一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用

技术领域

本发明属于厚皮甜瓜杂交种子纯度鉴定技术领域，尤其涉及一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用。

背景技术

种子纯度是衡量种子质量优劣的一项关键指标，甜瓜种子大多数为杂交种，在甜瓜杂交种繁殖过程中，由于去雄不彻底或花粉混杂污染、昆虫传粉等原因，使得杂交种纯度下降，种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失，也制约产业的快速发展。因此，在制种后和销售前对甜瓜F1代杂种子进行纯度鉴定是必不可少的。

目前甜瓜杂交种纯度的鉴定多采用田间种植检验方法，不仅费工耗时，用地多，且容易受季节、环境因素影响，另外有些性状肉眼难以区分，从而降低鉴定结果的可靠性。随着分子生物学技术的快速发展，品种的纯度检测工作也深入到基因水平。SSR(SimpleSequence Repeat)分子标记又称为微卫星DNA标记，即简单序列重复，SSR分子标记具有重复性好、多态性高、共显性分离、操作简单等优点，可高效、准确区分父、母本及杂交种的带型，在茄子、葡萄、花生、甘薯、水稻、玉米、番茄等种子的纯度鉴定上得到广泛应用。

蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号是宁波市农业科学研究院蔬菜研究所自主选育的厚皮甜瓜杂交一代品种，具有高糖、高产、抗病性好等特色，深受甜瓜农户欢迎。目前需探索一种可以简单、快速、准确且不受季节气候限制的品种纯度鉴定方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组，所述引物组的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1-8所示。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的SSR1引物用于鉴定蜜语佳网的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的SSR2引物用于鉴定丰登蜜25的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的SSR3引物用于鉴定甬甜7号和银蜜58的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的SSR4引物用于鉴定丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号的种子纯度。

本发明地目的之二在于提供上述SSR引物组在鉴定厚皮甜瓜杂交品种纯度中的应用。

优选地，所述应用步骤为：

(1)从甜瓜种子的下胚轴中提取甜瓜基因组DNA；

(2)以甜瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1中的引物进行PCR扩增，得扩增产物；

(3)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测；

(4)对电泳结果进行分析，比较供试杂交种及其父母本的特征条带，当母本表现为1条特征条带，父本表现为相异于母本的1条特征条带，纯合的杂交种即表现为这2条特征条带的集合，则为真正杂交种，缺少其中任意一条条带的为假杂种。

更优选地，所述步骤(2)中PCR扩增采用的反应体系包括：浓度为100ng/μL的甜瓜基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mM的dNTPs 0.5μL，20μmol/L的正向引物0.5μL、 20μmol/L的反向引物0.5μL，2U Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH

更优选地，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃终延伸5min。

更优选地，所述甜瓜品种为蜜语佳网时，所述引物SEQ ID NO.1-2的PCR扩增产物含有大小为204bp和177bp的DNA片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

所述甜瓜品种为丰登蜜25时，所述引物组SEQ ID NO.3-4的PCR扩增产物含有大小为 177bp和215bp的DNA片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

所述甜瓜品种为甬甜7号时，所述引物SEQ ID NO.5-6的PCR扩增产物含有大小为232bp 和215bp的DNA片段，则为真正杂交种，否则为假杂种。

所述甜瓜品种为银蜜58时，所述引物SEQ ID NO.5-6的PCR扩增产物含有大小为214bp 和237bp的DNA片段，则为真正杂交种，否则为假杂种。

所述甜瓜品种为丰登蜜1号时，所述引物SEQ ID NO.7-8的PCR扩增产物含有大小为229 bp和117bp的DNA片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

所述甜瓜品种为丰蜜29时，所述引物SEQ ID NO.7-8的PCR扩增产物含有大小为225bp和117bp的DNA片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

所述甜瓜品种为甬甜5号时，所述引物SEQ ID NO.7-8的PCR扩增产物含有大小为117bp和252bp的DNA片段，则为真正杂交种，否则为假杂种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明中的SSR引物组在蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号的杂种一代中能同时产生母本特异性标记和父本特异性标记，且特异性强；

(2)本发明方法可将厚皮甜瓜杂交种与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；

(3)本发明方法在种子催芽出2cm下胚轴时提取DNA进行PCR扩增，就可以进行鉴定，具有准确、快速、成本低、鉴定周期短操作简便等优点，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1蜜语佳网厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR1扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：蜜语佳网母本，P2：蜜语佳网父本；4～52：蜜语佳网杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种；

图2是实施例1丰登蜜25厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR2扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：丰登蜜25母本，P2：丰登蜜25 父本；4～52：丰登蜜25杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种；

图3是实施例1甬甜7号厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR3扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：甬甜7号母本，P2：甬甜7号父本；4～52：甬甜7号杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种；

图4是实施例1银蜜58厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR3扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：银蜜58母本，P2：银蜜58父本； 4～52：银蜜58杂交种)；

图5是实施例1丰登蜜1号厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR4扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：丰登蜜1号母本，P2：丰登蜜1号父本；4～52：丰登蜜1号杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种；

图6是实施例1丰蜜29厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR4扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：丰蜜29母本，P2：丰蜜29父本； 4～52：丰蜜29杂交种)；

图7是实施例1甬甜5号厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR4扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：甬甜5号母本，P2：甬甜5号父本；4～52：甬甜5号杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种。

具体实施方式

以下实施例中提到的蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号都可从宁波丰登种业公司购买到。

实施例1

本实施例提供一种用于鉴定蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号厚皮甜瓜杂交种子纯度的SSR引物及方法：

(1)甜瓜基因组DNA的提取与检测：

选择籽粒饱满且大小一致的蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号甜瓜杂交种各100粒和亲本(母本和父本)种子各1粒，在50℃清水中直至冷却至室温，浸种2h，然后用湿润毛巾包裹置于30℃恒温培养箱中保湿催芽，待下胚轴生长至2cm左右时，剪下每粒种子的下胚轴分别置于2ml离心管中研磨成浆，加入1000μL 的CTAB提取液，65℃水浴15min，期间颠倒混匀2～3次。加入1000μL的氯仿，剧烈震荡，在12000r/min下离心10min，重复2次，取上清液至新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇进行沉淀，12000r/min下离心10min，弃上清，用75％乙醇溶液洗涤沉淀，12000r/min 下离心5min后弃去上清，晾干底部沉淀，加入50μL去离子水，充分溶解后用Nanodrop2000 超微量分光光度计检测DNA质量。

(2)PCR扩增及检测

PCR扩增采用的反应体系包括：浓度为100ng/μL的甜瓜基因组DNA1μL，10×PCRbuffer 2.5μL，2.5mM的dNTPs 0.5μL，20μmol/L的正向引物0.5μL、20μmol/L的反向引物0.5μL， 2UTaq DNA聚合酶0.5μL，ddH

(3)步骤(2)中所用引物的具体核苷酸序列如下：

SSR1-R：5’-GGGTGGATTCACTATTTCC-3’(SEQ ID NO.1)；

SSR1-R：5’-TTAATCTGGCCGCTTATAC-3’(SEQ ID NO.2)；

SSR2-F：5’-AAAACAGAGGCAGGAATTC-3’(SEQ ID NO.3)；

SSR2-R：5’-TTTGTGGGATAAGAATTAC-3’(SEQ ID NO.4)；

SSR3-F：5’-AGACACAATTCCACAACCC-3’(SEQ ID NO.5)；

SSR3-R：5’-TCACCACACTAATCAACTG-3’(SEQ ID NO.6)。

SSR4-F：5’-CTATCTGCTATTCTCCACTTGG-3’(SEQ ID NO.7)；

SSR4-R：5’-TGAATGCCACGTAGCGAAAC-3’(SEQ ID NO.8)。

(4)电泳图条带分析

根据电泳图对杂交种进行纯度鉴定，比较供试杂交种及其父母本的特征条带，当母本表现为1条特征条带，父本表现为不同于母本的1条特征条带，纯合的杂交种即表现为这2条特征条带的集合，也就是共显性的互补带型，则为真正杂交种；非纯合的不能表现为共显性的互补带型，可能表现为母本特征条带带型，即出现了母本自交，为假杂种。然后计算种子的纯度，品种纯度＝待测甜瓜杂交种子粒群中属于目标品种的个体数/待测甜瓜杂交种子籽粒群个体数×100％。

(5)结果分析

利用引物SSR1扩增蜜语佳网及其父母本的基因组DNA，结果见图1，从图1可以清晰的看出，在蜜语佳网母本中扩增出204bp的特异性条带，父本中扩增出177bp的特异性条带，在蜜语佳网标准杂交种子的电泳图谱为同时具有母本、父本特异性标记的条带204/177bp，被检测的100粒杂交种子的电泳图谱中，有97个与蜜语佳网标准杂交种子电泳带型一致，有3个泳道的电泳带型与蜜语佳网杂交种子标准带型不一致，说明这3株为杂株，计算得出蜜语佳网杂交种子纯度为97％(表1)。

利用引物SSR2扩增丰登蜜25及其父母本的基因组DNA，结果见图2，从图2可以清晰的看出，在丰登蜜25母本中扩增出177bp的特异性条带，父本中扩增出215bp的特异性条带，在丰登蜜25标准杂交种子的电泳图谱为同时具有母本、父本特异性标记的条带177/215bp，被检测的100粒杂交种子的电泳图谱中，有98个与丰登蜜25标准杂交种子电泳带型一致，有2个泳道的电泳带型与丰登蜜25杂交种子标准带型不一致，说明这2株为杂株，计算得出丰登蜜25杂交种子纯度为98％(表1)。

利用引物SSR3扩增甬甜7号及其父母本的基因组DNA，结果见图3，从图3可以清晰的看出，在甬甜7号母本中扩增出232bp的特异性条带，父本中扩增出215bp的特异性条带，在甬甜7号标准杂交种子的电泳图谱为同时具有母本、父本特异性标记的条带232/215bp，被检测的100粒杂交种子的电泳图谱中，有99个与甬甜7号标准杂交种子电泳带型一致，有1个泳道的电泳带型与甬甜7号杂交种子标准带型不一致，说明这1株为杂株，计算得出甬甜7号杂交种子纯度为99％(表1)。

利用引物SSR3扩增银蜜58及其父母本的基因组DNA，结果见图4，从图4可以清晰的看出，在银蜜58母本中扩增出214bp的特异性条带，父本中扩增出237bp的特异性条带，在银蜜58标准杂交种子的电泳图谱为同时具有母本、父本特异性标记的条带214/237bp，被检测的100粒杂交种子的电泳图谱中，有100个与银蜜58标准杂交种子电泳带型一致，有0 个泳道的电泳带型与银蜜58杂交种子标准带型不一致，说明这0株为杂株，计算得出银蜜 58杂交种子纯度为100％(表1)。

利用引物SSR4扩增丰登蜜1号及其父母本的基因组DNA，结果见图5，从图5可以清晰的看出，在丰登蜜1号母本中扩增出229bp的特异性条带，父本中扩增出117bp的特异性条带，在丰登蜜1号标准杂交种子的电泳图谱为同时具有母本、父本特异性标记的条带229/117 bp，被检测的100粒杂交种子的电泳图谱中，有98个与丰登蜜1号标准杂交种子电泳带型一致，有2个泳道的电泳带型与丰登蜜1号杂交种子标准带型不一致，说明这2株为杂株，计算得出丰登蜜1号杂交种子纯度为98％(表1)。

利用引物SSR4扩增丰蜜29及其父母本的基因组DNA，结果见图6，从图6可以清晰的看出，在丰蜜29母本中扩增出225bp的特异性条带，父本中扩增出117bp的特异性条带，在丰蜜29标准杂交种子的电泳图谱为同时具有母本、父本特异性标记的条带225/117bp，被检测的100粒杂交种子的电泳图谱中，有100个与丰蜜29标准杂交种子电泳带型一致，有0 个泳道的电泳带型与丰蜜29杂交种子标准带型不一致，说明这0株为杂株，计算得出丰蜜 29杂交种子纯度为100％(表1)。

利用引物SSR4扩增甬甜5号及其父母本的基因组DNA，结果见图7，从图7可以清晰的看出，在甬甜5号母本中扩增出117bp的特异性条带，父本中扩增出252bp的特异性条带，在甬甜5号标准杂交种子的电泳图谱为同时具有母本、父本特异性标记的条带117/252bp，被检测的100粒杂交种子的电泳图谱中，有99个与甬甜5号标准杂交种子电泳带型一致，有1个泳道的电泳带型与甬甜5号杂交种子标准带型不一致，说明这1株为杂株，计算得出甬甜5号杂交种子纯度为99％(表1)。

表1

(6)结论

①本发明的方法可以有效进行甜瓜品种蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号杂交种及其双亲的区分，同时能够对上述甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。

②本发明的检测方法PCR耗时90min，跑胶及分析40min，本发明的检测方法在2h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。