一种多功能酵母水解物及其制备方法

技术领域

本发明涉及酵母水解物、功能性保健品领域，具体涉及一种多功能的酵母水解物，其制备方法和应用。

背景技术

酵母细胞营养丰富，在中国已有几千年使用历史，其含有丰富的蛋白质、维生素矿、多糖等物质，可以促进机体生长发育消化吸收，并且其中的多糖可以促进有益菌增生，被大量用于食品、饲料、酿酒饮料、药物、美容以及水处理领域中。例如CN109423449B公开了一种硒酵母水解物及其制备方法，通过选择高硒酵母菌发酵获得，并用多种酶结合进行酶解，获得可用作饲料产品的水解物。CN106659217B公开了一种低麸质酵母水解物，用于食品领域。

酵母水解物是酵母酶解产物，含有多种成分，通过自溶、化学处理、酶解等方法获得。然而自溶法需要的时间较长，条件苛刻，化学处理会带来有机试剂并引发蛋白质变质变性，机械方法需要耗能，使用不同的复合酶成分进行酶解也是一种生物方法，不同的酶比例和PH及作用时间，产物有差异性，风味也因此不同。但酵母水解物的制备通常都是需要长时间保持温度PH稳定的，并且通常需要在酶解过程中补充酶和缓冲液，保持体系反应和稳定。多糖和蛋白质成分虽然是酵母重要的营养物质，也常常导致免疫激活和一些不必要的过敏反应， 虽然作为食品饮料饲料其具有独特的营养价值和风味，然而在作为功能辅料使用时很困难，一是菌体有活性，通常用于肠道菌群平衡，易于发酵难以在药物中使用，二是酵母水解后物容易被吸收、失活降解或者被体内酶水解。

肿瘤细胞转移是导致癌症死亡的主因，癌转移是指原发灶的肿瘤细胞通过淋巴或血液循环进入其他组织形成新的继发肿瘤，严重降低了患者生存概率。放疗化疗手术都只能治疗肿瘤原发部位残存癌细胞阻止其扩散，但不能长期使用放化疗方法，由于癌症的特征就是细胞体内不受控制地生长导致基本器官侵袭和死亡。因此在术后有效控制癌细胞的扩散转移，从最早的源头抑制其对周围血管淋巴的浸润是具有实际意义的策略。

对于医疗应用的水凝胶开发可以追溯到几十年前，目前对其合成和特性进行了一些专项研究，多用于吸收材料、生物医学工程或药物载体等（参见CN103494668B），水凝胶通常由交联剂制备，作为包含三维网络结构的高分子体系，容易收到环境影响降解，并且加入有机溶剂容易产生毒性副作用，限制了其在生物医学材料方面的应用。

发明内容

发明人通过优化酵母水解复合酶配方及其工艺，生产了一种基本不含酵母菌细胞壁来源多糖的具有保健功效的水解物产品，水解物通过选择特定复合酶在特定条件下制备而成，又可以通过水凝胶自组装系统，具有保健和载体的双重作用，过滤的残渣可作为饲料独立包装，另外在细胞试验中发现水解物对基底血管具有保护作用，显示出对肿瘤转移复发的抑制效果，在功能性食品饮料和癌症患者康复具有应用前景。并且在酶水解过程中通过高分子载体介入解决了酵母团聚吸附，酶解时间较长，体系需要复杂控制才能保持PH稳定的问题，基本不含有机溶剂，且具有独特香气，易于消费者接受。

具体技术方案包括：

提供一种酵母水解物，其特征在于，按重量计，酵母细胞壁来源的多糖成分不高于1%，总氨基酸不低于50%，多肽（或称为小分子肽）成分大于等于20%且不高于35%，核酸不低于10%，矿物质成分≥1%，其中酵母细胞壁来源的多糖为甘露聚糖和葡聚糖，本发明水解物基本不含甘露聚糖和葡聚糖，以及其水解的多糖产物，特别是不含水溶性β-葡聚糖。优选地，以重量计，总氨基酸中精氨酸、色氨酸和赖氨酸含量≥20%，进一步≥25%、30%、35%。例如在酵母水解物中总氨基酸含量为50%的情况下，精氨酸、色氨酸和赖氨酸的总和占酵母水解物的10 %或更高，占总氨基酸含量的20%或更高；优选，总氨基酸≥55%，小分子多肽≥26%，核酸≥11%。

使用如下复合酶水解：皱褶假丝酵母脂肪酶，胰蛋白酶、精氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺转氨酶和β-葡聚糖酶，其中β-葡聚糖酶在复合酶中的比重≤10重量%，更优选介于2%至8%；复合酶的载体为MOFs（即金属有机框架，也称作多孔配位聚合物），所述MOFs金属框架选自UiO-66，MIL-101或ZIF-8，优选UiO-66（C

制备方法包括如下步骤，

1）酵母培养：将酵母接入含培养液的酵母池中，室温下培养得到的扩增的酵母菌液，干燥；其中酵母选自酿酒酵母，布拉酵母，酿酒酵母优选啤酒酵母；培养液可以为常规的（例如市售的培养基，内含葡萄糖、氨基酸、胰蛋白胨等），或加入额外的氮源、碳源，或根据所需保健功能加入相应的营养生长因子等，扩增可以为指数扩增，一级种子液继二级种子扩增，可以选择适宜温度，例如20-80℃，优选30-60℃，扩增5-72h，优选12-48h，可以进入发酵罐中保温。其中优选地，估算加水量，使调配后的酵母池中酵母乳浓度为10～15%，并均匀搅拌。随后干燥。

2）装载复合酶载体：

将金属框架材料（可称为MOF或MOFs，也称为MOFs多孔材料）清洗，去除杂质，悬浮于乙醇溶液或水溶液中，将复合酶溶液缓慢滴加到MOF悬浮液中，搅拌过夜，离心后干燥即得。其中去除杂质的方法包括但不限于水冲洗，超声洗净，乙醇溶液清洗或浸泡后冲洗。载体可以通过加入缓冲液活化位点，包括但不限于磷酸盐（例如磷酸二氢钠），PH优选6-7，MOFs悬浮液优选使用乙醇溶液或水溶液作为溶剂，水溶液可加入少量NaCl或其电解液，乙醇溶液优选50%或更高浓度；复合酶滴加过程速率优选10ml/min或更低，以一定速度轻搅拌，优选搅拌速率低于50rpm，使得酶均匀分布于内孔位点。温度为室温或25-35℃；时间优选为10h-36h；来源于皱褶假丝酵母（Lipase from Candida rugosa）的脂肪酶，胰蛋白酶、精氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺转氨酶和β-葡聚糖酶的重量比为2：2：2：2：1：1：1。β-葡聚糖酶≤10wt%，优选≤5wt%，使得其在帮助破壁的同时减少大分子蛋白和多糖的降解，便于后续去除。其中复合酶和载体的重量比为1-3：1，优选1：1，进一步地，酶解过程中不需要额外加入补充酶和缓冲液，体系能够保持稳定PH（具有电解液性质）并且酶反应位点均匀彻底。

3）获取水解物：

将酵母菌加入适量水，配制成悬浮液，导入装载有复合酶的MOFs金属框架的反应器中，PH稳定在6-6.5之间，加热水解1-24h，超声震荡并过滤，取滤液加热灭酶，浓缩干燥，获得水解物。其中PH自然稳定，不需要额外检测或添加缓冲液成分，加热温度35-70℃，优选40-65℃，反应时间大于6h，优选6-18h，更优选8h。可以加入少量电解液，反应时间优选6h；也可以少量通电，通过电导和渗透压，促进酶解反应，由于酶和酵母菌均匀分布内孔位点，且具有置换离子控制PH稳定，避免酵母及其产物的吸附团聚和反应体系PH移动问题，反应更为彻底。优选超声震荡方法，加速反应，更有选地使用真空干燥过滤，真空加压为10毫巴-100压力，优选20-80毫巴，更优选40-60毫巴，还可以联合或单独使用过滤膜进行过滤，包括但不限Pellicon2 Biomax5kDa超滤膜包对分离后的滤液进行超滤。滤液取上清液，加热或化学工艺灭酶，优选加热灭酶，加热温度60-100℃，优选80℃，时间10-30min。干燥方法可以为真空干燥、冻干或喷雾干燥。

滤渣经出料后滚筒干燥，粉碎机粉碎后另行处理。

在一个优选技术方案中，本发明的酵母水解物可以工业化生产，由于流程简单可控，酶解步骤可以不用加酶，水解时间也缩短，PH较稳定。在载体注入后开启蒸汽阀门，搅拌加热，控制料液温度，在酶解一定时间后与过滤岗位联系通知放料即可。

浓缩过程可以如下操作：循环泵、出料泵、及冷凝水泵先进冷却水，进入定量的料液，开真空水力喷射泵，调节真空度，开启进气阀门，开始浓缩。调节进料量和蒸汽阀门，控制一效温度为85±10℃，二效温度为75±10℃，三效温度为65±10℃。待产品已达到工艺技术要求前，应放出少量料液，用波美度计测量浓度，确认达到18-25Bx（固形物浓度25～45%）时出料，送下一步干燥工序。

对于滤渣的处理，具体而言，将滤渣打入滚筒，滚筒已被预热，根据干燥程度调节滚筒转速和蒸汽用量。滚筒干燥所得的片粉状滤渣自然放冷后装入编织袋中。收集到一定量后再进行烘干、粉碎、检验、包装，其中富含多糖和蛋白质成分，可以做饲料使用。

通过HPLC、凝胶电泳或氨基酸分析仪检测产物。

本发明还提供了一种功能性水凝胶，可作为保健品食品或辅助药物载体使用，其特征在于含有所述的酵母水解物以及透明质酸，通过自组装形成水凝胶，防止水解物聚集和过快释放防止酶水解产物聚集吸附，可通过海盐水（氯化钠含量不低于3.5%）进一步固化交联形成三维立体以符合不同需求；其中透明质酸溶解于缓冲液中，加入酶水解产物交联，缓冲液优选磷酸盐，最优选磷酸二氢钠溶液，优选的，水解产物中不含葡聚糖和甘露聚糖，含有≥50%的总氨基酸，进一步地，亲水凝胶可以自组装形成，加入海盐水可提高水凝胶固化度，优选地，加盐水之前的亲水凝胶可作为化妆品载体外用，也可饮用，作为食品添加剂使用，可作为手术材料使用，粘性大于100mPa.s, 更优选大于120mPa.s, 小于500mPa.s，最优选在100-200 mPa.s之间，加入盐水后粘性大于500 mPa.s，优选大于650 mPa.s，更优选在650-1000 mPa.s之间。

为保持酵母水解物的均匀分布，优选搅拌滴加入透明质酸缓冲液溶剂中，并将酵母水解物配置为浓度1-5%的溶液，

具体制备方法为：

1）酵母水解物，配置为2%的浓度，溶剂为水，加入适量磷酸二氢钠溶液。取透明质酸加入磷酸盐缓冲液中，配置为2%的溶液，PH5.5-6.5。

2）将上述酵母水解物溶液缓慢加入透明质酸溶液中，使其均匀分布，两者比例1：1-3，轻微搅拌，形成流体，如果过于黏稠无法形成流体，可加速搅拌或加入少量水稀释。

3）如需要进一步固化，可加入浓度大于3.5%的海盐水（即NaCl含量大于3.5%），可使得流体水凝胶交联固化，增加水凝胶粘附性，并缓慢释放其中的水解物成分。

4）检测上述水凝胶的粘性和缓释性能，使用粘度计测量加入海盐水前后水凝胶粘性，将含有酵母水解物-透明质酸自组装水凝胶及加入海盐水后的水凝胶置于模拟体液缓冲液中，加入海盐水至凝胶粘性大于500mPa.s， 在36℃下孵育，不同时间点（1h至72h）从模拟体液中取样，检测其中氨基酸和多肽的含量（%），以获取模拟实际情况下水凝胶释放产物数据。

进一步地，本发明提供一种保健品，包括上述可食用的水凝胶，所述保健品可以为中成药或营养保健品，可以为饮料、酸奶、果冻、口香糖等形式。

进一步地，本发明提供一种化妆品，包括上述水凝胶，及其他化妆品成分。

进一步，本发明还提供了一种制药应用，即上述酵母水解物在制药物中的应用，具体而言为酵母水解物-透明质酸自组装水凝胶体系。所述应用表明酵母水解物-透明质酸自组装水凝胶可以在手术中、手术前、手术后使用，优选和化疗药物前后惯续使用，也可以单独使用。所述酵母水解物-透明质酸自组装水凝胶中，酵母水解物和透明质酸的质量百比为1：1-3，优选1：2。

其中，本发明复合酶中的胰蛋白酶、精氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺转氨酶和β-葡聚糖酶均购自广州伟伯科技有限公司；

皱褶假丝酵母脂肪酶，又称为来源于皱褶假丝酵母（Lipase from

MOFs金属框架购自美国DuPont公司, 其中UiO-66化学式 C

布拉酵母菌YT-35（

啤酒酵母菌株于2016年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为 CGMCC No.13500。

布拉酵母菌购自武汉克米克生物医药技术有限公司，样品在无菌生理盐水溶解稀释后进行培养，DNA检测显示与编号CGMCC No.940的布拉酵母菌YT-35（

本发明术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句"包括……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。本发明所述室温指15-25℃，本发明除特殊说明，所有的%均代表重量百分比，除非另有说明，本发明溶液即代表水溶液。

本发明的有益效果：

1）本发明收到贝壳类生物粘附原理的启发，将水解物中来源于细胞壁的多糖类成分（主要为葡聚糖和甘露聚糖）去除（用作高蛋白饲料），制备的水解产物可以和透明质酸形成自凝胶系统，可局部应用或保健食品中加入，对黏膜有吸附作用，具有特殊香气，患者易于耐受，即提供了营养物质和保健成分又作为自组装载体的一部分。

2）改进了酵母水解工艺，使用特定复合酶使得细胞壁高分子多糖易于分离，减少糖激酶使用，增加了氨基酸获取酶的使用，复合酶载体的纳米金属框架，克服了酵母菌和复合酶反应位点易于团聚吸附的问题，加快反应时间，并且可通过电解液导电更加加速反应时间和增强反应力度，在后续的水解体系中PH保持稳定，工业化进程可控并得到简化。

3）本发明的水解物可以显著改善血管异质性，下调基质金属蛋白酶MMP2，避免周围基质的降解从而减少肿瘤细胞进入血管中。在癌症患者术后康复保健，防止癌症转移复发等领域中具有广泛前景。

附图说明

图1：制备流程简图

图2：酵母水解物制备工艺流程图

图3：MMP-2浓度抑制效果

具体实施方式

实施例1：

1）酵母培养获得扩增的酵母菌：

将布拉酵母接入培养液中，室温下培养48h，将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，继续接种于二级种子罐，实现指数扩增，得到的酵母液过滤干燥即得；

2）装载复合酶载体，将MOFs金属框架材料（UiO-66（Zr）纳米颗粒）浸入乙醇溶液中（≥75%）进行清洗，去除杂质，真空干燥后检测，其比表面积为800m²/g，孔径≤20纳米。加入5%磷酸二氢钠溶液活化，配置MOFs悬浮液，PH在6.5-7之间，加入复合酶，复合酶：MOFs载体=1：1（重量），来源于皱褶假丝酵母（Lipase from Candida rugosa）的脂肪酶，胰蛋白酶、精氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺转氨酶和β-葡聚糖酶的重量比为2：2：2：2：1：1：1，将复合酶溶液缓慢滴加到MOFs悬浮液中，搅拌（25rpm），加入少量电解质，形成渗透压促进酶在MOFs孔径内吸附，过夜，离心分离后干燥即得。

3）获取水解物，将扩增的酵母菌加入适量水，配制成15%的悬浮液，导入装载有复合酶的MOFs（UiO-66）金属框架纳米颗粒的反应器中，PH稳定在6-6.5之间，必要时可加入电解液和电极以加速进 程，在40-55℃温度范围内水解至少6h，超声震荡并通过40毫巴压力真空过滤，取滤液加热至80℃以上，20min灭酶，浓缩干燥，获得水解物。进一步检测。

滤渣经出料后滚筒干燥，粉碎机粉碎后可用作饲料另行处理。

检测方法：

使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该水解产物，HPLC的条件如下：

·分离管柱：Asahipak HPLCcolumn GS-320(30℃、7.5mm×300mm)

·流动相：0.1M磷酸钠缓冲液(pH值为7.0)

·流速：1.0mL/min

·检测：紫外线检测器(260nm)

使用聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)，进行电泳检测水解产物的蛋白质特性，将NuPAGEMES迁移缓冲液进行蛋白质迁移， SeeBluePlus2用作分子量标记，使用考马斯蓝R-250进行蛋白质染色，在过滤残渣中检测到高分子蛋白质、葡聚糖和甘露聚糖成分，在水解过滤液中上述成分为0.05%。

核酸参考《饲料中总磷的测定分光光度法》(GB/T6437)测定。

肽含量使用氨基酸分析计(日立高速氨基酸分析计L-8900)测定全部氨基酸和游离氨基酸，将全部氨基酸减去游离氨基酸得到的值设为肽含量。

检测结果主要为氨基酸、多肽、核酸和矿物质成分，使用HPLC 分析氨基酸中以色氨酸、精氨酸和赖氨酸含量最多。各成分含量如下（重量计）：总氨基酸 55%，多肽 28%，核酸12%，矿物质4%。其中色氨酸含量3%，精氨酸含量15%，赖氨酸含量15%。

实施例2：

1）酵母培养：

将啤酒酵母接入培养液中，室温下培养48h，将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，继续接种于二级种子罐，实现指数扩增，得到的酵母液过滤；

2）装载复合酶载体，将MOFs金属框架材料（UiO-66（Zr）纳米颗粒）浸入乙醇溶液中（≥75%）进行清洗，去除杂质，真空干燥后检测，其比表面积为800m²/g，孔径≤20纳米。加入10%磷酸二氢钠溶液活化，配置MOFs悬浮液，PH在6.5-7之间，加入复合酶，复合酶：MOFs载体=1：1（重量），来源于皱褶假丝酵母（Lipase from

3）获取水解物，将扩增的酵母菌加入适量水，配制成10%悬浮液，导入装载有复合酶的MOFs（UiO-66）金属框架纳米颗粒的反应器中，PH稳定在6-6.5之间，必要时可加入电解液和电极以加速进程，搅拌加热，在40-55℃温度范围内水解至少6h，超声震荡后与过滤岗位联系通知放料，粗滤去除载体，取上清滤液加热至80℃以上，20min灭酶，使用Pellicon 2（Biomax 5kDa）型超滤膜包（P2B005A05，购自上海登宁科技有限公司）对分离后的滤液进行超滤，除去高分子量物质来纯化水解产物，上清滤液浓缩干燥，即得。出料残渣加入滚筒粉碎后做饲料处理。进一步检测水解产物，检测方法同实施例1，其中总氨基酸 54%，小分子多肽 21%，核酸19%，矿物质4%。其中色氨酸含量13%，精氨酸含量10%，赖氨酸含量11%，多糖及高分子量蛋白质含量0%。

浓缩过程可以如下操作：循环泵、出料泵、及冷凝水泵先进冷却水，进入一定量的料液，开真空水力喷射泵，调节真空度，开启进气阀门，开始浓缩。调节进料量和蒸汽阀门，控制一效温度为85±10℃，二效温度为75±10℃，三效温度为65±10℃。待产品已达到工艺技术要求前，应放出少量料液，用波美度计测量浓度，确认达到18-25Bx（固形物浓度25～45%）时出料，送下一步干燥工序。

对于滤渣的处理，具体而言，将滤渣打入滚筒，滚筒已被预热，根据干燥程度调节滚筒转速和蒸汽用量。滚筒干燥所得的片粉状滤渣自然放冷后装入编织袋中。收集到一定量后再进行烘干、粉碎、检验、包装，其中富含多糖和蛋白质成分，可以做饲料使用。

实施例3:

制备水凝胶

1）取实施例1得到的酵母水解物，配置为2%的浓度，溶剂为水，加入适量磷酸二氢钠溶液。取透明质酸加入磷酸盐缓冲液中，配置为2%的溶液，PH5.5-6.5.

2）将上述酵母水解物溶液缓慢加入透明质酸溶液中，使其均匀分布，两者比例1：1-3，轻微搅拌，形成流体，如果过于黏稠无法形成流体，可加速搅拌或加入少量水稀释。

3）加入浓度大于3.5%的海盐水（即NaCl含量大于3.5%），可使得流体水凝胶交联固化，增加水凝胶粘附性，并缓慢释放其中的水解物成分。

4）检测上述水凝胶的粘性和缓释性能，使用粘度计测量加入海盐水前后水凝胶粘性，分别为121mPa.s和876mPa.s，将含有酵母水解物-透明质酸自组装水凝胶及加入海盐水后的水凝胶置于模拟体液缓冲液中，加入海盐水至凝胶粘性大于500mPa.s， 在36℃下孵育，不同时间点（1h至72h）从模拟体液中取样，检测其中氨基酸和多肽的含量（%），以获取模拟实际情况下水凝胶释放产物数据。结果参见表1.其中加入海盐水前的水凝胶是有透明质酸和酵母水解物自组装形成的， 加入海盐水后，粘性增加，分别以水凝胶(前)（后）表示。

表1

对比例1

1）酵母培养获得扩增的酵母菌：

将布拉酵母接入培养液中，室温下培养48h，将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，继续接种于二级种子罐，实现指数扩增，得到的酵母液过滤干燥即得；

2）装载复合酶载体，将MOF金属框架材料（UiO-66（Zr）纳米颗粒）浸入乙醇溶液中（≥75%）进行清洗，去除杂质，真空干燥后检测，其比表面积为800m²/g，孔径≤20纳米。加入磷酸二氢钠溶液活化，配置MOF悬浮液，PH在6.5-7之间，加入复合酶，复合酶：MOF载体=1：1（重量），加入β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、糖化酶、内切酶、外切酶和磷酸二酯酶，其成份及其重量份数为：β-葡聚糖酶为1份，甘露聚糖酶为10份，糖化酶为20份，内切酶为15 份，外切酶为1 份，磷酸二酯酶为 10份。，将复合酶溶液缓慢滴加到MOF悬浮液中，搅拌（25rpm），加入少量食盐，形成渗透压促进酶在MOF孔径内吸附，过夜，离心分离后干燥即得。

3）获取水解物，将扩增的酵母菌加入适量水，配制成悬浮液，导入装载有复合酶的MOFs（UiO-66）金属框架纳米颗粒的反应器中，PH稳定在6-6.5之间，必要时可加入电解液和电极以加速进程，在40-55℃温度范围内水解至少6h，超声震荡并通过40毫巴压力真空过滤，取滤液加热至80℃以上，20min灭酶，浓缩干燥，获得水解物。进一步检测。

检测方法同实施例1，各成分含量如下（重量计）：总氨基酸 35%，小分子多肽 16%，核酸11%，矿物质4%，葡聚糖15%，甘露聚糖16%。

对比例2

1）酵母培养：

将啤酒酵母接入培养液中，室温下培养48h，将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，继续接种于二级种子罐，实现指数扩增，得到的酵母液过滤；

2）将发酵液过滤后超声处理40min，加热至45℃保温4h，升温煮沸15min得到自溶酵母液。降温至50℃，调整PH（使用磷酸盐缓冲液）至5.5-6，缓慢加入复合木瓜蛋白酶1份，核酸酶1份，谷氨酰胺转氨酶1份，碱性蛋白酶2份，中性蛋白酶1份，二肽酶2份，50℃以上酶解35h，期间需要多次加入缓冲液调节PH至5.5-6，并持续加入上述复合酶成分。将水解液升温至80℃，15min灭酶处理后离心分离取上清液。将上清液经过蒸发浓缩为 40%以上固含量的浓缩液，将浓缩液通过喷雾干燥制成水含量不高于6%的粉状产品，

进一步检测。检测方法同实施例1，其中蛋白的含量13wt％，核酸的含量18wt％，酵母细胞壁多糖21wt％，多肽含量19wt%，灰分矿物质含量4wt％，总氨基酸含量21%。

对比例3

1）酵母培养：

将啤酒酵母接入培养液中，室温下培养48h，将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，继续接种于二级种子罐，实现指数扩增，得到的酵母液过滤；

2）将发酵液过滤后超声处理40min，加热至45℃保温4h，升温煮沸15min得到自溶酵母液。降温至50℃，调整PH（使用磷酸盐缓冲液）至5.5-6，缓慢加入复合酶，复合酶为来源于皱褶假丝酵母（Lipase from Candida rugosa）的脂肪酶，胰蛋白酶、精氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺转氨酶和β-葡聚糖酶，重量比为2：1：2：2：2：1：1，过夜，离心分离后干燥即得。50℃以上酶解，期间检测PH不稳定，需要每1h补充缓冲液维持PH稳定，并且酶团有聚集现象，随时间延长后续导致反应率降低，需要加大搅拌力度，但同时影响反应体系的稳定性，15h后检测样液，氨基酸含量过低（≤21.5%），继续补充复合酶反应过夜（12h），将水解液升温至80℃，15min灭酶处理后离心分离取上清液。使用Pellicon2Biomax5kDa超滤膜包对分离后的滤液进行超滤，除去高分子量物质来纯化水解产物。将上清液经过蒸发浓缩为 40%以上固含量的浓缩液，将浓缩液通过喷雾干燥制成水含量不高于6%的粉状产品，

进一步检测。检测方法同实施例1，其中蛋白的含量2.3wt％，核酸的含量12wt％，酵母细胞壁多糖1.8wt％，多肽含量19wt%，灰分矿物质含量4wt％，总氨基酸含量49%，精氨酸含量9.5%，色氨酸含量9%，赖氨酸含量8.9%。

由于该实施例没有采用酶载体，反应过程延长，具有酶团聚现象，反应位点不均，体系稳定性较差，需要PH调控和补充复合酶。

对比例4

1）酵母培养获得扩增的酵母菌：

将布拉酵母接入培养液中，室温下培养48h，将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，继续接种于二级种子罐，实现指数扩增，得到的酵母液过滤干燥即得；

2）装载复合酶载体，将MOF金属框架材料（UiO-66（Zr）纳米颗粒）浸入乙醇溶液中（≥75%）进行清洗，去除杂质，真空干燥后检测，其比表面积为800m²/g，孔径≤20纳米。配置MOF悬浮液，加入复合酶，复合酶：MOF载体=1：1（重量），加胰蛋白酶、精氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺转氨酶和β-葡聚糖酶的重量比为2：2：2：1：1：0.5，将复合酶溶液缓慢滴加到MOF悬浮液中，搅拌（25rpm），加入少量食盐，形成渗透压促进酶在MOF孔径内吸附，过夜，离心分离后干燥即得。

3）获取水解物，将扩增的酵母菌加入适量水，配制成悬浮液，导入装载有复合酶的MOFs（UiO-66）金属框架纳米颗粒的反应器中，PH稳定在6-6.5之间，必要时可加入电解液和电极以加速进程，在40-55℃温度范围内水解至少6h，超声震荡并通过40毫巴压力真空过滤，取滤液加热至80℃以上，20min灭酶，浓缩干燥，获得水解物。进一步检测。

检测方法，同实施例1，各成分含量如下（重量计）：总氨基酸45%，小分子多肽 29%，核酸24%，矿物质1%，多糖0.5%。

将上述对比例依照实施例3的方法制备水凝胶系统，由于对比例1-2流体粘度过低，并无法通过加入Nacl交联，无法形成自组装系统。与其含有大量多糖成分，并且氨基酸组分不同有关。对比例3-4虽然可以形成水凝胶体系，但释放较快，和海盐水的交联不够充分，其释放产物即使固化后也不够稳定，检测方法和实施例3相同。海盐水交联后检测氨基酸及多肽指标，表明其置换释放效果不良，数据如下表2所示：

表2

空白组：如下试验中的空白组为使用市售的酵母水解物产品（例如购自安琪酵母公司）.

试验：

1）肿瘤细胞迁徙抑制

采用人类鼻咽癌细胞HONE-1，在Transwell孔板上加入HONE-1细胞悬液，下方加入培养诱导因子，诱导细胞迁徙，孔板放置在培养箱中进行孵育，细胞可以自上孔通过微孔膜向下迁移。孵育15d后取出孔板，固定和染色细胞，观察计数经过孔膜迁移的细胞数量。设置实施例1+化疗药物顺铂、实施例2+顺铂、实施例1、化疗药物组（顺铂）、对比例1-4以及空白组共9个组，进行平行试验（对比例3因为水解物滴入后数天出现团聚和吸附，造成细胞数量不具备统计学意义，因此剔除）。结果可见实施例1-2＋顺铂组、化疗药物和实施例1组具有显著抑制效果。

2）金属蛋白酶MMP-2下调效果。

准备琼脂糖凝胶基质多孔板，加入QXLtm520荧光底物和MMP-2，将上述9组待测样品分别依实施例3方法制备水凝胶体系（由于对比例2无法形成凝胶体系，且具有较高的蛋白质成分，难于控制无菌因此剔除），加入海盐水适度交联后滴加入基质孔板中，孵育在36℃，40%湿度条件的培养箱中，1，3，7day后使用荧光分析仪检测底物降解产生的荧光信号，根据荧光信号强度分析各组对MMP2活性下调的影响效果。

结果参见图3.

根据上述实验结果看，实施例1-2单独使用或是和化疗药物联合使用，在抑制肿瘤细胞迁移和对周围基质降解引发转移方面都具有显著的效果，可能与其中含有的氨基酸或多肽成分有关，肿瘤细胞在缺乏氧气的环境中减少了肿瘤血管相关生成，肿瘤细胞的迁移伴随上皮细胞转换，粘素蛋白下调的同时基质金属蛋白酶MMP等上调，肿瘤细胞常常利用释放的金属蛋白酶MMP降解癌细胞周围的基质，从而促进肿瘤细胞进入血管或淋巴中，随循环系统到达新的组织部位并转移形成继发肿瘤，其快速增殖需要血管参与，本发明结果表明水解物可以显著影响肿瘤细胞的迁徙，改善肿瘤血管的异质性，化疗药物虽然对抑制肿瘤细胞转移有效果，但无法阻止周围MMP因子释放并降解基质促进癌细胞释放进入血管的过程。因此远端的转移复发难以控制。本发明水解物具有特殊的组成成分，具有抗肿瘤迁徙和复发的效果，特别是和化疗药物联合使用效果更好，其单独试验条件下也有效。

另外本发明酶解物具有较高氨基酸含量，和极低的多糖含量，因此可以和透明质酸形成自组装凝胶，而以常规方式和其他常规复合酶水解的产物则无法实现该效果，即使改变其中一种酶，即使能够形成凝胶，其缓释效果并不明显，并且相对本发明实施例1，对比例的抗肿瘤迁徙和转移能力均不良；本发明在制备过程中使用MOF载体有效解决了酶底物和水解产物的吸附聚集，位点多均匀分散保障了酶水解效率和程度，稳定了PH，缩短了反应时间，也对自组装凝胶系统的稳定性有益，另外对于酶解产物具有特别的香气，使用耐受性极佳。

上述具体实施例并不构成对本发明的保护范围的限定，本领域技术人员可以根据上述说明对本发明进行各种变化和应用。