水凝胶及其制备方法和在治疗颞下颌关节骨关节炎的应用
文献发布时间:2024-04-18 19:58:21
技术领域
本发明属于颞下颌关节骨关节炎药物治疗领域,尤其涉及一种高效,微创的软骨再生修复材料,促进软骨再生,治疗骨关节炎。
背景技术
目前关于颞下颌关节骨关节炎(Temporomandibular joint osteoarthrosis,TMJOA)治疗的目标和原则是:1.减轻患者关节疼痛、肿胀等症状;2.改善关节功能;3.预防关节的进一步损伤;4.降低因此病导致残疾的发病率
基于此,TMJOA的治疗主要包括保守治疗,微创治疗及开放性手术。保守治疗只能通过药物暂时缓解疼痛症状,目前临床广泛使用天然生物修复材料透明质酸(hyaluronicacid,HA),这是正常细胞外基质中的主要成分之一,具有粘弹性、润滑性、可降解性及抗炎活性等良好的生物相容性。然而,HA体内半衰期为12-24h,存留时间短,难以持久发挥治疗作用。微创手术包括通过关节镜行盘复位术修复髁突软骨的损伤,但成人患者髁突改建能力有限,且手术难度高。颞下颌关节骨关节炎(TMJOA)晚期病变者需要行髁突切除关节置换术,手术创伤大,且重建并非生物重建,无再生潜能。
目前需要研制一种高效,微创的软骨再生修复材料以治疗颞下颌关节骨关节炎。HA为一种理想的药物缓释载体,通过负载生物活性因子以加速修复和再生OA关节组织的结构和功能,赋予天然水凝胶更佳的软骨修复效果成为一种新的治疗选择,但是现有的水凝胶材料不能满足活性物质的释放需求,因其释放周期短易出现突释药物的现象,临床上仍难避免多次注射药物的发生。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种水凝胶,用于Wnt16的局部递送,实现活性成分缓控释。
本发明的另一个目的在于提供一种水凝胶的制备方法,利于Wnt16的局部递送。
本发明的再一个目的在于提供一种水凝胶在制备治疗颞下颌关节骨关节炎的药物中的应用。
本发明的又一个目的在于提供一种水凝胶在制备治疗颞下颌关节骨关节炎的医疗器械中的应用。
近年研究发现Wnt通路在调节软骨细胞与成骨细胞的失衡,调控软骨细胞的增殖、骨化与退变方面起着重要作用。Nalesso发现Wnt16在经典的Wnt通路中发挥平衡作用,阻止通路过度激活,以维持软骨干细胞的稳态。Liu等在细胞及分子水平,发现Wnt16通过调节软骨合成及分解因子,在早期TMJOA中发挥重要作用,然而单纯外源性生物活性蛋白因易发生突释影响药效发挥。
介孔硅纳米粒子(Mesoporous Silica Nanoparticle,MSN)具有较高的比表面积和孔体积,可调的孔径范围及表面易于有机基团改性等优点等独特性能,以此作为本发明Wnt16局部递送的载体。
一种水凝胶,包括Wnt16、MSN和HA,Wnt16载于MSN内,MSN分布于HA内形成水凝胶。
MSN的平均粒径为86.53±23.74nm,为双层结构,表面具有厚度为11.99±1.34nm的介孔层,孔径为6.27nm,孔容为0.851583cm
本发明的水凝胶,其制备方法如下:
MSNs粉末以100μg/ml的浓度浸泡在100ng/ml的Wnt16溶液中,4小时后再经冷冻干燥得到负载Wnt16的MSN纳米粒,记为:Wnt16@MSN,再溶于10mg/ml的HA溶液后,即得。
为了对Wnt16实施控释,避免单纯外源性生物活性蛋白的突释影响,按如下方法制取MSN:
将0.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于48mL水中并加入3.5mL 0.2M NaOH,待溶液加热到85℃,搅拌(如:剧烈搅拌1小时)。随后,加入(如:逐滴加入)0.5mL的正硅酸乙酯(TEOS),混合溶液再搅拌1小时。MSN通过离心获得,用乙醇洗涤数遍后离心去除乙醇。MSN在HCl/甲醇(如:体积比1:20)中回流(如:24小时)以去除表面活性剂CTAB。最后,离心得到的MSN颗粒。
得到的MSN颗粒在60℃过夜真空干燥除去介孔中的溶剂,得到介孔材料。采用透射电子显微镜对MSNs的孔道结构及粒径进行分析,通过扫描电子显微镜观察材料的形貌,通过N2吸附-脱附实验测定MSNs纳米材料比表面积及孔径分布,验证出样品中存在形状规则且孔径高度均一的MSN。
经验证,本发明制得的功能性水凝胶,能持续稳定地释放Wnt16,减少软骨下骨破坏,促进软骨基质合成,显著提高软骨修复参数,利于恢复髁突高度,最终改善TMJOA下软骨细胞的生物学作用,并应用于TMJOA软骨修复。
本发明提供了一种治疗颞下颌关节骨关节炎的缓释复合材料,利用水凝胶和介孔二氧化硅材料作为载体或介质,与药物结合后进入人体使药物分子在人体内持续缓慢地释放,可与常见的支架材料如:PLA、PLGA、金属和可降解生物材料等混合,制成微针及其微针阵列于TMJOA手术中同期植入。
本发明为颞下颌关节骨关节炎的治疗提供了一种高效,微创的软骨再生修复材料,是多维度的软骨生物学和功能重建,为颞下颌关节骨关节炎的药物治疗提供新的选择策略。
附图说明
图1合成和表征Ceffe-MSN@PLGA介孔-大孔支架电镜结果图;
图2为SD大鼠TMJOA造模示意图,大鼠构建前牙单侧反牙合模型;
图3为复合材料组分Wnt16浓度筛选结果统计图,经CCK8实验检测Wnt16最佳浓度为100ng/ml;
图4为复合材料组分MSNs浓度筛选结果图,经live/dead染色检测,MSNs最佳浓度为100μg/ml;
图5为Wnt16对缓解软骨炎症体外结果图,其中,A图为以100ng/ml Wnt16培养软骨细胞24hRT-qPCR实验检测软骨炎症标志基因MMP13在转录水平上的表达结果统计图,B图为以100ng/ml Wnt16培养软骨细胞48h后RT-qPCR实验检测软骨炎症标志基因MMP13在转录水平上的表达结果统计图;
图6为Wnt16对促进软骨基质修复体外结果图,其中,A图为以各组浓度Wnt16培养软骨细胞24h后RT-qPCR实验检测软骨合成标志基因Aggrecan和Lubricin在转录水平上的表达结果统计图,B图为以各组浓度Wnt16培养软骨细胞24h后RT-qPCR实验检测软骨合成标志基因Lubricin在转录水平上的表达结果统计图;
图7为以各浓度的Wnt16培养软骨细胞24h后Western Blot实验检测软骨合成标志基因Col1a1、Sox9、Agg、Col2a1和GAPDH在蛋白水平上的表达结果图;
图8为各实验组在2周(2W)、4周(4W)和6周(6W)micro-CT结果图;
图9为体内注射复合水凝胶材料后与其它各实验组在2周(2W)、4周(4W)和6周(6W)的软骨组织学变化结果图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下:
1)N
将样品通过加热和抽真空脱气,去掉表面吸附的杂质气体,称重后放置于液氮中。在液氮温度下,在预先设定的不同压力点测定样品的N2吸附量,得到吸附等温线。计算机处理数据后从吸附等温线计算MSN的比表面积、平均孔径和孔径分布等。
2)Wnt16@MSN/HA体外释放
由于Wnt16的分子量与模板蛋白质药物牛血清蛋白(BSA)相似,将10mg的MSN放入离心管中。加入2mL BSA溶液(浓度1ug/mL),4℃浸泡过夜。过夜后吸出BSA溶液,加入PBS溶液,润洗3次,BSA溶液和PBS润洗液都收集,利用酶标仪扫描特征吸收波长下,溶液的OD值,对应标准曲线计算溶液中的BSA浓度。利用减量法,算出纳米颗粒的BSA载药量。将收集的载BSA纳米颗粒冻干,供后续使用。
将上述制备好的结合了BSA的MSN(10mg)放入1mL PBS缓冲液(pH=7.4)中,置于37℃振动培养箱中,避光轻摇。按照预设的时间点(1、2、4、6、8、10、12、24h、2d、3d、4d、5d),每次离心后取出0.2mLPBS,并添加0.2m新鲜的PBS溶液,利用酶标仪,在特征吸收波长下,测定各溶液的OD值,根据标准曲线计算BSA浓度,绘制BSA的累计释放曲线。根据公式计算得出:
3)与软骨细胞共培养实验
sw1353软骨肉瘤细胞的培养:使用含10%FBS、1%双抗的DMEM/f12培养液放入37℃、CO
将复合材料内各组分按规定浓度与软骨细胞进行共培养,live/dead活死染色检测其生物相容性。
4)细胞增殖,软骨生成相关基因及蛋白的检测实验
收集细胞,调整细胞悬液浓度至约×10
用TRIzol试剂在sw1353细胞中提取总RNA。为检测软骨合成标志基因col2、sox9,软骨炎症基因MMP13等的表达,用QuantiTect反转录试剂盒合成cDNA,再用SYBR Premix ExTaq进行qRT-PCR实验。
用Ripa试剂在sw1353细胞中提取总蛋白。经过蛋白电泳、转膜、抗体孵育、曝光过程后对软骨合成标志蛋白col2、sox9,软骨炎症蛋白MMP13等的表达进行检测。
5)构建大鼠前牙反颌致颞下颌关节骨关节炎模型
构建大鼠前牙反颌致颞下颌关节骨关节炎模型(见图2),体内验证复合功能水凝胶的治疗作用。
大鼠左侧上下切牙粘结金属套筒冠,其中左下切牙的金属套筒冠有一与其长轴呈135度唇向倾斜的平面导板,使左侧切牙呈反向咬合,而右侧切牙咬合正常。
对照组采用同样的处理方法和饲养条件,但不粘结左上下切牙的金属套筒冠,直至实验结束。
6)Micro-CT扫描
分别待SD大鼠药物注射处理2、4、6周龄后,处死大鼠,对下颌骨进行取材。下颌骨标本使用MicroCT机(德国布鲁克公司)进行扫描。
7)组织学切片染色实验
大鼠处死后分离下颌骨并放入4%多聚甲醛中固定72h后,10% EDTA脱钙液脱钙处理,共脱钙10周,进行常规石蜡包埋、切片、HE染色番和红O/固绿染色,在显微镜下观察各组髁突组织病理形态。
8)统计
所有实验数据以均数±标准差表示,使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey's HSD检验进行统计学分析,检验水准(α)为0.05。
实施例1制取MSN
将0.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于48mL水中并加入3.5mL 0.2M NaOH,待溶液加热到85℃,剧烈搅拌1h。随后,逐滴加入0.5mL的正硅酸乙酯(TEOS),混合溶液再搅拌1h。MSN通过离心获得,用乙醇洗涤数遍后离心去除乙醇。MSN在HCl/甲醇(体积比1∶20)中回流24小时以去除表面活性剂CTAB。最后,离心得到的MSN在60℃过夜真空干燥除去介孔中的溶剂,得到介孔材料。采用透射电子显微镜对MSNs的孔道结构及粒径进行分析,通过扫描电子显微镜观察材料的形貌,通过N2吸附-脱附实验测定MSNs纳米材料比表面积及孔径分布,验证出样品中存在形状规则且孔径高度均一的MSNs(见图1)。
SEM显示MSN颗粒表面有孔,形态规整,分散良好,粒径均一,MSNs颗粒的平均粒径为86.53±23.74nm。SEM显示颗粒表面有孔,TEM显示颗粒为双层结构,表面具有厚度为11.99±1.34nm的介孔层;BJH法得到纳米材料的孔径为6.27nm,孔容为0.851583cm
实施例2制取Wnt16@MSN透明质酸水凝胶
首先在室温下,将25μg的Wnt16溶于25ml的磷酸盐缓冲液(PBS,PH=6.3),获得浓度为1μg/ml的浓缩液。将25mg的MSNs粉末浸泡在Wnt16溶液中,4h后转移到-20摄氏度冷冻,12h后进行冷冻干燥,得到负载Wnt16的MSN纳米粒。然后依据实验需要,取适量该复合物溶解于10mg/mlHA溶液中,以配制成各组分所需的浓度要求。体外以10ng/ml IL-1β处理sw1353软骨肉瘤细胞以模拟骨关节炎炎症环境,复合材料通过各组分与软骨细胞分别共培养,进行细胞增殖,凋亡,软骨生成相关基因及蛋白的检测实验,包括CCK8、RT-qPCR、Western Blot等实验,从而筛选出最佳MSN与Wnt16浓度分别为100μg/ml及100ng/ml。
实施例3释放实验
由于Wnt16的分子量与模板蛋白质药物牛血清蛋白(BSA)相似,将10mg的MSN放入离心管中。加入2mL BSA溶液(浓度1μg/mL),4℃浸泡过夜。过夜后吸出BSA溶液,加入PBS溶液,润洗3次,BSA溶液和PBS润洗液都收集,利用酶标仪扫描特征吸收波长下,溶液的OD值,对应标准曲线计算溶液中的BSA浓度。利用减量法,算出纳米颗粒的BSA载药量。将收集的载BSA纳米颗粒冻干,供后续使用。
将上述制备好的结合了BSA的MSN(10mg)放入1mL PBS缓冲液(pH=7.4)中,置于37℃振动培养箱中,避光轻摇。按照预设的时间点(1、2、4、6、8、10、12、24h、2d、3d、4d、5d),每次离心后取出0.2mLPBS,并添加0.2m新鲜的PBS溶液,利用酶标仪,在特征吸收波长下,测定各溶液的OD值,根据标准曲线计算BSA浓度,绘制BSA的累计释放曲线。根据公式计算得出:
实施例4体内生物相容性
以每孔1×10^4个的密度将sw1353xibao接种于24孔板中,24h细胞贴壁后,吸去原培养基,加入复合材料继续培养2d,2d后加入活-死细胞染色液,37℃下孵育30min,使用正置荧光显微镜在490nm和535nm荧光激发下观察活细胞(绿色)和死细胞(红色)形态和数量。
实施例5促进软骨再生
通过体外IL-1β诱导模拟OA环境,RT-PCR结果显示Wnt16蛋白显著降低了IL-1β诱导的软骨基质降解标志基因MMP13的表达水平并促进软骨修复相关基因(Aggrecan,Lubricin,Col2和Sox9)的表达(见图3-5),在Western blot检测结果也有类似结果(见图6)。这表明Wnt16在TMJIOA的进展中可扮演促进软骨修复,抑制基质降解的重要作用。
Wnt16@MSNs/HA载药体系,有利于控制Wnt16的释放,维持软骨细胞的稳态。
实施例6动物实验
上下前牙每组3只(6侧关节),共45只,分五组,即1)假手术组;2)TMJOA;3)HA;4)HA+Wnt16;5)Wnt16@MSNs/HA。除TMJOA组外,其余组OA术后一周开始行双侧颞下颌关节腔内注射给药,假手术组为生理盐水(50μl/侧),每周给药直至观察时间点。分别于UAC术后2,4,6周后,对这三个时间点的大鼠TMJ取材,行Micro-CT扫描、HE、番红O/固绿及IHC,免疫荧光染色,观察对大鼠髁突形态的影响。
Micro-CT结果显示,Wnt16@MSN/HA功能性水凝胶给药组随时间变化,OA由骨小梁稀疏至致密并呈现融合,有骨赘形成,部分吸收到软骨下骨深层。Wnt16@MSN/HA给药组的骨皮质连续,骨小梁排列规则,改善软骨下骨骨小梁的细微结构(见图7)。
Wnt16@MSN/HA给药组恢复软骨厚度及数量,各层结构清晰,与假手术组接近,可恢复软骨基质合成,改善髁突组织学形态。如图8所示,经验证,本实施例提供的复合水凝胶材料具有对软骨的体内调控作用,随时间变化,OA组大鼠髁突结构由骨小梁稀疏至致密并呈现融合,有骨赘形成,部分吸收到软骨下骨深层。Wnt16@MSN/HA组骨皮质连续,骨小梁排列规则,改善了软骨下骨骨小梁的细微结构,图中箭头处为TMJOA造模组骨皮质破坏。如图9所示,髁突切片HE染色正常髁突软骨细胞分层排列。与假手术组比较,OA组软骨层细胞排列紊乱,层次不分明,本实施例的Wnt16@MSNs/HA水凝胶复合材料组恢复软骨厚度,各层结构清晰。
由此,通过Micro-CT扫描分析和组织学切片染色等方法进一步证实,复合功能性水凝胶可促进软骨基质合成,改善髁突组织学形态,减少髁突凋亡及软骨内成骨。
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