靶向外泌体针剂的保存、运输及针剂制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种靶向外泌体针剂的保存、运输及针剂制备方法。

背景技术

目前，化疗是治疗各种癌症较为有效的治疗手段之一，其中通过静脉注射药物是目前最主要的给药途径。但是，绝大多数的化疗药物是疏水性的，体内滞留时间短，生物利用率低，为了达到良好的治疗效果，必须持续给药以保证人体内药物浓度始终维持在治疗需要的浓度范围内。由于药物缺乏靶向能力，这种方式会长期伤害正常细胞，具有严重的毒副作用。为了解决这些问题，人们研究利用纳米级的药物载体包载疏水性药物，以提高药物的溶解性和生物利用率，从而降低大剂量药物造成的毒副作用，达到好的癌症治疗效果。

外泌体来源于细胞或者生物体本身，与其他的药物载体相比，其生物相容性毋容置疑，而且其表面存在的一些蛋白也有利于细胞吞噬。因此，外泌体作为载体成为研究的新方向。但随着外泌体的研究深入，越来越多的实验证实外泌体用于疾病治疗的有效性，因此如何稳定制备、保存、运输外泌体、不丧失其功能显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供靶向外泌体针剂的保存、运输及针剂制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方法：一种靶向外泌体针剂的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：通过基因工程获取细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒，将lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染24-48h后，加入抗生素，筛选，得到靶向肽修饰的细胞系；

步骤二：将靶向肽修饰的细胞系在DEME培养基中增值，收集上清，2000g离心15-45min，离心后收集1ml上清，加入外泌体提取试剂盒，4℃过夜，加入100-150μl PBS，混匀，10000g离心30-90min，弃上清，用300-500μl PBS重悬，获得外泌体；

步骤三：将外泌体和治疗药物用包被缓冲液混匀后，常温下1KV、20ms电穿孔，得到靶向外泌体药剂；

步骤四：用蛋白浓度测定试剂盒测量靶向外泌体药剂的蛋白浓度；

步骤五：将靶向外泌体药剂封装入安瓿瓶，得到靶向外泌体针剂。

优选的，步骤一中，所述抗生素为puro抗生素或G418抗生素。

优选的，步骤二中，所述外泌体提取试剂盒采用SBI外泌体试剂盒，Total ExosomeIsolation试剂盒，或Invitrogen Ambion miRNA试剂盒，或Life Technologies外泌体提取试剂盒中任意一种。

优选的，步骤三中，所述包被缓冲液为0.05mol/l碳酸盐缓冲液，包被缓冲液的pH为9.6。

优选的，步骤四中，所述蛋白浓度测定试剂盒采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，待检测的靶向外泌体药剂的体积为10μl。

优选的，步骤五中，所述安瓿瓶使用前用0.1％的盐酸或5％的醋酸水溶液灌满，再经100℃真空热处理30min后，依次经加压喷射气水洗涤处理和100℃真空干燥20min处理。

一种靶向外泌体针剂的保存、运输方法，包括以下保存步骤：

a.将靶向外泌体针剂制备后立刻置于4℃保持30min；

b.将向外泌体针剂置于冻存管中-20℃下保持2h；

c.将冻存管置于-80℃下保持24h；

d.将冻存管置于液氮罐中长期储存。

优选的，所述冻存管从液氮中取出后立即投入恒温水浴箱中，复融，取出靶向外泌体针剂并转移至无菌管或转运袋中，使用4℃恒温保温箱在24h内运输至使用单位。

优选的，所述恒温水浴箱的温度为20℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明根据外泌体的膜为磷脂双分子层，具有抗冻性强的优点，采用阶梯冷冻的方式，将靶向外泌体针剂置于液氮罐中进行长期储存，不必将靶向外泌体针剂转化为冻干粉，操作步骤简单、有效；

2.本发明用蛋白浓度测定试剂盒测量靶向外泌体药剂的蛋白浓度，方便根据蛋白浓度进行调整各个靶向外泌体针剂的浓度，简单高效，测量时靶向外泌体针剂用量小，避免流失，也便于计算制备方法的回收率。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方法进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种靶向外泌体针剂的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：通过基因工程获取细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒，将lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染24h后，加入抗生素，筛选，得到靶向肽修饰的细胞系；

步骤二：将靶向肽修饰的细胞系在DEME培养基中增值，收集上清，2000g离心15min，离心后收集1ml上清，加入外泌体提取试剂盒，4℃过夜，加入100μl PBS，混匀，10000g离心30min，弃上清，用300μl PBS重悬，获得外泌体；

步骤三：将外泌体和治疗药物用包被缓冲液混匀后，常温下1KV、20ms电穿孔，得到靶向外泌体药剂；

步骤四：用蛋白浓度测定试剂盒测量靶向外泌体药剂的蛋白浓度；

步骤五：将靶向外泌体药剂封装入安瓿瓶，得到靶向外泌体针剂。

其中，步骤一中，根据lamp2b重组质粒上带有的抗性基因不同，若lamp2b重组质粒上带有新霉素抗性基因neo，筛选用G418抗生素，若lamp2b重组质粒上带有嘌呤霉素的抗性基因，筛选用puro抗生素；步骤二中，外泌体提取试剂盒采用SBI外泌体试剂盒；步骤三中，包被缓冲液为0.05mol/l碳酸盐缓冲液，包被缓冲液的pH为9.6；步骤四中，蛋白浓度测定试剂盒采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，待检测的靶向外泌体药剂的体积为10μl；步骤五中，安瓿瓶使用前用0.1％的盐酸或5％的醋酸水溶液灌满，再经100℃真空热处理30min后，依次经加压喷射气水洗涤处理和100℃真空干燥20min处理。

实施例2

一种靶向外泌体针剂的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：通过基因工程获取细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒，将lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染32h后，加入抗生素，筛选，得到靶向肽修饰的细胞系；

步骤二：将靶向肽修饰的细胞系在DEME培养基中增值，收集上清，2000g离心25min，离心后收集1ml上清，加入外泌体提取试剂盒，4℃过夜，加入120μl PBS，混匀，10000g离心50min，弃上清，用360μl PBS重悬，获得外泌体；

步骤三：将外泌体和治疗药物用包被缓冲液混匀后，常温下1KV、20ms电穿孔，得到靶向外泌体药剂；

步骤四：用蛋白浓度测定试剂盒测量靶向外泌体药剂的蛋白浓度；

步骤五：将靶向外泌体药剂封装入安瓿瓶，得到靶向外泌体针剂。

其中，步骤一中，根据lamp2b重组质粒上带有的抗性基因不同，若lamp2b重组质粒上带有新霉素抗性基因neo，筛选用G418抗生素，若lamp2b重组质粒上带有嘌呤霉素的抗性基因，筛选用puro抗生素；步骤二中，外泌体提取试剂盒采用SBI外泌体试剂盒；步骤三中，包被缓冲液为0.05mol/l碳酸盐缓冲液，包被缓冲液的pH为9.6；步骤四中，蛋白浓度测定试剂盒采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，待检测的靶向外泌体药剂的体积为10μl；步骤五中，安瓿瓶使用前用0.1％的盐酸或5％的醋酸水溶液灌满，再经100℃真空热处理30min后，依次经加压喷射气水洗涤处理和100℃真空干燥20min处理。

实施例3

一种靶向外泌体针剂的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：通过基因工程获取细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒，将lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染40h后，加入抗生素，筛选，得到靶向肽修饰的细胞系；

步骤二：将靶向肽修饰的细胞系在DEME培养基中增值，收集上清，2000g离心35min，离心后收集1ml上清，加入外泌体提取试剂盒，4℃过夜，加入140μl PBS，混匀，10000g离心70min，弃上清，用450μl PBS重悬，获得外泌体；

步骤三：将外泌体和治疗药物用包被缓冲液混匀后，常温下1KV、20ms电穿孔，得到靶向外泌体药剂；

步骤四：用蛋白浓度测定试剂盒测量靶向外泌体药剂的蛋白浓度；

步骤五：将靶向外泌体药剂封装入安瓿瓶，得到靶向外泌体针剂。

其中，步骤一中根据lamp2b重组质粒上带有的抗性基因不同，若lamp2b重组质粒上带有新霉素抗性基因neo，筛选用G418抗生素，若lamp2b重组质粒上带有嘌呤霉素的抗性基因，筛选用puro抗生素；步骤二中，外泌体提取试剂盒采用SBI外泌体试剂盒；步骤三中，包被缓冲液为0.05mol/l碳酸盐缓冲液，包被缓冲液的pH为9.6；步骤四中，蛋白浓度测定试剂盒采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，待检测的靶向外泌体药剂的体积为10μl；步骤五中，安瓿瓶使用前用0.1％的盐酸或5％的醋酸水溶液灌满，再经100℃真空热处理30min后，依次经加压喷射气水洗涤处理和100℃真空干燥20min处理。

实施例4

一种靶向外泌体针剂的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：通过基因工程获取细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒，将lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染40h后，加入抗生素，筛选，得到靶向肽修饰的细胞系；

步骤二：将靶向肽修饰的细胞系在DEME培养基中增值，收集上清，2000g离心45min，离心后收集1ml上清，加入外泌体提取试剂盒，4℃过夜，加入150μl PBS，混匀，10000g离心90min，弃上清，用500μl PBS重悬，获得外泌体；

步骤三：将外泌体和治疗药物用包被缓冲液混匀后，常温下1KV、20ms电穿孔，得到靶向外泌体药剂；

步骤四：用蛋白浓度测定试剂盒测量靶向外泌体药剂的蛋白浓度；

步骤五：将靶向外泌体药剂封装入安瓿瓶，得到靶向外泌体针剂。

其中，根据lamp2b重组质粒上带有的抗性基因不同，若lamp2b重组质粒上带有新霉素抗性基因neo，筛选用G418抗生素，若lamp2b重组质粒上带有嘌呤霉素的抗性基因，筛选用puro抗生素；步骤二中，外泌体提取试剂盒采用SBI外泌体试剂盒；步骤三中，包被缓冲液为0.05mol/l碳酸盐缓冲液，包被缓冲液的pH为9.6；步骤四中，蛋白浓度测定试剂盒采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，待检测的靶向外泌体药剂的体积为10μl；步骤五中，安瓿瓶使用前用0.1％的盐酸或5％的醋酸水溶液灌满，再经100℃真空热处理30min后，依次经加压喷射气水洗涤处理和100℃真空干燥20min处理。

上述的四组实施例均可以得到本发明的靶向外泌体针剂，其中实施例2得到的外泌体的收率最高，值得推广。

一种靶向外泌体针剂的保存、运输方法，包括以下保存步骤：

a.将靶向外泌体针剂制备后立刻置于4℃保持30min；

b.将向外泌体针剂置于冻存管中-20℃下保持2h；

c.将冻存管置于-80℃下保持24h；

d.将冻存管置于液氮罐中长期储存。

其中，冻存管从液氮中取出后立即投入恒温水浴箱中，复融，取出靶向外泌体针剂并转移至无菌管或转运袋中，使用4℃恒温保温箱在24h内运输至使用单位；恒温水浴箱的温度为20℃。

本发明的有益效果是：本发明根据外泌体的膜为磷脂双分子层，具有抗冻性强的优点，采用阶梯冷冻的方式，将靶向外泌体针剂置于液氮罐中进行长期储存，不必将靶向外泌体针剂转化为冻干粉，操作步骤简单、有效；本发明用蛋白浓度测定试剂盒测量靶向外泌体药剂的蛋白浓度，方便根据蛋白浓度进行调整各个靶向外泌体针剂的浓度，简单高效，测量时靶向外泌体针剂用量小，也便于计算制备方法的回收率。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。