一种有机磷农药检测多肽探针及其制备与应用

技术领域

本发明属于农药检测领域，涉及多肽探针，尤其涉及一种有机磷农药检测多肽探针及其制备与应用。

背景技术

农药是农业中使用的一种关键物质，能使水果、蔬菜以及粮食作物的产量显著提高。其中，有机磷农药(organophosphorus pesticide，OPs)，其用量约占全国农药总用量的80％，是果蔬等农产品的主要农药残留类型。然而，由于OPs的半衰期较长，使用不当，会对农产品、环境和水系统等会造成严重污染。同时，OPs也是一种神经毒素，即使在低浓度下也会阻碍胆碱酯酶的活性，这对消费者的健康也构成危害。因此，OPs检测技术的开发和发展，对食品安全以及人类健康具有重要的科学意义。

目前为止，检测OPs残留量的常用方法有气相色谱法、高效液相色谱法、色谱分离结合质谱检测等，但这些技术通常在分析前需要有相对复杂的程序或预处理过程。而目前在实际应用中常见的酶检测法，由于乙酰胆碱酯酶来源的不同、有机磷农药种类的不同、酶活性的不同，均会明显影响检测的响应值，在实际应用中，也会出现“假阳性”或“假阴性”的结果。与之相比，基于荧光信号的OPs探针检测具有快速、准确、高效的特点，在实际应用检测中具有重要的应用前景。其中，与常见的荧光探针分子相比，聚集诱导发光(AIE)是一种近年来开发的新型荧光形式，可有效克服其他常见荧光分子存在的荧光淬灭、发光性质不稳定等问题。

此外，在实际检测中，样品中往往会残留多种有机磷农药分子，其对食品安全均具有十分严重的潜在危害。然而，目前已报导开发的大部分OPs检测探针仅可同时对一种或者少数几种有机磷农药分子产生信号响应。

由此，开发快速、准确、高效、可实现对多种OPs同时检测的OPs检测探针及相应检测技术，已成为农药检测与食品安全等领域关注的重要方向之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、准确、高效、可实现对多种OPs同时检测的OPs检测多肽探针及其制备与应用。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种有机磷农药检测多肽探针，包括TPE-W、TPE-Wpc、TPE-Wxi、TPE-Wbp多肽荧光探针中的一种或多种；

其中，TPE-W多肽荧光探针为N端TPE基团修饰的多肽，序列结构式为TPE-RRMEHRMEW；

TPE-Wpc、TPE-Wxi、TPE-Wbp多肽荧光探针为N端带有TPE基团的锍盐修饰多肽，序列结构式分别如下：

上述序列结构中：TPE为4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯甲酸，R为精氨酸，M为甲硫氨酸，E为谷氨酸，H为组氨酸，W为色氨酸。

作为本发明的优选方式之一，所述TPE-W、TPE-Wpc、TPE-Wxi、TPE-Wbp多肽荧光探针可分别与有机磷农药结合，形成相应纳米粒子，所述纳米粒子具有AIE荧光。

一种上述有机磷农药检测多肽探针的制备方法，当所述多肽探针为TPE-W多肽荧光探针时，方法如下：

(1)多肽固相合成：

称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入DMF，鼓氮气溶胀；加入含吗啡啉的DMF，鼓氮气，脱去Fmoc保护基团；用DMF和DCM交替洗涤树脂，将配好的Fmoc-Ala-OH溶液、HATU溶液以及DIPEA混匀后加入树脂中鼓氮气；去除反应液，用DMF和DCM交替洗涤树脂；按上述方法进行脱保护，接下一个氨基酸；

接下来的氨基酸与上述方法相同；接到最后一个氨基酸后，用DMF和DCM交替洗涤树脂；

(2)在利用固相多肽合成法得到多肽Fmoc-RRMEHRMEW后，将树脂沉浸于吗啡啉溶液中，氮气吹鼓；用DCM和DMF交替洗涤后，加入偶联反应液；氮气吹鼓过夜，并用DCM和DMF交替洗涤后，再用甲醇洗涤；吹干树脂，等待下一步操作；

(3)用剪切液将多肽从树脂上切下来，用干燥的氮气吹干剪切液，再补加超纯水与乙腈，等待下一步操作；

(4)多肽纯化：

将反应后的反应液过滤后，用超纯水和乙腈作为流动相，用高效液相色谱进行纯化分离。

作为本发明的优选方式之一，所述偶联反应液的组成为：TPE-COOH 1.2eq，HOBt3.0eq，PyBOP 3.0eq，NMM 8.0eg，溶解于DMF溶液中。

作为本发明的优选方式之一，所述剪切液由三氟乙酸、三异丙基硅烷和超纯水制成，且三者体积比为9.5：0.25：0.25。

一种上述有机磷农药检测多肽探针的制备方法，当所述多肽探针为TPE-Wpc、TPE-Wxi、TPE-Wbp多肽荧光探针时，方法如下：

利用纯化后的TPE-W多肽，用超纯水和乙腈溶解，并加入对应的修饰试剂和甲酸，避光反应；其中，TPE-Wpc的修饰试剂为1，2-二溴甲基苯；TPE-Wxi的修饰试剂为反式-1,4-二溴-2-丁烯；TPE-Wbp的修饰试剂为4,4-双(溴甲基)-1,1-联苯；

将反应后的反应液过滤后，用超纯水和乙腈作为流动相，用高效液相色谱进行纯化分离；经LC-MS进行鉴定后，冷冻干燥，置于-20℃保存。

一种上述有机磷农药检测多肽探针在有机磷农药快速检测领域中的应用。

作为本发明的优选方式之一，所述多肽探针针对多种不同类型的OPs，实现响应检测。

作为本发明的优选方式之一，所述多肽探针针对多种不同类型的OPs，进行定量分析。

作为本发明的优选方式之一，所述多种不同类型的OPs包括辛硫磷、丙溴磷、三唑磷、杀螟松、乐果、敌百虫这些常见的有机磷农药分子。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)本发明设计的TPE-W、TPE-Wpc、TPE-Wxi、TPE-Wbp多肽荧光探针，可以对多种不同类型的有机磷农药分子(包括：辛硫磷、丙溴磷、三唑磷、杀螟松、乐果、敌百虫等)产生强烈的AIE荧光响应，且不会对氨基甲酸酯类、有机氯等其他类型的农药产生荧光响应，可用于多种不同类型OPs的定性及定量分析，可作为简便、快速、准确、高效的新型有机磷农药快速检测方法；

(2)本发明提供的多肽探针不需要引入任何非天然氨基酸，仅通过简便的多肽修饰方法(双卤代烃、1％甲酸)，即可高效制备得到相应的TPE多肽探针。

附图说明

图1是实施例1中TPE-W多肽荧光探针的具体化学结构式以及MS图(图中，A图为化学结构式；B图为MS图)；

图2是实施例2中TPE-Wpc多肽荧光探针的具体化学结构式以及MS图(图中，A图为化学结构式；B图为MS图)；

图3是实施例3中TPE-Wxi多肽荧光探针的具体化学结构式以及MS图(图中，A图为化学结构式；B图为MS图)；

图4是实施例4中TPE-Wbp多肽荧光探针的具体化学结构式以及MS图(图中，A图为化学结构式；B图为MS图)；

图5是实验例1中多肽荧光探针对不同浓度OPs的荧光响应照片；

图6是实验例2中TPE-W多肽荧光探针与不同浓度OPs的荧光响应分析结果图(图中，A图为荧光光谱图；B图为480nm处荧光响应线性回归曲线图)；

图7是实验例2中TPE-Wpc多肽荧光探针与不同浓度OPs的荧光响应分析结果图(图中，A图为荧光光谱图；B图为480nm处荧光响应线性回归曲线图)；

图8是实验例2中TPE-Wxi多肽荧光探针与不同浓度OPs的荧光响应分析结果图(图中，A图为荧光光谱图；B图为480nm处荧光响应线性回归曲线图)；

图9是实验例2中TPE-Wbp多肽荧光探针与不同浓度OPs的荧光响应分析结果图(图中，A图为荧光光谱图；B图为480nm处荧光响应线性回归曲线图)；

图10是实验例2中TPE-Wpc多肽荧光探针与不同类型有机磷类、氨基甲酸酯类以及有机氯类农药在480nm处的荧光响应结果图；

图11是实验例2中TPE-Wbp多肽荧光探针与不同类型有机磷类、氨基甲酸酯类以及有机氯类农药在480nm处的荧光响应结果图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。同时，本发明所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。

实施例1

TPE-W多肽荧光探针的制备：

所述TPE-W多肽荧光探针为N端TPE基团修饰的多肽，序列结构式为TPE-RRMEHRMEW。

按照标准的-Fmoc的固相多肽合成技术，用MBHA树脂将多肽合成在树脂上，以制备。

具体制备步骤为：

(1)多肽固相合成：

称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，鼓氮气溶胀40min。加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基酰胺(DMF)溶液，鼓氮气40min，脱去Fmoc保护基团。用DMF和DCM交替洗涤树脂3次，每次1min，将配好的Fmoc-Ala-OH(5eq，0.4M，DMF)溶液，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(4.9eq，0.38M，DMF)溶液，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(7.0eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。去除反应液，用DMF和DCM交替洗涤树脂3次，每次1min，按上述方法进行脱保护，接下一个氨基酸。

接下来的氨基酸与上述方法相同。接到最后一个氨基酸后，用DMF和DCM交替洗涤树脂3次，每次1min。

(2)在利用固相多肽合成法得到多肽Fmoc-RRMEHRMEW后，将树脂沉浸于50％的吗啡啉溶液中，氮气吹鼓30min，重复操作一次。用DCM和DMF交替各洗涤3次后，加入偶联反应液(TPE-COOH 1.2eq，HOBt 3.0eq，PyBOP 3.0eq，NMM 8.0eg溶解于DMF溶液中)，氮气吹鼓过夜后，用DCM和DMF交替洗涤后，再用甲醇洗涤。吹干树脂，等待下一步操作。

(3)用剪切液(三氟乙酸TFA，三异丙基硅烷TIPS和超纯水，v：v：v＝9.5：0.25：0.25)将多肽从树脂上切下来(每100mg树脂加1mL剪切液，常温剪切2h)。用干燥的氮气吹干剪切液，再补加一定量超纯水与乙腈(v：v＝6：4)，等待下一步操作。

(4)多肽纯化：

将反应后的反应液过滤后，用超纯水和乙腈作为流动相，直接用高效液相色谱进行纯化分离。

本实施例TPE-W多肽荧光探针，其具体化学结构式和MS图如图1所示。

实施例2

TPE-Wpc多肽荧光探针的制备：

所述TPE-Wpc多肽荧光探针为N端带有TPE基团的锍盐修饰多肽，序列结构式如下：

具体制备步骤为：

(1)将纯化后的TPE-RRMEHRMEW(即实施例1制备的TPE-W多肽荧光探针)用超纯水和乙腈(v：v＝6：4)溶解，加入1，2-二溴甲基苯(5.0eq，作为修饰试剂)与1％的甲酸，避光反应12h。

(2)将反应后的反应液过滤后，用超纯水和乙腈作为流动相，直接用高效液相色谱进行纯化分离，并经LC-MS进行鉴定后，冷冻干燥，置于-20℃保存。

本实施例TPE-Wpc多肽荧光探针，其具体化学结构式和MS图如图2所示。

实施例3

TPE-Wxi多肽荧光探针的制备：

所述TPE-Wxi多肽荧光探针为N端带有TPE基团的锍盐修饰多肽，序列结构式如下：

具体的合成、制备步骤为：

(1)将纯化后的TPE-RRMEHRMEW(即实施例1制备的TPE-W多肽荧光探针)用超纯水和乙腈(v：v＝6：4)溶解，加入反式-1,4-二溴-2-丁烯(5.0eq，作为修饰试剂)与1％的甲酸，避光反应12h。

(2)将反应后的反应液过滤后，用超纯水和乙腈作为流动相，直接用高效液相色谱进行纯化分离，并经LC-MS进行鉴定后，冷冻干燥，置于-20℃保存。

本实施例TPE-Wxi多肽荧光探针，其具体化学结构式和MS图如图3所示。

实施例4

TPE-Wbp多肽荧光探针的制备：

TPE-Wbp多肽荧光探针为N端带有TPE基团的锍盐修饰多肽，序列结构式如下：

具体制备步骤为：

(1)将纯化后的TPE-RRMEHRMEW(即实施例1制备的TPE-W多肽荧光探针)用超纯水和乙腈(v：v＝6：4)溶解，加入4,4-双(溴甲基)-1,1-联苯(5.0eq，作为修饰试剂)与1％的甲酸，避光反应12h。

(2)将反应后的反应液过滤后，用超纯水和乙腈作为流动相，直接用高效液相色谱进行纯化分离，并经LC-MS进行鉴定后，冷冻干燥，置于-20℃保存。

本实施例TPE-Wbp多肽荧光探针，其具体化学结构式和MS图如图4所示。

实验例1

本发明多肽探针对OPs的荧光响应探究：

本发明中所合成的多肽荧光探针(以TPE-Wpc为例)，当加入极少量的OPs(以丙溴磷为例)时，通过紫外灯光照射就可以观察到明显的荧光信号，荧光强度受OPs的浓度调节。在500μg多肽溶液中加入0、10、30、50、75、100、150、200μmol/L(测定体系终浓度)的丙溴磷，可以观察到荧光信号呈现不同的强度(图5)。

需要注意的是，对于常见的有机磷农药，其分子核心骨架化学结构相似，与核酸分子的磷酸基团也相似，由此选择以丙溴磷为例进行研究。

实验例2

多肽荧光探针简便、快速检测农药的残留量：

1、首先，利用TPE-W多肽荧光探针(125μg)与0、10、30、50、100、150μmol/L(测定体系终浓度)等不同浓度梯度的OPs(以丙溴磷为例)结合产生荧光效应，作出荧光光谱图(Ex＝365nm,Em＝480nm)，并以在480nm处的荧光强度绘制标准曲线(图6)。空白样品平行测定三次，检出限采用正态分布统计模型计算，公式为LOD＝y+ks

2、由于锍盐修饰后会增强TPE-W多肽荧光探针的正电性，增强多肽荧光探针与丙溴磷之间的结合，因此先后考察TPE-Wpc、TPE-Wxi、TPE-Wbp三条多肽荧光探针对于丙溴磷的检出限。

使用TPE-Wpc、TPE-Wxi、TPE-Wbp三种锍盐修饰多肽(125μg)分别与不同浓度丙溴磷结合产生荧光效应，作出荧光光谱图(Ex＝330nm,Em＝480nm)，并以在480nm处的荧光强度绘制标准曲线(分别如图7、图8、图9所示)。得到检出限分别为：TPE-Wpc，2×10

以上可以得出锍盐修饰后的多肽探针，如TPE-Wpc检出限比未修饰的TPE-W检出限更低，因此锍盐修饰后的多肽荧光探针较修饰前更适用于实际样品中的检测。

3、考察本发明检出限相对较为灵敏的多肽荧光探针TPE-Wpc、TPE-Wbp(125μg)对有机磷农药(丙溴磷Profenofos、三唑磷Triazophos、敌百虫Fenitrothion、辛硫磷Phoxim、乐果Dimethoate、杀螟松Trichlorfon)、氨基甲酸酯类农药(异丙威Isoprocarb、西维因Carbaryl)以及有机氯类农药(4,4-DDT、三氯杀螨砜Tetradifon)(其中，TPE-Wpc对应农药添加量为40μL 4mmol/L，TPE-Wbp对应农药添加量为20μL 4mmol/L)的荧光图谱(480nm处响应值)。

TPE-Wpc多肽荧光探针对不同种类的农药响应结果如图10所示，TPE-Wbp多肽荧光探针对不同种类的农药响应结果如图11所示，可以得出：本发明荧光探针对大部分有机磷农药都有很好的响应效果，而对于氨基甲酸酯类以及有机氯类的农药响应效果低，这种原因可能是TPE-多肽-氨基甲酸酯比TPE-多肽-OPs纳米粒子的疏水性更低，由于本发明用到的氨基甲酸酯类如西维因和异丙威的疏水性基团(甲基、酯基)就比OPs少，同时也证明了本发明对OPs检测的特异性。

实验例3

实际样品检测：

选取白菜与生菜作为样品，添加不同量的丙溴磷10和100μmol/L(测定体系终浓度)，通过多肽荧光探针(TPE-Wpc)检测OPs，得到回收率(表1)。该多肽荧光探针对OPs检测具有实际应用可行性，同时具有操作简便、灵敏度高、耗材少、稳定性好等优点，将成为一种有潜力的OPs光学传感器。

表1实际样品加标回收

上述实验例结果考察了本发明多肽荧光探针对OPs的检测性能、准确度、精密度以及实际应用可行性，结果表明：本发明多肽探针能够满足真实样品的分析需求；该荧光探针具有稳定性高、环境友好、制备简便等特点，可应用于OPs的定性及定量分析，可作为简便、快速、准确、高效的新型有机磷农药快速检测方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。