一种抗MRSA后生元、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种抗MRSA后生元、其制备方法及应用。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株是最常见的抗生素耐药菌之一，对大多数β-内酰胺类抗生素具有耐药性，包括甲氧西林、青霉素、碳青霉烯类、头孢菌素类及其衍生物。由于其分布广泛且具有多重耐药性，已成为令人担忧的超级细菌。此外，MRSA还是一种常见的皮肤化脓感染致病菌，易通过接触传播形成流行传播，引起败血症、脓毒血症等疾病。MRSA的流行病学主要特征是流行毒株的连续出现，其居高不下的发病率和死亡率给人类健康构成了巨大威胁。

MRSA可形成具有保护作用的生物膜，阻挡抗菌剂，产生耐药性，使治疗效果变差。生物膜是附着在表面的微生物群落，它们由胞外聚合物基质的结构支持，该基质包含一种或多种胞外多糖、蛋白质和DNA，在细菌感染的持续存在中起重要作用(Journalofethnopharma-cology,2020,254:112669)。病原菌形成的生物膜在高浓度抗生素下仍能存活，导致治疗失败和感染复发(J.Pharm Res.Int,2020:87-102)，人类的大多数慢性感染是由于细菌生物膜的存在。MRSA形成的生物膜有助于其在各种环境中的持久性和传播。此外，由于细胞外基质中的渗透受限和破坏抗菌素的酶，生物膜对传统抗菌剂的敏感性较低(AppliedMicrobiology and Biotechnology,2020104(18):7957-7970)。

根据国际益生菌和益生元科学协会(ISAPP)发布的后生元共识声明，后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。后生元含有多种活性成分，包括肽聚糖、磷壁酸等菌体成分，以及维生素、有机酸、细菌素、短链脂肪酸、酶和氨基酸等活性代谢产物(Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology,2021,18(9):649-667)。根据微生物的类型、菌株和代谢产物的不同，后生元的效果也不同(Food Research International,2021,148:110595)。使用后生元有助于改善健康，迄今为止的研究表明，后生元具有免疫调节、预防感染、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病、抗高血压、抗增殖、抗突变、抗肿瘤和减少食物过敏等作用(Food Research International,2022,156:111163；Fermentation,2022,8(3):128；Nutrients,2020,12(8):2189)。后生元在宿主体内发挥预防和治疗双重作用，临床上使用后生元来缓解一系列疾病的症状，如婴儿绞痛、成人特应性皮炎和腹泻等。近年来，抗生素耐药性的出现导致治疗失败的风险增加、住院时间延长、复发和医疗保健系统成本增加(Food Science and Biotechnology,2022,31(10):1325-1334)。后生元因其高安全性、高稳定性和更长的保质期，比抗生素和化学防腐剂更具有优势，被认为是天然的免疫刺激剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗菌剂以及生长促进剂(BiointerfaceResearch in Applied Chemistry,2021,12:2629-2645)。后生元具有抑制致病菌和食物腐败菌等作用，对单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等常见的致病菌具有较好的抑菌效果(Pharmaceutics,2020,12(7):624；Openveterinaryjournal,2020,10(3):323-330)。因此，开发一种抗MRSA后生元，对于MRSA防治及其耐药性减弱具有重要价值。

发明内容

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种后生元的制备方法，步骤如下：

将副干酪乳杆菌Postbio-P6及乳酸乳球菌Postbio-F3分别接种在培养基中进行活化，菌种均进行好氧发酵，获得各菌种的活化培养物；然后将活化培养物分别接种在培养基中进行二代培养，菌种均进行好氧发酵，获得各菌种的二代培养物；将各菌种的二代培养物分别接种在同一培养基中进行复合发酵；发酵结束后，灭菌，获得后生元。

上述制备方法中，各发酵培养的发酵条件为：发酵温度为28～40℃，优选为37℃；发酵时间为18～36h，优选为24h。

上述制备方法中，复合发酵选自好氧发酵。

上述制备方法中，各菌种的接种量选自2～4％。

上述制备方法中，灭菌选自高温高压灭菌；可优选地采用121℃高温高压灭菌30min。

上述制备方法中，培养基选自液体培养基；可优选为MRS液体培养基。

本发明提供了由上述方法制备的后生元。

上述后生元被证明具有较好的MASA抑制效果。基于此，本发明提供了上述后生元在防治MASA和/或MASA引起的疾病中的应用。具体地，本发明提供了上述后生元在制备防治MASA和/或MASA引起的疾病的药物或制剂中的应用。

本发明提供了一种MASA抑制剂，该抑制剂含有上述后生元，或含有上述后生元经离心后的上清液。

上述抑制剂还可包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。所述抑制剂的剂型可选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。

上述后生元被证明能够显著降低甲氧西林对MASA的MIC值，并降低MASA对甲氧西林的耐药性；基于此，本发明提供了上述后生元在提高甲氧西林对MASA抑制效果中的应用。同时提供了上述后生元在降低MASA对甲氧西林的耐药性中的应用。

上述后生元被证明与甲氧西林之间存在协同作用。

本发明提供了一种MASA联合抑制剂，是由上述后生元与甲氧西林组成；其中，后生元与甲氧西林的配比为1:1，μL:μg。

上述联合抑制剂还可包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。所述联合抑制剂的剂型可选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。

本发明提供了上述联合抑制剂在防治MASA和/或MASA引起的疾病中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种后生元，该后生元对MRSA具有较好的抑制活性，且能够提高甲氧西林对MRSA的抑制作用，从而在MRSA抑菌、药物联用以及降低MRSA耐药性等方面存在重要应用价值。

附图说明

图1为后生元YDF对MRSA的抑菌活性；其中，A图为抑菌圈，B图为生长曲线；

图2为不同pH对后生元YDF抑菌活性的影响；

图3为后生元YDF对MRSA生物膜形成的影响；

图4为后生元YDF对MRSA的形态结构影响；其中，A图为空白对照组，B图为YDF处理组；

图5为后生元YDF对MRSA的DNA泄漏影响；

图6为后生元YDF对MRSA胞内ROS产量的影响。

具体实施方式

本发明所用试验仪器和材料，如下所示：

副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)Postbio-P6和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)Postbio-F3均来自青岛农业大学益生菌与后生元基础研究与开发应用创新实验室乳酸菌菌种库，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为CGMCC No.26237和CGMCCNo.26236，保藏日期均为2022年12月25日。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC 43300购自美国模式培养物集存库；使用前将菌种接种到LB液体培养基中，37℃培养16h活化备用。

LB肉汤培养基、MRS肉汤培养基、营养琼脂培养基(NA)购自青岛海博生物技术有限公司；活性氧检测试剂盒购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

SU5000扫描电子显微镜，株式会社日立制作所；TU-1810型可见分光光度计，普析公司；Centrifuge 5810R型冷冻离心机，Eppendorf公司；CLC111ECO型恒温培养箱MMM，Medcenter Einrichtungen GmbH公司；酶标仪，美国MD公司；生长曲线分析仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；全自动菌落分析仪，杭州迅数科技有限公司；BD FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司。

本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

后生元的制备，步骤如下：

将副干酪乳杆菌Postbio-P6及乳酸乳球菌Postbio-F3按2％接种量分别接种在MRS液体培养基中进行活化，菌种的培养条件为37℃好氧发酵24h。将活化培养物按2％接种量分别接种在MRS液体培养基中进行二代培养，培养条件同上。副干酪乳杆菌Postbio-P6及乳酸乳球菌Postbio-F3的二代培养物分别按3％、2％接种量接种在同一MRS液体培养基中进行复合发酵，发酵条件为37℃，好氧发酵24h。发酵结束后，将培养液于121℃高温高压灭菌30min，获得后生元。命名为YDF。于-20℃保存备用。

实施例2

抑菌试验：

1、抑菌圈的测定

将实施例1制备的后生元8000rpm/min离心10min，分别收集上清液和灭活菌体，上清液过0.22μm滤膜，灭活菌体用等量无菌水重悬。采用抑菌圈法分别验证上清液、灭活菌体以及混合液(后生元)对MRSA的抑菌活性。将MRSA用生理盐水稀释成1×10

2、生长曲线的测定

将MRSA用生理盐水稀释成1×10

试验结果如图1所示：

如图1A所示，上清液和混合液对MRSA均有明显的抑制作用，上清液对MRSA的抑菌圈直径为19.1±1.5mm，混合液对MRSA的抑菌圈直径为18.5±1.2mm，而灭活菌体(沉淀)无明显抑菌活性。

MRSA对不同浓度的后生元YDF的生长变化趋势，如图1B所示，未加后生元的空白对照组细菌生长呈现出典型的S型生长曲线。而添加后生元YDF能够明显抑制细菌的生长。添加12.5％后生元尽管没有完全抑制细菌的生长，但细菌的对数生长期大大推迟，而25％以上浓度的后生元完全抑制了细菌的生长。

实施例3

pH对后生元YDF抑菌活性的影响：

用5mol/L的NaOH和5mol/L的HCl分别将后生元YDF的pH值调至3、4、5、6、7、8、9，按照上述实施例2中的方法进行抑菌实验，测量并记录抑菌圈直径，分别测试不同pH对YDF抑菌活性的影响。

试验结果如图2所示：

后生元YDF在pH＝3～9范围内均具有抑菌活性。在酸性条件下(pH＝3～6)，随着pH降低，抑菌活性呈现增高趋势；而在碱性条件下(pH＝7～9)，抑菌活性呈现先升高后降低的趋势，在pH＝8时活性达到最大。此外，后生元YDF在pH＝7时仍保持较好活性，说明后生元YDF发挥抑菌作用的主要物质并不是有机酸。上述结果说明后生元YDF抑菌活性具有较宽的pH耐受范围，这对后生元YDF的实际应用具有重要意义。

实施例4

后生元YDF对MRSA生物膜形成的影响：

根据文献报道(食品研究与开发,2021,42(13):180-187)，通过结晶紫染色法测定后生元YDF对MRSA生物膜形成的抑制作用。

具体步骤如下：

在96孔平底培养板的每孔中加入100μL浓度为10

抑制率(％)＝(OD

试验结果如图3所示：

后生元YDF对MRSA生物膜的形成具有显著的抑制作用，且随着浓度的增加，对生物膜的抑制效果更强，呈现典型的浓度依赖性。而据报道，细菌的生物膜与细菌的致病性、毒力密切相关，尤其与其抗生素耐药性相关(Frontiers in Microbiology,2022)。由此可见，本发明的后生元YDF具有较好的抗MARA效果。

实施例5

菌体损伤实验：

将MRSA活化并稀释至10

试验结果如图4所示：

对照组中未经后生元处理的MRSA菌体细胞为典型的细胞结构，菌体圆型，表面圆润光滑，细胞表面完全没有破损，结构完整，而且菌体生长良好，没有聚集皱缩；而用后生元YDF处理的MRSA细胞壁和细胞膜被破坏，菌体变形并有溶解现象，细胞完整性丧失，细胞整体结构坍塌。由此可见，后生元YDF可以有效地破坏MRSA的菌体结构，对MRSA具有损伤作用，能够引起细胞内容物的泄漏。

实施例6

DNA泄漏试验：

将MRSA活化并稀释至10

试验结果如图5所示：

经后生元YDF处理后，MRSA胞内DNA出现了泄漏，说明后生元YDF破坏了MRSA细胞膜的完整性，导致细胞内容物外泄。

实施例7

MRSA氧化应激反应：

活性氧ROS是一种可参与许多细胞的生理活动的重要分子，但过量的ROS会引发氧化应激反应导致细胞损伤。细菌细胞的DNA、RNA、脂质和蛋白质对ROS敏感，过量的ROS会对这些分子造成损害，进而引起细菌凋亡。应用流式细胞仪检测后生元对MRSA胞内ROS产生的影响。离心收集10

试验结果如图6所示：

经后生元YDF处理后，MRSA的荧光强度显著增强，且随着后生元浓度的升高，荧光强度也增加，具有显著的浓度依赖性，这说明，后生元YDF可显著增加MRSA胞内ROS浓度。

实施例8

抗生素耐药性影响试验：

根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)的标准(CLSI document M27-A3.Clinical and Laboratory Standards Institute,Wayne PA,2008)，并参考文献方法(Sex Trans Dis.2017)，使用棋盘式微量液基稀释法(简称棋盘法)检测后生元YDF对MRSA的耐药性影响。

首先，测定后生元YDF和β-内酰胺类抗生素甲氧西林的最小抑菌浓度(MIC)。将MRSA活化并用LB培养基稀释成1×10

然后，测定其对MRSA的分级抑菌浓度指数(FICI)。通过棋盘式稀释法计算后生元YDF和甲氧西林联合作用于MRSA时的最小抑菌浓度(MIC)。将MRSA活化并用LB培养基稀释成1×10

根据以下公式计算FICI：

FICI＝FIC

式中，MIC

如果FICI≤0.5，两者具有协同作用；如果FICI>4，两者具有拮抗作用，如果0.5

试验结果如表1所示：

表1

后生元YDF和甲氧西林联合用药后，后生元的MIC由原来的0.78％降低至0.025％，甲氧西林的MIC由原来的0.98μg/mL降低至0.25μg/mL，而两者联用后的FICI为0.38(<0.5)，这说明，后生元YDF可以显著降低MRSA对甲氧西林的耐药性，而且与甲氧西林联合存在协同作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。