利用粘红酵母发酵生产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素的方法

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及利用粘红酵母发酵生产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素的方法。

背景技术

单细胞蛋白(SCP)是以单细胞或多细胞微生物(如细菌、酵母、霉菌和藻类)为来源的蛋白质粗品或精制品的总称，又称菌体蛋白。单细胞蛋白除高蛋白含量(约占细胞干重的60-82％)外，还含有脂肪、碳水化合物、核酸、维生素和矿物质等，具有极高的营养价值，主要作为蛋白质源用于人类或动物营养。更重要的是与传统的牲畜和作物来源的蛋白质来源相比，SCP生长速度快、可代谢的底物范围广、加工成本低、对水或可耕地的需求更少，对气候的依赖性更低。因此为了解决因资源枯竭环境影响所带来的蛋白质需求大幅增长的问题，为了提高可持续性并保证富含蛋白质的动物饲料成分的自给自足，单细胞蛋白(SCP)作为一种替代性的食物蛋白质来源正引起人们的关注。

粘红酵母是一种产油酵母，目前主要应用于微生物油脂和β-胡萝卜素的生产，粘红酵母生长速率快、营养要求简单，发酵工艺易于调控，菌体可综合利用，易于进行大规模培养，具有很高的应用价值和开发前景。

然而，目前利用粘红酵母同时生产单细胞蛋白、微生物油脂和β-胡萝卜素的技术有待开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了利用粘红酵母发酵生产单细胞蛋白的方法，利用本发明的方法具有高产粘红酵母、高产单细胞蛋白、发酵速度快、效率高、成本低等优点，可用于规模化生产，商业价值高。

本发明提出了一种利用粘红酵母发酵生产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将粘红酵母种子液接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵产物；收集所述发酵产物中的单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素；其中，所述发酵培养基中含有碳源和氮源，C/N比为5～150，碳源浓度为20～100g/L。

本发明的发明人研究发现，粘红酵母在含有碳源和氮源的环境中可以生长并生产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素，但是提高某一产物的产量容易出现另一产物产量的降低，因此，若能够实现同时高产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素，将极大地提高粘红酵母的利用价值。

发明人经深入研究发现，发酵培养基中碳源和氮源的比例以及碳源浓度会影响粘红酵母的产量和SCP、油脂和β-胡萝卜素产量，需要兼顾粘红酵母自身生长和产SCP水平，不当的条件会造成粘红酵母生长旺盛以致菌体产量高，但是SCP、油脂和β-胡萝卜素产量不佳；不当的条件也会不利于粘红酵母生长代谢，导致菌体产量、SCP产量、油脂和β-胡萝卜素均不佳。当C/N比为5～150，碳源浓度为20～100g/L时，可以实现高产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素，整体的生产效率和产能高，发酵速度快，成本低。

在本发明中，本发明的术语“C/N”是指发酵培养基中碳元素和氮元素含量之比，本发明所描述的发酵培养基中物质的浓度，主要是指其初始浓度。

根据本发明的实施例，上述利用粘红酵母发酵生产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，发酵培养基中C/N比为15～25，碳源浓度为35～80g/L。由此，可以进一步提高单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素产量，发酵速度较快，生产效率高。

根据本发明的实施例，碳源选自葡萄糖、淀粉、农作物和木质纤维素类生物质中的至少一种；优选葡萄糖。发明人在对碳源进行研究时发现，采用上述碳源，尤其是葡萄糖，可以有效地提高单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素产量。

根据本发明的实施例，氮源选自酵母粉、蛋白胨、玉米浆和豆粕中的至少一种，优选酵母粉。发明人在对氮源进行研究时发现，采用上述氮源，尤其是酵母粉，可以有效地提高单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素产量。

根据本发明的实施例，所述发酵培养基包括：葡萄糖35～80g/L，优选葡萄糖55～75g/L；酵母粉1～20g/L，优选酵母粉10～15g/L。发明人经过大量实验得到上述较佳组成，由此，可以有效地提高单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素产量，发酵速度较快，生产效率高。

根据本发明的实施例，所述发酵培养基的pH值为5.0～7.5。发明人发现，发酵培养基的pH值会影响粘红酵母生长代谢，进而影响其产量及单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素产量。进一步地，发明人经过深入研究发现，当pH值为5.0～7.5时，可以进一步提高单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素产量，发酵速度较快，生产效率高。

根据本发明的实施例，所述发酵培养基进一步含有：MgSO

根据本发明的实施例，所述发酵培养基中含有葡萄糖65g/L、酵母粉13g/L、MgSO

根据本发明的实施例，所述发酵培养的发酵罐通气量为1～10vvm，优选2～6vvm。粘红酵母是在有氧条件下生长，当采用上述通气量可以使粘红酵母更好地生长代谢，发酵速度快，从而有助于更好地产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素。

根据本发明的实施例，所述发酵培养的温度为20～40℃，转速为150～450rpm。由此，有助于粘红酵母更好地生长代谢。

根据本发明的实施例，所述发酵培养选自摇瓶发酵培养或发酵罐发酵培养；

所述摇瓶发酵培养的温度为30℃，转速为180rpm；

所述发酵罐发酵培养的温度为30℃，转速为400rpm，通气量为4vvm。

发明人经过大量实验得到上述较佳发酵条件，由此，可以进一步同时提高单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素产量。

根据本发明的实施例，所述粘红酵母种子液中菌浓度为1～4g/L，接种量为2％～10％。由此，有助于粘红酵母更好地生长代谢。

根据本发明的实施例，所述粘红酵母种子液的制备方法包括：将斜面上的粘红酵母接种到种子培养基中，在25～35℃摇床培养18～30h，摇床转速为150～200rpm。由此，可以获得活性较高的粘红酵母，有助于其生长代谢，高产单细胞蛋白、油脂和β-胡萝卜素。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例1的生物量标准曲线图；

图2显示了根据本发明实施例1的SCP蛋白粉实物图；

图3显示了根据本发明实施例1的发酵结果分析图；

图4显示了根据本发明实施例2的发酵结果分析图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、培养基

活化培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，水，pH＝5.5。

斜面培养基：葡萄糖20g/L，琼脂18g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，水，pH＝5.5。

种子培养基：葡萄糖15g/L，酵母粉1g/L，Na

发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，MgSO

2、实验步骤

粘红酵母在30％甘油中保存于-80℃冰箱，解冻后取1mL接种于50mL三角瓶中，装有10mL灭菌活化培养基，三角瓶用6层纱布封口。在30℃摇床中培养24h，摇床转速180rpm。用接种环蘸取一环活化后的菌液接种于斜面培养基，在30℃培养箱中培养24h。用接种环取一环斜面上的菌体接种到500mL三角瓶中，装有100mL种子培养基中，在30℃在摇床中培养24h，摇床转速180rpm。将培养好的种子液(菌浓2g/L)取10mL接种到500mL摇瓶中，装有90mL发酵培养基，发酵温度30℃，转速180rpm。发酵过程中每隔12h取样检测，具体检测方法如下：

(1)生物量

取1mL发酵菌液于已称重的1.5mL离心管中，8000r/min离心5min，弃去上清液，采用无菌水洗涤菌体3次，倒去上清，90℃烘干至恒重，称量，计算生物量(g/L)(图1)。

(2)蛋白质测定

将发酵菌液在8000r/min离心5min，弃去上清液，采用无菌水洗涤菌体3次，倒去上清，90℃烘至恒重，测定其质量。根据GB/T 6432—2018方法检测蛋白含量。

式中：

X―样品中的蛋白质含量(g/100g)；

V

V

c―硫酸标准溶液的浓度(mol/L)；

0.0140―与1mL硫酸标准溶液(c(1/2H

m―样品的质量(g)；

V

F―蛋白质折算系数(F＝6.25)；

100―换算系数。

蛋白质浓度＝菌体生物量×菌体蛋白质含量，单位为g/L。

(3)油脂测定

取3ml发酵液离心收集菌体，加入1ml 4mol/L盐酸，振荡混匀，75℃水浴处理2h，冷却后加入2倍体积氯仿∶甲醇(1∶1)提取液，充分振荡混匀后，以8500r/min离心5min，用移液枪吸取氯仿层至玻璃瓶，65℃烘干挥发除去氯仿即得粗油脂。

油脂产量(g/L)＝(干燥后的玻璃瓶总重(g)-玻璃瓶重(g))/3mL

油脂含量(％)＝100％×油脂产量(g/L)/菌体干重(g/L)

发酵后生物量浓度达到17.12g/L，蛋白含量达到40.19％，蛋白质浓度达到6.88g/L，β-胡萝卜素含量为34.4μg/g干细胞，油脂产量2.33g/L，油脂含量13.61％(图3)。

实施例2

1、培养基

活化培养基、斜面培养基、种子培养基：同实施例1。

发酵培养基：葡萄糖35g/L，酵母粉4g/L，MgSO

2、实验步骤

粘红酵母在30％甘油中保存于-80℃冰箱，解冻后取1mL接种于50mL三角瓶中，装有10mL灭菌活化培养基，三角瓶用6层纱布封口。在30℃摇床中培养24h，摇床转速180rpm。用接种环蘸取一环活化后的菌液接种于斜面培养基，在30℃培养箱中培养24h。用接种环取一环斜面上的菌体接种到500mL三角瓶中，装有100mL种子培养基中，在30℃在摇床中培养24h，摇床转速180rpm。将培养好的种子液(菌浓2g/L)按10％接种量接种到500mL摇瓶中，装有90mL发酵培养基，发酵温度30℃，转速180rpm。发酵过程中每隔12h取样，检测细胞干重、残糖浓度和蛋白质含量，进一步计算蛋白质浓度，发酵后生物量浓度达到10.56g/L，蛋白含量达到33.79％，蛋白质浓度达到3.57g/L，β-胡萝卜素含量为4.67μg/g干细胞，油脂产量为1.5g/L，油脂含量14.21％(图4)。

实施例3

在该实施例中，研究发酵培养基中不同碳氮比对粘红酵母生长及单细胞蛋白产量的影响，具体培养基和实验步骤参考实施例1，其中，发酵培养基中葡萄糖浓度为35g/L，酵母粉浓度如表1所示。

结果如表1所示，当发酵培养基中酵母粉浓度为1～7g/L(相应的C/N为20～140)时，粘红酵母生长状态较佳，SCP、油脂和β-胡萝卜素产量较高。其中，酵母菌浓度为7g/L(C/N为20)时，发酵整体效果较佳。

表1不同碳氮比对粘红酵母生长及单细胞蛋白产量的影响

实施例4

在该实施例中，研究发酵培养基中不同葡萄糖浓度对粘红酵母生长及单细胞蛋白产量的影响，具体培养基和实验步骤参考实施例1，其中，发酵培养基中葡萄糖浓度和酵母粉浓度如表2所示，C/N为20。

结果如表2所示，当发酵培养基中葡萄糖浓度为35～80g/L时，粘红酵母生长状态较佳，SCP、油脂和β-胡萝卜素产量较高。其中，葡萄糖浓度为65g/L时，发酵整体效果较佳。结合实施例5的研究，确定摇瓶培养的发酵培养基最佳组成如下：葡萄糖65g/L，酵母粉13g/L，MgSO

表2不同葡萄糖浓度对粘红酵母生长及单细胞蛋白产量的影响

实施例5

1、培养基

活化培养基、斜面培养基、种子培养基：同实施例1。

发酵培养基：葡萄糖35g/L，酵母粉7g/L，MgSO

2、实验步骤

粘红酵母在30％甘油中保存于-80℃冰箱，解冻后取1mL接种于50mL三角瓶中，装有10mL灭菌活化培养基，三角瓶用6层纱布封口。在30℃摇床中培养24h，摇床转速180rpm。用接种环蘸取一环活化后的菌液接种于斜面培养基，在30℃培养箱中培养24h。用接种环取一环斜面上的菌体接种到500mL三角瓶中，装有100mL种子培养基中，在30℃在摇床中培养24h，摇床转速180rpm。将培养好的种子液(菌浓2g/L)按10％接种量接种到2L发酵罐中，装有900mL发酵培养基，发酵温度30℃，转速400rpm，通气量为2vvm、3vvm、4vvm、6vvm，发酵过程中用NaOH和HCl调节pH恒定在6.5。发酵过程中每隔12h取样，检测细胞干重、残糖浓度和蛋白质含量，进一步计算蛋白质浓度。

结果如表3所示，当发酵罐的通气量为2～6vvm时，粘红酵母生长状态较佳，SCP、油脂和β-胡萝卜素产量较高。其中，发酵罐的通气量为4vvm时，发酵整体效果较佳。

表3不同通气量对粘红酵母生长及单细胞蛋白产量的影响

实施例6

1、培养基

活化培养基、斜面培养基、种子培养基：同实施例1。

发酵培养基：葡萄糖35g/L，酵母粉7g/L，MgSO

2、实验步骤

粘红酵母在30％甘油中保存于-80℃冰箱，解冻后取1mL接种于50mL三角瓶中，装有10mL灭菌活化培养基，三角瓶用6层纱布封口。在30℃摇床中培养24h，摇床转速180rpm。用接种环蘸取一环活化后的菌液接种于斜面培养基，在30℃培养箱中培养24h。用接种环取一环斜面上的菌体接种到500mL三角瓶中，装有100mL种子培养基中，在30℃在摇床中培养24h，摇床转速180rpm。将培养好的种子液(菌浓2g/L)按10％接种量接种到2L发酵罐中，装有900mL发酵培养基，发酵温度30℃，转速400rpm，通气量为3vvm，发酵过程中不控制pH、控制pH值为5.5、6.0、6.5、7.0。发酵过程中每隔12h取样，检测细胞干重、残糖浓度和蛋白质含量，进一步计算蛋白质浓度。

结果如表4所示，当发酵培养基的pH值为5.5～6.5时，粘红酵母生长状态较佳，SCP、油脂和β-胡萝卜素产量较高。其中，发酵培养基的pH值为6.0时，发酵整体效果较佳。

表4不同pH值对粘红酵母生长及单细胞蛋白产量的影响

实施例7

1、培养基

活化培养基、斜面培养基、种子培养基：同实施例1。

发酵培养基：葡萄糖65g/L，酵母粉13g/L(C/N为20)，MgSO

2、实验步骤

粘红酵母在30％甘油中保存于-80℃冰箱，解冻后取1mL接种于50mL三角瓶中，装有10mL灭菌活化培养基，三角瓶用6层纱布封口。在30℃摇床中培养24h，摇床转速180rpm。用接种环蘸取一环活化后的菌液接种于斜面培养基，在30℃培养箱中培养24h。用接种环取一环斜面上的菌体接种到500mL三角瓶中，装有100mL种子培养基中，在30℃在摇床中培养24h，摇床转速180rpm。将培养好的种子按10％接种量接种到2L发酵罐中，装有900mL发酵培养基，发酵温度30℃，转速400rpm，通气量为4vvm，发酵过程中控制pH6.0。发酵72h取样，检测细胞干重和蛋白质含量，进一步计算蛋白质得率，发酵后生物量浓度达到20.38g/L，蛋白含量达到57.36％，β-胡萝卜素含量为86.36μg/g干细胞，油脂产量8.39g/L，油脂含量13.2％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。