEQ ID NO.3所示；3#菌株序列如SEQ ID NO.1所示；5#菌株序列如SEQ ID NO.2所示；用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分；将拼接好的序列在NCBI数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，1#菌株：短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)；3#菌株:细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)；5#菌株:芽孢杆菌属(Bacillussp.)。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。