一种荧光微球的制备方法

技术领域

本发明涉及功能高分子材料领域，更具体为，本发明涉及一种荧光标记微球的制备方法。

背景技术

免疫功能与每个人的健康状态息息相关，而淋巴细胞亚群分析正是检测免疫功能的重要指标，它能反映机体当前的免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，对分析发病机制，观察疗效及检测预后都有重要意义。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM），可用于细胞的计数和分选，很多临床检验都需要使用荧光微球以精确计量细胞的个数，流式细胞术是淋巴细胞亚群检测的标准方法。利用流式细胞术分析淋巴细胞亚群水平，可以帮助评价机体免疫状态，是目前广泛应用于临床各领域的重要检测指标，在淋巴细胞亚群结果判别中既要判别相对计数的变化，也要判别绝对计数的变化。绝对计数微球可以用来计算混合复杂的细胞群体中目的细胞群的绝对细胞数量，绝对计数微球是一种已知数量或浓度的微球，它可在较宽范围内的激发和发射波长下发出明亮荧光。

目前，现有的制备方法得到的绝对计数用荧光微球普遍存在荧光微球不稳定，不能长期保存，发射光谱不能覆盖常用流式细胞仪检测通道等问题。因此，有必要开发一种制备稳定性好、能覆盖常用流式细胞仪检测通道的荧光微球的方法，有助于提高科研、临床检测的准确性及便利性。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种荧光微球的制备方法，获得的微球稳定性好，能至少覆盖流式细胞仪的FITC、PE及APC三个检测通道。为获得上述荧光微球，本发明所采用的技术方案如下：

根据本发明优选的，一种荧光微球的制备方法，步骤如下：

（1）采用分散聚合技术合成种子微球；

（2）将种子微球、溶胀剂加入到十二烷基硫酸钠溶液中，超声乳化，加入到反应器中加热进行第一次溶胀；

（3）将引发剂、苯乙烯单体、交联剂单体、羧基单体、致孔剂、复合染料、十二烷基硫酸钠水溶液混合均匀后，加入到上述体系中，加热进行第二次溶胀；

（4）向体系中加入稳定剂水溶液、水相阻聚剂，惰性气体保护下升温反应。

进一步地，所述种子微球为聚苯乙烯微球。

进一步地，所述溶胀剂为邻苯二甲酸二丁酯、环己烷、正己烷、四氯甲烷、氯仿、二氯甲烷、甲苯、四氢呋喃中的一种或几种。

进一步地，所述十二烷基硫酸钠水溶液浓度为0.1%~1 wt%。

进一步地，所述引发剂为过氧化苯甲酰、过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化二碳酸二环己酯、过氧化二碳酸双(4-叔丁基环己基)酯中的一种。

进一步地，所述交联剂单体为二乙烯基苯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种。

进一步地，所述羧基单体为马来酸酐、丙烯酸、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯中的一种。

进一步地，所述致孔剂为甲苯、正己烷、环己烷、氯仿中的一种或几种。

进一步地，所述复合染料选自异硫氰酸荧光素、吖啶橙、派洛宁、罗丹明110、罗丹明B、尼罗红、尼罗蓝等有机染料中的两种或两种以上组合而成，且组合成的复合染料的发射波长能够至少覆盖FITC、PE及APC三个通道。

进一步地，优选为尼罗蓝、吖啶橙、异硫氰酸荧光素三种染料的复合染料，三种复合染料的质量比1:1:1~1:2:5

进一步的，所述复合染料溶解于无水乙醇中，配制成浓度为0.1~10 mg/mL浓度，滴加方式加入反应体系中。

进一步地，所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇中的一种。

进一步地，所述水相阻聚剂为亚硝酸钠、硫酸亚铜中的一种或几种。

进一步地，所述超声乳化条件为40~80 Hz，超声分散10~30分钟。

进一步地，所述步骤（2）中所述超声乳化时间为15~30min，第一次溶胀温度为30~50℃，溶胀时间为4~8h；所述步骤（3）中所述第二次溶胀温度为30~50℃，溶胀时间为8~16h；步骤（4）中所述反应温度为60-80℃，反应时间为12-24h。

进一步地，所述种子微球为0.5~5质量份；溶胀剂为0.5~5质量份；步骤（2）中十二烷基硫酸钠水溶液50~200质量份；引发剂为0.01~0.3质量份；苯乙烯单体10~50质量份；交联剂单体0.1~5质量份；羧基单体0.5~5质量份；致孔剂10~30质量份；复合染料0.1-1质量份；步骤（3）中十二烷基硫酸钠水溶液10~100质量份。

进一步地，溶胀剂优选为为邻苯二甲酸二丁酯、环己烷、氯仿、四氢呋喃中的两种复配，质量比为1:1。

进一步地，引发剂优选为过氧化苯甲酰。

进一步地，交联剂单体优选为二乙烯基苯。

进一步地，羧基单体优选为甲基丙烯酸。

进一步地，致孔剂优选为甲苯。

进一步地，该荧光微球在制备用于细胞群体中目的细胞群的绝对细胞数量试剂中的应用。

进一步地，步骤（1）中所述的种子微球的制备方法，包括如下步骤：

a将分散剂加入到反应溶剂中，再加入链转移剂，超声分散成均相体系，加入到反应容器中；

b.氮气环境下，对该均相溶液升温，温度为65~80℃，并稳定15~30min后得到稳定体系；

c.将引发剂和单体苯乙烯缓慢加入上述反应体系中，以250~600rpm转速进行搅拌，65-80℃条件下反应20~30h；

d.将上述反应液分别用无水乙醇和去离子水进行离心、洗涤，将洗涤后产物分散于无水乙醇水溶液中进行梯度沉降分离，超声分散均匀，置于室温重力场分离出非目标尺寸微球，收集沉降后产品保存于微球保存液，获得聚苯乙烯微球。

进一步地，所述步骤a.中分散剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种；链转移剂为正十二烷基硫醇、叔十二烷基硫醇、2-丙烯-1-硫醇、苄硫醇、1-丁硫醇等硫醇试剂中的一种；引发剂为偶氮二异庚腈、偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯中的一种。

本发明的技术方案比现有技术具有以下优点：

1、本发明提供一种荧光微球的制备方法，通过有机荧光染料彼此的协同效应，不同染料的激发波长和发射波长彼此协同配合，能至少覆盖流式细胞仪的FITC、PE及APC三个检测通道；

2、本发明制备的荧光微球尺寸均一，球体结构均匀，表面可修饰不同官能团。同时将荧光染料包裹在微球内部，有效减少荧光染料的脱落和泄露，降低荧光淬灭的风险，确保荧光信号的稳定。本发明相比于其他工艺更加简单，成本更低，具有较高的稳定性及应用价值。

附图说明

图1：实施例1：a）图中种子微球的扫描电镜图（放大倍数10000x）；b）图种子微球的扫描电镜图（放大倍数5000x）

图2：实施例2：a）图荧光微球的扫描电镜图（放大倍数10000x）：b）图荧光微球的扫描电镜图（放大倍数5000x）

图3：实施例2流式细胞仪检测结果图（A图-F图）

图4：实施例2流式细胞仪检测结果图（H图-I图）

实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

实施例1

种子微球的制备方法，包括如下步骤：

步骤a：称取4.5g分散剂聚乙烯吡咯烷酮溶于90ml无水乙醇和10ml去离子水，再加入0.225g链转移剂叔十二烷基硫醇，通过超声分散成均相溶液，并向其中持续通入氮气；

步骤b：通氮气30min后，将步骤1中溶液升温至65℃，并稳定20min后得到稳定体系；

步骤c：向步骤2中稳定体系以滴加速度为0.1mL/s的速度滴入1.2g引发剂偶氮二异丁腈和30g单体苯乙烯，保持机械搅拌转速280rpm，65℃反应24h；

步骤d：将步骤3得到的反应液分别用无水乙醇和去离子水进行离心、洗涤，将洗涤后产物分散于体积比为2:3的无水乙醇水溶液中梯度沉降分离，超声分散30min，置于室温重力场1h分离出高于目标尺寸微球，继续沉降5h，分离出低于目标尺寸微球，收集沉降后产品保存于微球保存液，获得微米级的聚苯乙烯微球，即种子微球（结果见图1）。

实施例2

取0.5 g种子微球加入30 mL 0.25 wt%十二烷基硫酸钠水溶液，0.5 g邻苯二甲酸二丁酯和0.5 g氯仿（溶胀剂）加入30 mL十二烷基硫酸钠水溶液，分别于80 Hz超声分散、乳化30分钟，然后加入反应容器中进行第一步溶胀，升温至40℃，溶胀6小时。

然后将0.15 g过氧化苯甲酰（引发剂）、10 g苯乙烯单体、1.5 g二乙烯基苯（交联剂单体）、0.5 g甲基丙烯酸（羧基单体）、12 g甲苯（致孔剂）、0.2 mL复合染料（尼罗蓝：吖啶橙：异硫氰酸荧光素质量比=1:1:1）乙醇溶液、10 mL十二烷基硫酸钠水溶液混合均匀后，加入上述体系中进行第二步溶胀，升温至40℃，溶胀16小时。

溶胀结束后加入17.5 mL 5 wt%聚乙烯醇水溶液（稳定剂水溶液）、1 mL 1 wt%亚硝酸钠水溶液（水相阻聚剂），氮气保护下升温至60℃，溶胀24小时。然后将制得的荧光微球过筛、洗涤、离心，保存备用。对其进行扫描电镜拍摄，所得荧光微球平均粒径为5.1 μm，变异系数为2.8%。

将实施例2获得的荧光微球采用流式细胞仪（安捷伦Agilent NovoCyteAdvanteon）进行检验，结果（图2）显示该荧光微球前侧向集中且单分散，在FITC、PE、APC等常用通道均有较强的单分散荧光强度。

图3：A图表示前侧向图；B图表示FITC通道直方图；C图表示PE通道直方图；D图表示PerCP通道直方图；E图表示PerCP-eFluor 710通道直方图；F图表示PE-Cy7通道直方图；

图4：H图表示APC通道直方图；G图表示APC-Cy7通道直方图；I图表示FITC-PE通道散点图。

实施例3

取0.5 g种子微球加入20 mL 0.25 wt%十二烷基硫酸钠水溶液，0.5 g邻苯二甲酸二丁酯和0.5 g氯仿加入4 mL十二烷基硫酸钠水溶液，分别于40 Hz超声乳化30分钟，然后加入反应容器中进行第一步溶胀，升温至30℃，溶胀8小时。

然后将0.15 g过氧化苯甲酰、15g苯乙烯单体、1.5 g二乙烯基苯、2 g甲基丙烯酸、15 g甲苯、0.5 mL复合染料（罗丹明B：异硫氰酸荧光素质量比：尼罗红=1:1:2）乙醇溶液、20mL十二烷基硫酸钠水溶液混合均匀后，加入上述体系中进行第二步溶胀，升温至50℃，溶胀8小时。

溶胀结束后加入17.5 mL 5 wt%聚乙烯醇水溶液、2 mL 1 wt%亚硝酸钠水溶液，氮气保护下升温至70℃，反应18小时。然后将制得的荧光微球过筛、洗涤、离心，保存备用。所得荧光微球平均粒径为5.2 μm，变异系数为3.6%。

实施例4

取5 g种子微球加入150 mL 0.25 wt%十二烷基硫酸钠水溶液，2.5 g邻苯二甲酸二丁酯和2.5 g氯仿加入50 mL十二烷基硫酸钠水溶液，分别于80 Hz超声乳化30分钟，然后加入反应容器中进行第一步溶胀，升温至50℃，溶胀4小时。

然后将0.3 g过氧化苯甲酰、50 g苯乙烯单体、5 g二乙烯基苯、5 g甲基丙烯酸、12g甲苯、1 mL复合染料（异硫氰酸荧光素、吖啶橙、尼罗红质量比=1:1:2）乙醇溶液、100 mL十二烷基硫酸钠水溶液混合均匀后，加入上述体系中进行第二步溶胀，升温至30℃，溶胀12小时。

溶胀结束后加入175 mL 5 wt%聚乙烯醇水溶液、10 mL 1 wt%亚硝酸钠水溶液，氮气保护下升温至80℃，反应12小时。然后将制得的荧光微球过筛、洗涤、离心，保存备用。所得荧光微球平均粒径为5.2 μm，变异系数为2.8%。

对比例1：

荧光微球的制备方法基本与实施例4相同，不同点在于：第一步溶胀，室温25℃，溶胀4小时；第二步溶胀，室温25℃，溶胀12小时。

利用实施4制备的荧光微球与对比例制备的荧光微球进行稳定性性能测试：将本发明实施4和对比例1各自得到的荧光微球放置于37℃的环境下，分别测定其7天加速稳定性。

具体操作如下：将实施例4、对比例1各自得到的荧光微球利用前述安捷伦流式细胞仪进行检验，在FITC、PE、APC通道测定荧光微球的单分散荧光强度，每天重复测定一次，结果见下表：

从上表可以看出：本发明得到的荧光微球的荧光强度下降幅度低，而对比例1因存在泄漏问题，荧光强度下降明显。

本发明的上述实施例仅仅是为了清楚说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。