一种PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的用途

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的用途，用于抑制肺腺癌细胞增殖，制备肺腺癌的靶向治疗药物。

背景技术：

肺癌是最常见的恶性肿瘤，GLOBOCAN的数据显示，2018年全世界新发肺癌210万例，占所有新发肿瘤病例的11.6％(排名第一)；死亡180万例，占所有肿瘤死亡病例的18.4％(排名第一)。肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中，非小细胞肺癌占所有肺癌的85％左右，而肺腺癌是最常见的非小细胞肺癌组织学类型，约占肺原发肿瘤的40-50％，多数起源于支气管粘膜上皮，主要为周围型肺癌。近年来，肺腺癌的发病率呈上升趋势，根据肿瘤的发生部位、大小、对邻近器官的浸润压迫程度、有无转移等情况，患者可表现出咳嗽、血痰、胸痛、局部喘鸣、发热和气急等多种症状；肺腺癌早期患者多无症状，晚期可见消瘦、乏力、食欲减退、声音嘶哑及食管受压等症状，对患者的身体及家庭、社会造成很大的负担，已成为亟待解决的危害人类健康的重大疾病问题。

肺腺癌的发病机理尚不明确，有研究表明肺腺癌的发生多与苯并芘相关。临床上常用手术切除病灶、放化疗、分子靶向治疗和中医治疗肺腺癌。手术是肺腺癌的首选治疗方法，但临床上约75％的肺腺癌病人一经发现即为晚期，手术治疗已无法实施，主要依靠放化疗来延缓病灶的扩散，总体疗效及预后均欠佳，5年生存率低于20％。分子靶向治疗肺腺癌的药物包括以血管生成为靶点的贝伐珠单抗和COX2抑制药等，还包括以表皮生长因子为靶点的吉非替尼、厄洛替尼和HER2抑制药等，但分子靶向治疗只针对原发肿瘤有效，对转移瘤无效，且价格昂贵，普及率低。

RNA分子约98％属于非编码RNA，其不编码蛋白质，而是直接在RNA水平发挥作用，包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和PIWI相互作用RNA(PIWI interacting RNA，piRNA)等。piRNA是2006年首次在雄性生殖细胞发现的一类小的非编码RNA，由26至31个核苷酸组成，具有5'末端尿苷修饰或第十位腺苷偏向，不具备明显的二级结构区。piRNAs序列不保守，但编码piRNAs的基因簇在物种间非常保守。piRNAs常与PIWI蛋白形成复合体，在多种疾病的发生发展过程中发挥重要作用，如引起特定基因座的甲基化、调控蛋白磷酸化、沉默转录产物等；由于许多piRNAs是以组织和阶段特异性方式表达的，所以，它们的失调可以动态地反映疾病状态。近年来的研究显示，肿瘤细胞中的部分piRNAs可通过细胞膜进入循环，成为体液中新的肿瘤标志物，用于肺腺癌的早期诊断和预后监测。目前研究未见有关piRNA调控体内肺腺癌生长过程或将调控肺腺癌生长的piRNA用于治疗肺腺癌的文献或报道。基于piRNAs分子序列短，全长核酸序列即其功能基序，特异性强，靶向率高，不同于其他序列长的非编码RNA，因此，将piRNAs应用于疾病的治疗可减少不可预见的脱靶效应和毒副作用，促进piRNAs类药物的临床转化。

发明内容：

本发明的目的在于寻求设计一种PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106，用于制备抑制肺腺癌细胞增殖的靶向治疗药物，以抑制肺腺癌肿瘤生长。

为了实现上述目的，本发明涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的用途为制备抑制肺腺癌细胞增殖的靶向治疗药物。

本发明涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106为激动剂或腺病毒、慢病毒和腺相关病毒中一种病毒的转化体，包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列片段或包含与其序列相似度大于80％的核苷酸序列片段。

本发明涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106抑制肺腺癌细胞增殖的作用机理为：将PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106构建成激动剂或转化体后，通过下调丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase，PC)的表达，抑制三羧酸循环过程，使得能量代谢受抑，促进肺腺癌细胞死亡，实现肺腺癌的靶向治疗目的。

本发明涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106(序列号为：SEQ ID NO.1)核苷酸序列片段：TCCGGCTCGAAGGACTTCGTCTGTAATTTT；引物为piR-hsa-211106，其上游引物序列piR-hsa-211106-F为:GGCTCGAAGGACTTCGTCTGT，下游引物序列piR-hsa-211106-R为:AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。

本发明涉及PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的靶向作用效果检测如下：将PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106转染入肺腺癌细胞A549和HCC2279中，通过CCK8试剂盒和Edu染色检测肺腺癌细胞增殖指标判断PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对细胞增殖活力的影响；通过Trannswell小室和划痕实验检测肺腺癌细胞迁移指标判断PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对细胞迁移能力的影响；通过流式细胞术检测凋亡指标判断PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对细胞凋亡的影响。

本发明涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移、促进肺腺癌细胞凋亡的分子机制是通过RNA下拉蛋白技术、质谱分析技术实验验证，结果显示：PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106不仅能够抑制丙酮酸羧化酶(PC)的表达，而且可以与PC相互结合，抑制PC对细胞的调控作用，而PC是已知调控细胞能量代谢途径最重要的分子之一。

本发明涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106在评价其对肺腺癌肿瘤生长的抑制作用和靶向治疗效果时，构建了裸鼠腋下经皮荷瘤的肿瘤模型，将PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106注射到裸鼠体内肿瘤，并同时设立阴阳性对照组，定期测量裸鼠肿瘤体积，结果发现：实验组肿瘤的体积和重量较对照组小，治疗效果与阳性对照顺铂治疗组相当，表明：PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对裸鼠肿瘤模型具有靶向抑制作用。

本发明与现有技术相比，将PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106用于制备抑制肺腺癌细胞增殖的靶向治疗药物，为肺腺癌的细胞能量代谢途径异常激活的防治提供了新的研究方向；PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106通过抑制丙酮酸羧化酶的含量进而抑制三羧酸循环过程，显著抑制能量代谢及肺腺癌细胞的增殖活力和迁移能力，从而促进肺腺癌细胞的凋亡，其直接作用于靶位点，不会产生毒副作用及脱靶现象；通过高通量测序分析、质谱分析技术和体内外实验证实，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106特异性强，靶向率高，脱靶效应和毒副作用少；其应用机理科学,应用方法可信度高，治疗效果显著。

附图说明：

图1为本发明实施例3涉及的CCK8试剂盒检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279细胞增殖活力的影响结果示意图。

图2为本发明实施例4涉及的EdU检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279细胞增殖活力的影响结果示意图。

图3为本发明实施例4涉及的EdU检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279细胞增殖活力的统计定量分析结果示意图。

图4为本发明实施例5涉及的Transwell小室检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279细胞迁移能力的影响结果示意图。

图5为本发明实施例5涉及的Transwell小室检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279细胞迁移能力的统计定量分析结果示意图。

图6为本发明实施例6涉及的划痕实验检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279细胞迁移能力的影响结果示意图。

图7为本发明实施例6涉及的划痕实验检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279细胞迁移能力的统计定量分析结果示意图。

图8为本发明实施例7涉及的流式细胞仪检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279凋亡的影响结果示意图。

图9为本发明实施例7涉及的流式细胞仪检测的激动剂对肺腺癌细胞A549和HCC2279凋亡的统计定量分析结果示意图。

图10为本发明实施例8涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106与丙酮酸羧化酶相互结合的Western Blot(WB)结果示意图。

图11为本发明实施例9涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对丙酮酸羧化酶的表达的qRT-PCR分析结果示意图。

图12为本发明实施例10涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对丙酮酸羧化酶的表达的WB分析结果示意图。

图13为本发明实施例12涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对荷瘤裸鼠治疗后的肿瘤示意图。

图14为本发明实施例12涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对荷瘤裸鼠治疗后的肿瘤体积统计图。

图15为本发明实施例12涉及的PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106对荷瘤裸鼠治疗后的肿瘤重量统计图。

具体实施方式：

下面通过实施实例并结合附图对本发明做进一步描述。

实施例1：

本实施例涉及PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106构建激动剂的过程：以PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106基因为模板，采用引物对piR-hsa-211106进行PCR扩增，生成双链PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106，针对PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106反义链进行3’端胆固醇修饰、3’端四个硫代骨架修饰、5’端两个硫代骨架修饰和全链甲氧基修饰(上海吉玛制药技术有限公司)，完成激动剂的构建。

实施例2：

本实施例涉及将激动剂转染至肺腺癌细胞的过程：肺腺癌细胞传代至细胞密度达到30-50％左右，利用lipo3000将激动剂转染至肺腺癌细胞。取5μl(100pmol)激动剂加入含有95μl DMEM培养基的EP管中吹打混匀后，再取5μl lipo3000加入含有95μl DMEM培养基的EP管中吹打混匀，将二者以1：1的体积混合形成转染混合物，室温静置20分钟后加入至培养板内，48小时后进行基因和蛋白水平分析。

实施例3：

本实施例涉及肺腺癌细胞A549和HCC2279 CCK8增殖活力分析过程：培养肺腺癌细胞，对实验组进行PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的转染，分别于转染0、1、2、3、4天后，实验组和对照组肺腺癌细胞分别吸弃原有的培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗肺腺癌细胞两次，加入90μl新鲜培养基和10μl CCK8试剂(南京诺唯赞生物科技有限公司)处理1小时，在450nm吸光度处检测OD值，OD值大小代表细胞密度，反映细胞增殖活力，结果如图1所示，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106构建的激动剂能够明显抑制肺腺癌细胞A549和HCC2279的增殖。

实施例4：

本实施例涉及肺腺癌细胞A549和HCC2279增殖活力Edu染色分析过程：培养肺腺癌细胞，对实验组进行PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的转染，转染两天后，进行Edu染色(上海翊圣生物科技有限公司)分析细胞增殖情况：

(1)Edu标记细胞：以10μM的Edu工作液在37℃避光下孵育细胞2小时；

(2)细胞固定及促渗：孵育完成后，去除培养基，加入质量百分比浓度为4％的中性多聚甲醛室温固定15-30分钟后，去除固定液，加入质量百分比浓度为0.5％的Triton X-100in PBS，室温孵育20分钟促渗；

(3)EdU检测：加入Click-iT反应混合物，简短摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖细胞，室温避光孵育30分钟；

(4)DNA复染：5μg/mL Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15-30分钟染核；

(5)PBS洗涤细胞2次，荧光显微镜拍摄照片，并分析正在增殖的肺腺癌细胞比例；

结果如图2和图3所示，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106构建的激动剂能够显著抑制肺腺癌细胞的生长。

实施例5：

本实施例涉及肺腺癌细胞A549和HCC2279 Transwell小室迁移能力分析过程：培养肺腺癌细胞，对实验组进行PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的转染，转染两天后，在24孔Millicell室中进行迁移测定：将200μl无血清培养基中的细胞(2×10

实施例6：

本实施例涉及划痕实验对肺腺癌细胞A549和HCC2279迁移能力分析过程：在六孔板中培养肺腺癌细胞，对实验组进行PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的转染，转染两天后，用200ul移液器吸头刮擦细胞单层，通过在划擦后0h和24h拍摄10x高倍视野来捕获细胞迁移的代表性图像，测量跨越诱导损伤区域的缩小距离，并将其标准化为0h对照，表示为相对迁移速率，结果如图6和图7所示，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106构建的激动剂能够显著抑制肺腺癌细胞的迁移能力。

实施例7：

本实施例涉及流式细胞仪对肺腺癌细胞A549和HCC2279凋亡检测过程：培养肺腺癌细胞，对实验组进行PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的转染，转染两天后，进行Annexin V-FITC/PI(上海翊圣生物科技有限公司)细胞凋亡检测：

(1)肺腺癌细胞用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5min收集细胞；

(2)用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min，收集1-5×10

(3)吸弃PBS，加入1×Binding Buffer重悬细胞；

(4)加入Annexin V-FITC和PI Staining Solution，轻轻混匀，避光、室温反应10-15分钟；

(5)加入1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，在1h内用流式细胞仪检测；

结果如图8和图9所示，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106构建的激动剂能够明显引起肺腺癌细胞A549和HCC2279的凋亡。

实施例8：

本实施例涉及生物素偶联探针RNA下拉实验过程：收获、裂解和超声处理1×10

实施例9：

本实施例涉及肺腺癌细胞RNA提取及基因表达水平分析过程：

在6孔板的每个孔加入1mL Trizol裂解细胞并用枪头反复吹打，室温作用5分钟，将裂解液移入1.5mL离心管中，加入200u1氯仿，盖紧管盖,涡旋混匀室温静置3钟，4℃12000g/min离心15分钟；

将上层水相液体转移至新的1.5ml离心管中，加入500uL异丙醇，涡旋混匀室温静置10分钟，4℃12000g/min离心10分钟；

将上清用移液器吸取,丢弃，保留底部白色沉淀加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制),用手轻轻将白色沉淀弹起，然后在4℃条件下，7500g/min离心5分钟；

弃上清，室温干燥10-15分钟，加入30-40uL DEPC水重新溶解，检测RNA浓度后，将RNA置于-80C冰箱中保存或直接使用；

使用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，根据试剂盒的操作流程，将提取的1000ng总RNA反转录成cDNA，参考试剂盒说明书(宝生物工程(大连)有限公司)使用实时荧光定量PCR技术检测基因的表达水平；

结果如图11所示，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106能够显著抑制丙酮酸羧化酶的表达。

实施例10：

本实施例涉及肺腺癌细胞蛋白表达水平分析过程：

用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液(大连美仑生化技术有限公司)提取细胞总蛋白,BCA比色法调节蛋白浓度达到一致；

SDS-PAGE电泳对蛋白样品进行分离，转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1小时，洗膜，孵一抗(PC，GAPDH)，4℃冰箱孵育过夜，洗膜，室温孵育二抗1小时，洗膜，采用ECL化学发光法显影得到目的条带，用Quantity One软件对条带进行灰度扫描,以GAPDH内参进行校正；

结果图12所示，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106能够在蛋白水平上下调丙酮酸羧化酶的表达，表明：PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106抑制了肺腺癌细胞的能量代谢途径，促进了肺腺癌细胞的凋亡。

实施例11：

本实施例涉及构建裸鼠荷瘤模型的过程：取3-4周龄的BALB/c裸鼠(北京斯贝福实验室动物技术公司)，在适应当地条件1周后用于实验，将2×10

实施例12：

本实施例涉及裸鼠荷瘤模型的药物靶向治疗过程：

将裸鼠分为两组，每组5只裸鼠，分为顺铂实验组和生理盐水对照组；

向实验组裸鼠腹膜内注射顺铂(5mg/kg体重/周)，并将50uM PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106激动剂直接注射到右侧的肿瘤中，在左侧的肿瘤上注射piR-NC(上海吉玛制药技术有限公司)作为顺铂处理组的对照组；

向对照组裸鼠腹膜内注射等体积生理盐水，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106激动剂处理肿瘤同上，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106激动剂每隔一天进行治疗28天，每周测量一次肿瘤体积；实验结束时处死小鼠，将异种移植物剥离并拍照。

结果如图13、图14和图15所示，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的治疗效果与阳性对照药物顺铂(PDD)相当，而且，PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106增加了化疗药物顺铂的化学敏感性，两者之间存在协同作用，表明：PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106能够在体内抑制肺腺癌肿瘤的生长。

摘要

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的新用途，即用于制备抑制肺腺癌细胞增殖的靶向治疗药物，其作用机理是：将PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106序列制备成激动剂或转化体后，通过激动剂或转化体下调丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase，PC)的表达，抑制三羧酸的循环过程，使得能量代谢受抑，促进肺腺癌细胞死亡，进而实现抑制肺腺癌生长的目的。其直接作用于靶位点，不会产生毒副作用及脱靶现象，大量的分析和体内外实验证实，可信度高，治疗效果显著，为肺腺癌的抗肿瘤治疗提供了新的研究方向。