大豆CS1基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，尤其涉及大豆CS1(Creeping Stem1)基因及其应用。

背景技术

随着人民生活水平的提高，中国对大豆消费需求的总量逐年上升，国产大豆已远不能自给自足，对外依存度接近90％。因此提高我国大豆产量迫在眉睫。倒伏现象是制约大豆高产稳产的主要限制因素之一，然而能够提高大豆抗倒伏能力的基因还鲜有报道，挖掘耐倒伏性状相关基因对培育高产稳产大豆新品种具有重要的应用价值。

利用转基因技术获得目标基因改良的大豆植株已成为研究大豆基因功能的主要手段，而通过CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术获得目标基因编辑突变体已成为研究大豆基因功能的有效途径。两者的有利结合，可以更充分的研究目标基因在减少和增多情况下的多种变化，进而为机制的探究提供更全面的数据。

大豆Glyma.19G186900基因的基因组序列长达36186bp，编码了一个拥有1710个氨基酸的蛋白。除了6个HEAT(Huntingtin，Elongation factor 3，A-subunit of proteinphosphatase 2A和TOR1)重复单元，尚无功能注释与结构域。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供如下1)-3)中任一种物质在如下a-e中的应用；

1)蛋白CS1；

2)编码蛋白CS1的核酸分子；

3)含有编码蛋白CS1的核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌；

所述蛋白CS1为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2第253-1962位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)由序列表中序列2第1-1962位所示的氨基酸序列的末端添加标签组成的蛋白质；

(3)将序列表中序列2第253-1962位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质；

a)调控植物抗倒伏性；具体为提高植物抗倒伏性；

b)调控植物株高；具体为降低株高；

c)调控植物茎秆粗度；具体为增加植物茎秆粗度；

d)调控植物茎秆强度；具体为增加植物茎秆强度；

e)植物种质资源改良。

上述应用中，所述蛋白CS1为在CS1蛋白的N端添加的e-YFP标签得到的融合蛋白，该融合蛋白为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述应用中，所述编码蛋白CS1的核酸分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

所述编码蛋白CS1的核酸分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1第757-5886位所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述物质在培育抗倒伏性提高、低杆、粗杆和/或茎秆强度高的植物中的应用也是本发明保护的范围。

降低蛋白CS1活性或含量的物质在如下1)-5)中任一种中的应用也是本发明保护的范围；

或，抑制编码所述蛋白CS1的核酸分子表达的物质在如下1)-5)中任一种中的应用也是本发明保护的范围；

1)降低植株抗倒伏性；

2)减小植物茎秆粗度；

3)降低植物茎秆强度；

4)培育细杆和/或茎秆强度低的植物；

5)培育抗倒伏降低植物；

所述蛋白CS1为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2第253-1962所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签组成的蛋白质；

(3)将(1)或(2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质；

上述应用中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1或sgRNA2；

所述sgRNA1的靶点为序列3第306-325位,

所述sgRNA2的靶点为序列4第306-325位；

2)表达所述sgRNA1或所述sgRNA2的CRISPR/Cas9载体。

本发明另一个目的是提供一种培育抗倒伏、低杆、粗杆和/或茎秆强度高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中蛋白CS1的含量和/或活性，得到转基因植物；

2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白CS1的核酸分子的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物的抗倒伏性高于所述目的植物；

或，所述转基因植物的株高低于所述目的植物；

或，所述转基因植物的茎秆粗度高于所述目的植物；

或，所述转基因植物茎秆强度高于所述目的植物；

所述蛋白CS1为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2第253-1962所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签组成的蛋白质；

(3)将(1)或(2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述提高目的植物中蛋白CS1的含量和/或活性，或，所述提高目的植物中编码蛋白CS1的核酸分子的表达，均是将所述编码蛋白CS1的核酸分子导入所述目的植物中。

上述过量表达上述CS1基因可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码框进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法。本发明过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达CS1基因即可。

本发明的CS1基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、拟南芥、烟草、玉米、水稻、小麦、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明CS1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明还有一个目的是提供一种培育抗倒伏性降低、细杆和/或茎秆强度低的植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)或3)：

1)为包括如下步骤：降低目的植物中蛋白质活性或含量，得到转基因植物；

2)为包括如下步骤：抑制目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子的表达，得到转基因植物；

3)为包括如下步骤：对目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到转基因植物；

所述转基因植物的抗倒伏性低于所述目的植物；

或，所述转基因植物的茎秆粗度小于所述目的植物；

或，所述转基因植物茎秆强度小于所述目的植物；

所述蛋白CS1为如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列2第253-1962所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签组成的蛋白质；

(3)将(1)或(2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子表达或所述对目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1或sgRNA2；

所述sgRNA1的靶点为序列3第306-325位,

所述gRNA2的靶点为为序列4第306-325位；

2)表达所述sgRNA1或所述sgRNA2的CRISPR/Cas9载体。

上述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明发明人利用基因克隆的方法克隆到大豆CS1的基因序列，并对其功能进行研究。发现，当CS1基因在受体栽培品种天隆一号中过量表达后，植株呈现株高变矮、抗倒伏性增强等性状，过表达大豆CS1基因的植株相比野生型天隆一号植株株高变矮、茎秆强度增强；而当CS1基因在受体栽培品种天隆一号中进行基因编辑后，植株呈现茎基部匍匐生长的倒伏形态，基因敲除大豆CS1基因的植株呈现茎基部匍匐生长的倒伏形态。说明大豆CS1基因参与调控植物高度、抗倒伏性的生物学过程。因此本发明提供了大豆CS1基因在调控植物高度、抗倒伏性中的用途，在植物育种技术领域应用前景良好。

附图说明

图1为CS1基因功能验证结果图；其中：

A为g1和g2表示对CS1基因进行基因编辑的两个位点，通过g1位点获得了纯合突变体株系cs1-cr1，该位点发生碱基G的缺失；通过g2位点获得了纯合突变体株系 cs1-cr2，该位点发生碱基T的增加；

B为编辑突变体cs1-cr1、cs1-cr2，CS1过表达株系CS1-OX-1、CS1-OX-2以及对照植株TL1田间收获表型图，比例尺为25cm；

C为对图B中的材料进行播种后46天植株下胚轴茎粗的测量结果；

D为对图B中的材料进行播种后46天植株下胚轴茎秆强度的测量结果；

E为CS1过表达株系CS1-OX-1、CS1-OX-2以及对照植株TL1的株高；

F为CS1基因在过表达株系CS1-OX-1、CS1-OX-2以及对照植株TL1中的表达量，其中GmAcitn为内参基因。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

大豆CS1基因的核苷酸序列为序列1第757-5886位，其编码的氨基酸序列为序列 2第253-1962位。

下述实施例中过表达载体p0641又叫载体pFGC5941；载体pFGC5941记载于如下文献中：Meng，Y.，Y.Hou，H.Wang，R.Ji，B.Liu，J.Wen，L.Niu and H.Lin (2017).Targetedmutagenesis by CRISPR/Cas9 system in the model legume Medicagotruncatula.Plant Cell Rep 36(2):371-374。

下述实施例中载体PA7为将e-YFP标签(序列1第1-717位)插入PUC18载体 (来自TAKARA公司，产品目录号D3218)的BamH1和EcoR1酶切位点间得到的载体。

下述实施例中威廉82(Williams 82)大豆品种记载于如下文献中：Liu M F,WangY Q,Nie Z X,Gai J Y,Bhat J A,Kong J J,Zhao T J(2020).Double mutation of twohomologous genes YL1 and YL2 results in a leaf yellowing phenotype in soybean[Glycine max(L.)Merr]Plant Molecular Biology 103(4-5):527-543

下述实施例中载体pU3记载于如下文献中：Shan,Q.,Y.Wang,J.Li,Y.Zhang,K.Chen,Z.Liang,K.Zhang,J.Liu,J.J.Xi,J.L.Qiu and C.Gao(2013). Targeted genomemodification of crop plants using a CRISPR-Cas system.Nat Biotechnol 31(8):686-688。

下述实施例中CRISPR/Cas9载体p0645，又名pFGC5941-Cas9，记载于如下文献中：Meng，Y.，Y.Hou，H.Wang，R.Ji，B.Liu，J.Wen，L.Niu and H.Lin(2017).Targetedmutagenesis by CRISPR/Cas9 system in the model legume Medicagotruncatula.Plant Cell Rep 36(2):371-374；载体p0645含有CAS9蛋白编码区，无CAS9蛋白的结合区。

实施例1、大豆CS1基因相关载体的构建

一、大豆CS1基因过表达载体的构建

1、设计合成引物

本发明用于扩增CS1第一部分CDS序列并利用Spe1和BamH1双酶切位点连接到p0641载体的引物为：

p0641-1-F:CGAGCCCGGGACTAGTATGGCTTCCTCAACCTCAAT(Spe1酶切位点ACTAGT)

p0641-1-R:GTGGCGGTCCGGATCCTGTTTCAAGTCTTCTGTATC(BamH1酶切位点GGATCC)

本发明用于扩增CS1第二部分CDS序列并利用BamH1单酶切位点连接到p0641载体的引物为：

p0641-2-F:ACTTGAAACAGGATCCATCATATCAAGACACTTGGG(BamH1酶切位点GGATCC)

p0641-2-R:GTGGCGGTCCGGATCCGTTTTTCGTAGACTCCACAT(BamH1酶切位点GGATCC)

本发明用于扩增e-YFP标签并利用Xhol单酶切位点连接到p0641载体的引物为：

e-YFP-CS1-F：AGCCACCATGCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA(Xhol 酶切位点CTCGAG)

e-YFP-CS1-R： TAGTCCCGGGCTCGAGCCCCGGTGGCGGTCCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC(Xhol酶切位点CTCGAG)

2、过表达载体连接

因大豆CS1基因CDS序列过大，难以通过普通PCR过程进行扩增获得，所以通过华大生物科技有限公司对CS1基因CDS序列进行合成。

利用p0641载体来构建过表达载体，此载体携带35S启动子和NOS终止子DNA 片段。首先用Spe1和BamH1双酶切将载体切开，然后将已合成的CS1片段进行连接。因CS1片段太大，无法一次性连接到载体上，故先将一部分序列利用Spe1和BamH1 先连接到p0641载体上，构成过度载体p0641-1，然后利用第一部分片段末端自带的 BamH1 DNA片段作为单酶切位点，将目的基因第二部分片段进行载体连接，最终形成不加标签的中间载体p0641-2。紧接着再对中间载体p0641-2进行N端的e-YFP标签的添加，最终构成含有目的片段的过表达载体e-YFP-CS1。

具体如下：

合成后的CS1基因CDS的核苷酸序列为序列表中序列1，用于载体构建。

以序列1为模板，用p0641-1-F和p0641-1-R进行PCR扩增，得到1861bp的片段1；

以序列1为模板，用p0641-2-F和p0641-2-R进行PCR扩增，得到3327bp的片段2。

用含有e-YFP序列的载体PA7为模板，用e-YFP-CS1-F和e-YFP-CS1-R进行PCR 扩增，得到749bp含有e-YFP片段。

用Spe1和BamH1双酶切p0641载体和上述1861bp的片段1，得到酶切后载体片段和酶切后片段1，二者连接，得到过度载体p0641-1；

再用BamH1酶切过度载体p0641-1和上述3327bp的片段2，得到酶切后载体片段和酶切后片段2，二者连接，得到中间载体p0641-2；

再用Xhol单酶切中间载体p0641-2，将749bp含有e-YFP片段和酶切后的中间载体p0641-2连接，得到含有目的片段的过表达载体e-YFP-CS1，且e-YFP片段位于CS1 的N端；

经过测序，过表达载体e-YFP-CS1为将编码融合蛋白e-YFP-CS1的DNA分子替换p0641载体的Xhol和BamH1酶切位点间得到的载体，其表达融合蛋白e-YFP-CS1。

融合蛋白e-YFP-CS1的氨基酸序列为序列2，其中序列2第1-239位为e-YFP标签，第240-252位为连接肽，第253-1962位为CS1蛋白。

编码融合蛋白e-YFP-CS1的DNA分子的核苷酸序列为序列1，其中序列1第1-717 位为e-YFP标签编码基因，第718-756位为连接肽编码基因，第757-5886位为CS1蛋白编码基因。

3、重组农杆菌的制备

1)农杆菌感受态制备

a)挑取活化过的根癌农杆菌EHA105(北京拜尔迪生物技术有限公司,货号： DE-NKY-0315)单菌落，接种于5ml无抗LB液体培养基中，28℃,200rpm震荡培养过夜；

b)将2ml过夜培养的菌液加到50ml含无抗的LB液体培养基中，28℃,200rpm震荡3-4小时，至OD600＝0.8左右；

c)4000rpm离心5分钟，去上清；

d)加入50ml 10％甘油悬浮菌体，

e)4000rpm离心5分钟，去上清；

f)加入25mL10％甘油重悬浮菌体，4000rpm离心5分钟；

g)重复f一次，去上清，加入2ml10％甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(100μl/管)。

h)立即放于液氮中进行速冻，放于-80℃备用。

2)农杆菌感受态的电转化

a)取2μl过表达载体e-YFP-CS1加到100μl EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟(可忽略时间)；

b)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化；

c)马上加入lml新鲜的无抗LB液体培养基，28℃，200rpm轻摇4小时；

d)将培养好的菌液12000rpm离心10s弃部分上清，将剩余上清与菌体混匀涂于含卡那青霉素的LB固体培养基平板上，28℃暗培养2天。

3)农杆菌阳性检测

a)挑取长好的农杆菌单菌落于1.5ml离心管中，离心管中加有卡那青霉素的LB 培养基中，过夜培养。

b)同时进行PCR检测(引物为15644，序列为CACTATCCTTCGCAAGAC； CDSR2，序列为GCCATGTTCCCGAACCGCCGACGTCC，得到e-YFP-CS1重组载体 1020bp的为阳性)，PCR检测正确的菌液加入等体积的50％甘油,混匀,放入-80℃保存。

得到阳性菌为重组菌EHA105/e-YFP-CS1。

二、大豆CS1基因敲除载体构建

1、敲除载体的制备

1)靶位点设计

Cas9蛋白能够识别基因组外显子上位于NGG前19个碱基并将其作为编辑靶位点。依据此特点，利用http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR网站对基因Glyma.19g186900设计了如下靶位点表1所示：

表1为基因Glyma.19g186900靶位点

2)PCR引物设计扩增

a)引物设计示意如下：

b)PCR扩增与载体构建：

对设计CRISPR/Cas9载体的各部件分别进行扩增：首先对U6进行扩增(PCR反应体系1，产物a)；其次对靶标序列+sgRNA扩增(PCR反应体系2，产物b)，然后对产物a与产物b分别进行胶回收；最后对U6+靶标序列+sgRNA组合片段扩增(PCR 反应体系3，产物c)；扩增后的片段进行载体连接，连接好的载体进行验证。详细的实验步骤如下。

此过程所需引物序列为：

U6xbaIF：GGAAGCTTAGGCCTTCTAGAAAAATAAATGGTAAAATGTC

U6xbaIR：CAATCCATGTGGTGGCACAT

gRNAF：AATGTGCCACCACATGGATT+g1(g2) GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA，

其中g1和g2分别为靶位点序列，

若+g1，则gRNAF为如下：AATGTGCCACCACATGGATT GATTGTGCACTGGGCTGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA；

若+g2，则gRNAF为如下：AATGTGCCACCACATGGATT GACACTGCATGGTTGCTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA

sgRNA-XbaIR：GCTCGGCAACGCGTTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGGT b-1)产物a的扩增

PCR反应体系1

上述PCR反应体系1的扩增得到产物a，即为启动子U6。

上述产物a进行胶回收。

b-2)产物b

PCR反应体系2(产物b:靶标序列+sgRNA)

PCR反应体系2的扩增得到产物b，即为靶标1序列+sgRNA或靶标2序列 +sgRNA。

产物b进行胶回收。

b-3)产物c

PCR反应体系3(产物c:Glyma U6+靶标序列+sgRNA)

产物c进行胶回收，得到Glyma U6+靶标1序列+sgRNA和Glyma U6+靶标2序列 +sgRNA。

上述所有反应体系的PCR反应程序均为如下：

3)目的片段连接

CAS9载体线性化酶切反应体系：(载体p0645含有CAS9蛋白编码区，无CAS9 蛋白的结合区)

按以上酶切反应体系在冰上配置反应液，混匀，37℃水浴30min，酶切反应完毕后对酶切产物进行胶回收，得到酶切产物片段。

载体连接，利用

上述产物c分别为Glyma U6+靶标1序列+sgRNA和Glyma U6+靶标2序列 +sgRNA。

按上述反应体系在冰上配置反应液，混匀，进行如下反应：反应程序：50℃，30min，得到重组载体。

得到含有2种靶点结合区的CRISPR/Cas9载体。

经过测序，

CRISPR/Cas9载体1为将Glyma U6+靶标1序列+sgRNA(序列3，序列3中第1-305 位为Glyma U6启动子，第306-325位为靶点结合区，第326-408位为cas9蛋白结合区)替换p0645载体中的Xbal酶切位点间，得到的载体；该载体表达sgRNA1，sgRNA1 为序列3中第306-408所示的核苷酸编码的RNA。

CRISPR/Cas9载体2为将Glyma U6+靶标2序列+sgRNA(序列4，序列4中第1-305 位为Glyma U6启动子，第306-325位为靶点结合区2，第326-408位为cas9蛋白结合区)替换p0645载体中的Xbal酶切位点间，得到的载体，该载体表达sgRNA2，sgRNA2 为序列4中第306-408所示的核苷酸编码的RNA。

2、重组农杆菌的制备

将上述CRISPR/Cas9载体1和CRISPR/Cas9载体2分别转入农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9载体1和重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9载体2。

实施例2、转基因事件大豆植株的获得

一、大豆遗传转化

将实施例1中一和二制备的3种重组农杆菌：重组菌EHA105/e-YFP-CS1、重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9载体1和重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9载体2分别进行大豆遗传转化，步骤如下：

1)种子消毒：挑取饱满、健康的大豆(天隆一号(TL1)，审定编号为国审豆2008023；以下称为野生型大豆)种子。利用4ml浓盐酸和100ml花王消毒水(Bleach)反应出来的氯气对豆子进行灭菌。灭菌时间为16-18h，之后置于超菌工作台中吹净氯气。

2)催芽和摇菌：晚上用无菌水浸泡种子用于催芽并对用于转化的农杆菌进行摇菌。

3)切豆子：第二天早上对泡好的豆子进行切除，去掉部分胚芽，轻轻的在生长点处划3-5下，将切好的豆瓣置于浸有灭菌水的三角瓶中。当农杆菌的OD值达到0.6-0.8 时进行离心(4000rpm，10min)，利用液体共培培养基对离心底物进行重悬，重悬后的菌液体积为30-40ml。倒掉三角瓶中灭菌水并倒入重悬后的菌液浸泡30min。

4)共培培养：将浸泡好的豆瓣均匀的铺在含有灭过菌的滤纸的固体共培培养基上，封上胶带，置于26度黑暗培养箱中培养3天。

5)诱导培养：切掉共培后已经长长的胚芽，只保留3-4mm，并利用无菌水和加有激素的液体诱导培养基对切好的外植体进行清洗，洗去残留的农杆菌。将外植体斜插入固体诱导培养基中，培养30天，期间需更换2次诱导培养基。

6)伸长培养：将长出丛生芽的外植体切掉豆瓣(此时豆瓣已变黄，营养已基本耗浸)，刮掉黑色表面，置于伸长培养基中。每10-15天进行一次培养基更换。

7)生根培养：将长长的幼苗切掉，插到生根培养基中进行生根培养。一般需30 天左右。

8)移栽：将生根的转化植株置于带有土的盆中，给予水或营养液。盖上盖子放于温室中培养。一周后去掉盖子。

得到T0代转EHA105/e-YFP-CS1植物、T0代转EHA105/CRISPR/Cas9载体1植物和T0代转EHA105/CRISPR/Cas9载体2植物。

二、转基因阳性株系的鉴定

1、过表达株系的验证

分别将上述一得到T0代转EHA105/e-YFP-CS1植物的2个株系CS1-OX-1和 CS1-OX-2取少量鲜嫩的叶片，提取RNA反转录为cDNA进行目的基因CS1表达量的检测。

以TL1为对照。

CS1表达量检查引物为CS-2F：GATTGTTTCCTCTCTCTGC；CS-2R：TTCTCTCCCTCTCTTCGT。

内参引物为Actin11-F：ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC；Actin11-R：GCTGGTCCTGGCTGTCTCC。

表达量检查如图1F所示，可以看出，与转化受体大豆TL1相比，T0代转EHA105/ e-YFP-CS1植物CS1-OX-1和CS1-OX-2中CS1基因的表达量均提高。

同时利用Basta筛查植物抗性。

2、敲除株系的验证

分别将上述二得到T0代转EHA105/CRISPR/Cas9载体1植物(cs1-cr1)和T0代转EHA105/CRISPR/Cas9载体2植物(cs1-cr2)，取少量鲜嫩的叶片，提取DNA进行载体元件检测。

采用引物basta-F:ACAGATAAAGCCACGCACATT和basta-R：TCCGCAGCCATTAACGACTT，用于鉴定是否含有Basta抗性基因，且PCR产物大小为989bp；

采用引物cas9-F：CAGCTCGTCCAAACCTAC和cas9-R：CTGTGCCATCCATCTTCT，用于鉴定是否含有Cas9基因，且PCR产物大小为601bp；

采用引物u6-F:GCGGTGTCATCTATGTTACTA和u6-R：TTCAAGTTGATAACGGACTA，用于鉴定是否含有U6启动子，且PCR产物大小为425bp。

若上述三者情况均检测到的即为阳性T0代转EHA105/CRISPR/Cas9载体1植物和阳性T0代转EHA105/CRISPR/Cas9载体2植物。

将上述阳性转EHA105/CRISPR/Cas9载体1植物(cs1-cr1)和阳性转 EHA105/CRISPR/Cas9载体2植物(cs1-cr2)分别用引物186900-3F： CTGCTAATGCTTATCTTGAGGC，186900-3R：AATTTGTGTCTGCACAACGTG(检测 g1靶位点)和186900-4-1-F：TTGACAAAGGAGGAGGCAAG，186900-4-1-R： CACACACAACACACACGAGAGA(检测g2靶位点)进行扩增，得到PCR产物，送去测序。以TL1为对照。

结果如图1A所示，可以看出，与转化受体亲本TL1相比，编辑突变体cs1-cr1 中存在碱基G的缺失，编辑突变体cs1-cr2中发生碱基T的插入，两种突变类型均造成CS1移码无法翻译蛋白。

将上述T0代植物播种，获得T2代植物。

三、转基因植株及基因编辑植株田间表型鉴定

1、过表达植株

将转化受体亲本TL1、上述二验证的CS1-OX-1、CS1-OX-2的T2代株系进行播种，待播种46天时检测茎秆直径和茎秆强度，收获时对株高进行测量。每个株系至少测量 8株。

对田间播种46天的植株下胚轴进行茎粗和茎秆强度的测量。测量方法为，随机选择8株植株，用数字游标卡尺测量植株的下胚轴直径，且尽可能保证测量部位一致。用日本AIKOH RZ推拉仪测量下胚轴茎秆强度。测量时将植株的下胚轴倾斜到与地面呈45度角，此时推拉式仪表显示的数值即为植株下胚轴的茎秆强度。

结果如图1B-1E所示，可以看出，CS1-OX-1、CS1-OX-2的T2代株系与野生型TL1 相比，具有株高变矮、茎秆变粗、茎秆强度增加、抗倒伏性增加的表型。

2、CS1基因编辑植株

将转化受体亲本TL1、上述二验证的基因编辑植株cs1-cr1、cs1-cr2的T2代纯合株系播种，待播种46天时检测茎秆直径和茎秆强度，收获时对株高进行测量。每个株系至少测量8株。

茎秆直径、茎秆强度测量方法如上。

结果如图1B-1D所示，可以看出，CS1基因敲除突变体cs1-cr1和cs1-cr2的T2 代纯合株系与野生型TL1相比，茎秆变细、茎秆强度降低且茎基部呈现匍匐生长表型。

以上结果显示，对CS1基因进行基因编辑，产生茎基部匍匐生长的倒伏性植株cs1-cr1和cs1-cr2，且该植株茎秆强度变弱，茎粗变细；对CS1基因进行过表达，则产生茎秆强度增强，茎粗增加的矮化植株CS1-OX-1和CS1-OX-2。

本发明运用分子生物学及基因工程技术的验证，首次证明大豆CS1基因是一个调控植物高度和抗倒伏性的基因。这为培育抗倒伏矮秆品种的作物提供了一个完善的思路。对作物品种的改良，具有很好的实践意义。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院作物科学研究所 南京农业大学

<120>大豆CS1基因及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5886

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggga 720

tccggaccgc caccggggct cgagcccggg actagtatgg cttcctcaac ctcaattccc 780

gcatccgaag ccgtgcaggt tctcctctcc ttgctcgccg atgacacttc ctccgtcaga 840

gaagcctcca tgtcctctct caaggacatt gccgcactga atcctcttct cgttctcgat 900

tgctgcgccg tcgtttcgcg cggtggacgt cggcggttcg ggaacatggc tggagttttc 960

caagtgatgg cgtttggagt tcgagctctc gacaaaaaag acgttgattc tgctttcatg 1020

gcgaagctcg ctaagattgc tacagctgag ttgatatcgt ctaaggaact aaattctgat 1080

tggcaacgag cagcaacaag cctacttgtt gcaataggct cacatttacc agatctcatg 1140

atggaagaaa tttatcttca tttatccggg gcaaattcag cattacagtc tatggttcaa 1200

atccttgcag aatttgcttc tactgatccc ttgcagttca ttccacactg gaaaggtgta 1260

ctttcacgaa ttttgccaat tcttggaaat gtgcgagaca tgcaccggcc aatttttgca 1320

aatgcattta agtgttggtg tcaagctgct tggcaatata gtatagattt cccttcacat 1380

tttccccaag atggtgatgt catgtcattt ctaaattctg cttttgagct tttgttgaga 1440

gtttgggcag cttcaagaga tttaaaggtt cgcgtggctt ctgtagaagc acttgggcag 1500

atggtaggtc tcataacacg aacacaattg aagactgccc taccaaggct tattcctaca 1560

atattggact tgtataaaaa ggaccaagat atagcttttc tggctacatg tagtctccac 1620

aatcttttaa atgcctcttt actgtctgaa agtggccctc ctatgcttga ttttgaggat 1680

ttgactcttg ttctatcaac acttctacct gtggtttctt tcaataatga cagcaaagac 1740

cagtcagatt tccctgtggg actgaagatg tataatgagg ttcagcattg ctttctgaca 1800

gttggcttgg tgtatccaga tgatttgttt ttgttccttg taaataaatg caggttgagg 1860

gaagaaccat tgacttttgg ttcactttgc attttgaagc atctcttgcc aaggctgtct 1920

gaagcttggc atagtaaaat acctctacta gtcgaagctg taaagtcctt gcttgaggag 1980

cagaatttag gtgttcgaaa ggcactttct gagttaatcg tggttatggc ttctcactgt 2040

tatttggttg gttcgtctgg agagttgttc attgaatatc ttgtacgcca ttgcgctata 2100

acagatcaaa atcggagtga tcttgagagc acaccaaata agagaataga gatgaaaatt 2160

ggtgcagtta ctcctggtga gttaagagca gtttgtgaga aaggtctcct tttggtaact 2220

attacgattc ctgaaatgga gcatattctt tggccttttc tgttgaggat gattattcca 2280

ttgacctaca ctggtgctgt ggccacggtg tgcaggtgta tctcagaatt gtggcggcat 2340

aggtcatata gcaatgatat gttgagtgag tgtaaaaccc gtcctgatat accatctgct 2400

gaggaacttc ttgcccgatt gttggtgctt ttgcacaatc ctctagcaag ggagcaattg 2460

gccacccaaa ttttgacagt cctatgtctt ttggcacctc tatttccaaa aaatatcaat 2520

ttgttttggc aagatgagat tccaaagatg aaggcatatg ttagtgatac agaagacttg 2580

aaacaggatc catcatatca agacacttgg gacgacatga taatcaattt tcttgcagaa 2640

tcattggatg tgatccaaga tgcagattgg gttatgtctc ttggaaatgt ttttgccaaa 2700

cattatgaac tttatgcatc tgatgatcaa cacactgcac ttcttcaccg gtgcttggga 2760

attctgcttc aaaaggttaa cgacagagct tatgtctgtg ataaaataga ttggatgtac 2820

aagcaagcaa acattgcaaa tccaacaaat agacttgggt tggcaaaagc aatgggattg 2880

gttgctgcat cacacttgga tacagtgtta gagaagctga aggatatttt agacaatgtt 2940

ggacaaagca tatttcagag gatactgtca ttgttctctg atagtttcag aacagaagag 3000

tctgatgaca tacatgctgc tttggcacta atgtatggat atgctgcaaa gtatgcccca 3060

tcaacagtta ttgaagccag aataaatgcc cttgttggca ccaacatgct ctctcggctt 3120

cttcatgtgc gtctccccaa agcaaagcaa gctgtcatca ccgcaattga tttactaggt 3180

aatgctgtca ttaatgctgc tgaaagtggc tcgccatttc cattgaaaag aagggaccaa 3240

ctgcttgatt atattttaac tttgatgggc cgggatgatg aagatggttt tgctgattac 3300

aatgatcttt tgcgtactca ggcccttgct ataagtgcct gcactacttt ggtctctgtg 3360

gaaccaaagc taacagttga aactagaagc catgtaatga aggctacgtt ggggttcttt 3420

gctataccaa atgatcctgt tgatgttgtc aatcccctta tagacaactt gattactctt 3480

ttatgtgcaa ttcttctcac tggtggagaa gatggaagaa gtcgagcaga gctgctaatg 3540

cttatcttga ggcaaattga tcaatttgtc tgttctcctg ttgagtatca gaggaaaaga 3600

ggctgtcttg ctgtccatga gatgcttcta aagtttcgga tgatttgtgt cagtgggtat 3660

tgtgcactgg gctgtcgtgg gagttgtgca cataacaagc aaatggaccg aactctatat 3720

gggaattttt caaagctgcc atctgcattt gtattaccaa gtcgagaagc tttgtgcttg 3780

ggtgataggg taataatgta tcttccacgt tgtgcagaca caaattctga agtcagaaaa 3840

atatcagcac aaattcttga tctactcttc agcatctctc tttcacttcc aagacctgct 3900

ggttcatcta tatctgctga agatatagaa ttgtcataca gcgcattatc ttctcttgag 3960

gatgttatag ccatattgag gaatgatact tcaattgatc catcagaagt tttcaacagg 4020

attgtttcct ctctctgcat tctgttgaca aaggaggagc tggttgctac actgcatggt 4080

tgctcagtgg ctatatgtga taagatcaag cagtcagctg aaggggctat tcaagctgtt 4140

gttgaatttg ttacgaagag agggagagaa ttgactgaga ttgatatctc aaggacaacc 4200

caatcattga tttctgccac tgtgcatgca actgacaaac atttgcgtgt ggaaactctt 4260

ggagctattt cttctttggc tgaaaacact agcccaagaa ctgtttttga tgaagtcctg 4320

gctgctgctg gaagggatac aatcacaaag gatatatcta ggttacgtgg gggatggcca 4380

atgcaggatg cattctatgc attttctcag cacatggtac tgtcagtttt gtttctagaa 4440

catgtgatat ctgttcttag ccagattcct atccttaaag gtgatgtgga gagacttgag 4500

gatagccagg ttgacagtca tacagaagat ggcaaactgc aagctgcaat ttttgctctt 4560

accgctttct tcagaggtgg gggaaaagtt ggaaaaaggg ccgttgaaca aaactatgct 4620

tctgttcttt ctgagcttac actgcaactt ggaagctgtc atggtttaac ctattctggt 4680

cagcatgaac cattgaggaa tcttcttact gcatttcagg cattctgtga atgcgttggt 4740

gacctagaga tgggcaagat tttagctaga gatggagaac tattggaaaa tgagaggtgg 4800

attagtctca ttggagacat agcaggctgc atatctataa agcgaccaaa agaggtacaa 4860

aatatttgtc tattttttca aaactcattg gatcgacccc agaaatatca aagggaagct 4920

gcagctgctg cattgtcaga atttgttcga tatagtggtg gacttggttc acttttggag 4980

caaatggttg aggttttatg tcggcatgta tcggatgagt cttcaactgt tcggcgatta 5040

tgtttgcgag gattagtaca gatcccattg attcatattc tgaagtatac ggctcaagtc 5100

ttgggtgtta tattagctct actagatgat ttagatgaat ctgtacaatt aactgctgta 5160

tcatgcttac tgatgattct caattcttca cctgatgatg cagttgagcc cattctgctt 5220

aatctttcaa tacggcttcg aaatcttcaa acaagcatga atgcaaagat gcgagccact 5280

tcttttgcag tatttggggc gctaagcaaa tatggaattg gggtactaag tgaggcattt 5340

gtcgagcagg tacatgctgc tgttcctcgc ctggtcttgc atcttcatga tgaagatttt 5400

agtgtccgat tagcctgtcg gaataccctg aaacaagttt gcccattgat ggaaattgaa 5460

ggaatgcttg ctgtactaaa cacacacagt ttcctttctg atcatcgaag tgattatgag 5520

gactttctcc gagacattgc aaagcaattt actcagcatc ttccctctag agttgatagt 5580

tatatggcat caacagtaca ggcttttgac gcaccatggc ccataattca ggcaaatgct 5640

atatacttct gcagcagcat gctttctcta tctgacaatc agcatatttt agctgtttat 5700

cattcacagg tcttcggtat gctggtggga aaattgagtc gatcacctga tgctgttgtt 5760

agagcaacaa gttctgctgc tctgggcttg ttgctgaaat cctcccattt atgctcatgg 5820

agagctgttg aactcgatcg gttagaatca acatcacgga accatgatgt ggagtctacg 5880

aaaaac 5886

<210> 2

<211> 1962

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Phe Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

225 230 235 240

Ser Gly Pro Pro Pro Gly Leu Glu Pro Gly Thr Ser Met Ala Ser Ser

245 250 255

Thr Ser Ile Pro Ala Ser Glu Ala Val Gln Val Leu Leu Ser Leu Leu

260 265 270

Ala Asp Asp Thr Ser Ser Val Arg Glu Ala Ser Met Ser Ser Leu Lys

275 280 285

Asp Ile Ala Ala Leu Asn Pro Leu Leu Val Leu Asp Cys Cys Ala Val

290 295 300

Val Ser Arg Gly Gly Arg Arg Arg Phe Gly Asn Met Ala Gly Val Phe

305 310 315 320

Gln Val Met Ala Phe Gly Val Arg Ala Leu Asp Lys Lys Asp Val Asp

325 330 335

Ser Ala Phe Met Ala Lys Leu Ala Lys Ile Ala Thr Ala Glu Leu Ile

340 345 350

Ser Ser Lys Glu Leu Asn Ser Asp Trp Gln Arg Ala Ala Thr Ser Leu

355 360 365

Leu Val Ala Ile Gly Ser His Leu Pro Asp Leu Met Met Glu Glu Ile

370 375 380

Tyr Leu His Leu Ser Gly Ala Asn Ser Ala Leu Gln Ser Met Val Gln

385 390 395 400

Ile Leu Ala Glu Phe Ala Ser Thr Asp Pro Leu Gln Phe Ile Pro His

405 410 415

Trp Lys Gly Val Leu Ser Arg Ile Leu Pro Ile Leu Gly Asn Val Arg

420 425 430

Asp Met His Arg Pro Ile Phe Ala Asn Ala Phe Lys Cys Trp Cys Gln

435 440 445

Ala Ala Trp Gln Tyr Ser Ile Asp Phe Pro Ser His Phe Pro Gln Asp

450 455 460

Gly Asp Val Met Ser Phe Leu Asn Ser Ala Phe Glu Leu Leu Leu Arg

465 470 475 480

Val Trp Ala Ala Ser Arg Asp Leu Lys Val Arg Val Ala Ser Val Glu

485 490 495

Ala Leu Gly Gln Met Val Gly Leu Ile Thr Arg Thr Gln Leu Lys Thr

500 505 510

Ala Leu Pro Arg Leu Ile Pro Thr Ile Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Asp

515 520 525

Gln Asp Ile Ala Phe Leu Ala Thr Cys Ser Leu His Asn Leu Leu Asn

530 535 540

Ala Ser Leu Leu Ser Glu Ser Gly Pro Pro Met Leu Asp Phe Glu Asp

545 550 555 560

Leu Thr Leu Val Leu Ser Thr Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Asn Asn

565 570 575

Asp Ser Lys Asp Gln Ser Asp Phe Pro Val Gly Leu Lys Met Tyr Asn

580 585 590

Glu Val Gln His Cys Phe Leu Thr Val Gly Leu Val Tyr Pro Asp Asp

595 600 605

Leu Phe Leu Phe Leu Val Asn Lys Cys Arg Leu Arg Glu Glu Pro Leu

610 615 620

Thr Phe Gly Ser Leu Cys Ile Leu Lys His Leu Leu Pro Arg Leu Ser

625 630 635 640

Glu Ala Trp His Ser Lys Ile Pro Leu Leu Val Glu Ala Val Lys Ser

645 650 655

Leu Leu Glu Glu Gln Asn Leu Gly Val Arg Lys Ala Leu Ser Glu Leu

660 665 670

Ile Val Val Met Ala Ser His Cys Tyr Leu Val Gly Ser Ser Gly Glu

675 680 685

Leu Phe Ile Glu Tyr Leu Val Arg His Cys Ala Ile Thr Asp Gln Asn

690 695 700

Arg Ser Asp Leu Glu Ser Thr Pro Asn Lys Arg Ile Glu Met Lys Ile

705 710 715 720

Gly Ala Val Thr Pro Gly Glu Leu Arg Ala Val Cys Glu Lys Gly Leu

725 730 735

Leu Leu Val Thr Ile Thr Ile Pro Glu Met Glu His Ile Leu Trp Pro

740 745 750

Phe Leu Leu Arg Met Ile Ile Pro Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Val Ala

755 760 765

Thr Val Cys Arg Cys Ile Ser Glu Leu Trp Arg His Arg Ser Tyr Ser

770 775 780

Asn Asp Met Leu Ser Glu Cys Lys Thr Arg Pro Asp Ile Pro Ser Ala

785 790 795 800

Glu Glu Leu Leu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu His Asn Pro Leu Ala

805 810 815

Arg Glu Gln Leu Ala Thr Gln Ile Leu Thr Val Leu Cys Leu Leu Ala

820 825 830

Pro Leu Phe Pro Lys Asn Ile Asn Leu Phe Trp Gln Asp Glu Ile Pro

835 840 845

Lys Met Lys Ala Tyr Val Ser Asp Thr Glu Asp Leu Lys Gln Asp Pro

850 855 860

Ser Tyr Gln Asp Thr Trp Asp Asp Met Ile Ile Asn Phe Leu Ala Glu

865 870 875 880

Ser Leu Asp Val Ile Gln Asp Ala Asp Trp Val Met Ser Leu Gly Asn

885 890 895

Val Phe Ala Lys His Tyr Glu Leu Tyr Ala Ser Asp Asp Gln His Thr

900 905 910

Ala Leu Leu His Arg Cys Leu Gly Ile Leu Leu Gln Lys Val Asn Asp

915 920 925

Arg Ala Tyr Val Cys Asp Lys Ile Asp Trp Met Tyr Lys Gln Ala Asn

930 935 940

Ile Ala Asn Pro Thr Asn Arg Leu Gly Leu Ala Lys Ala Met Gly Leu

945 950 955 960

Val Ala Ala Ser His Leu Asp Thr Val Leu Glu Lys Leu Lys Asp Ile

965 970 975

Leu Asp Asn Val Gly Gln Ser Ile Phe Gln Arg Ile Leu Ser Leu Phe

980 985 990

Ser Asp Ser Phe Arg Thr Glu Glu Ser Asp Asp Ile His Ala Ala Leu

995 1000 1005

Ala Leu Met Tyr Gly Tyr Ala Ala Lys Tyr Ala Pro Ser Thr Val

1010 1015 1020

Ile Glu Ala Arg Ile Asn Ala Leu Val Gly Thr Asn Met Leu Ser

1025 1030 1035

Arg Leu Leu His Val Arg Leu Pro Lys Ala Lys Gln Ala Val Ile

1040 1045 1050

Thr Ala Ile Asp Leu Leu Gly Asn Ala Val Ile Asn Ala Ala Glu

1055 1060 1065

Ser Gly Ser Pro Phe Pro Leu Lys Arg Arg Asp Gln Leu Leu Asp

1070 1075 1080

Tyr Ile Leu Thr Leu Met Gly Arg Asp Asp Glu Asp Gly Phe Ala

1085 1090 1095

Asp Tyr Asn Asp Leu Leu Arg Thr Gln Ala Leu Ala Ile Ser Ala

1100 1105 1110

Cys Thr Thr Leu Val Ser Val Glu Pro Lys Leu Thr Val Glu Thr

1115 1120 1125

Arg Ser His Val Met Lys Ala Thr Leu Gly Phe Phe Ala Ile Pro

1130 1135 1140

Asn Asp Pro Val Asp Val Val Asn Pro Leu Ile Asp Asn Leu Ile

1145 1150 1155

Thr Leu Leu Cys Ala Ile Leu Leu Thr Gly Gly Glu Asp Gly Arg

1160 1165 1170

Ser Arg Ala Glu Leu Leu Met Leu Ile Leu Arg Gln Ile Asp Gln

1175 1180 1185

Phe Val Cys Ser Pro Val Glu Tyr Gln Arg Lys Arg Gly Cys Leu

1190 1195 1200

Ala Val His Glu Met Leu Leu Lys Phe Arg Met Ile Cys Val Ser

1205 1210 1215

Gly Tyr Cys Ala Leu Gly Cys Arg Gly Ser Cys Ala His Asn Lys

1220 1225 1230

Gln Met Asp Arg Thr Leu Tyr Gly Asn Phe Ser Lys Leu Pro Ser

1235 1240 1245

Ala Phe Val Leu Pro Ser Arg Glu Ala Leu Cys Leu Gly Asp Arg

1250 1255 1260

Val Ile Met Tyr Leu Pro Arg Cys Ala Asp Thr Asn Ser Glu Val

1265 1270 1275

Arg Lys Ile Ser Ala Gln Ile Leu Asp Leu Leu Phe Ser Ile Ser

1280 1285 1290

Leu Ser Leu Pro Arg Pro Ala Gly Ser Ser Ile Ser Ala Glu Asp

1295 1300 1305

Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Ala Leu Ser Ser Leu Glu Asp Val Ile

1310 1315 1320

Ala Ile Leu Arg Asn Asp Thr Ser Ile Asp Pro Ser Glu Val Phe

1325 1330 1335

Asn Arg Ile Val Ser Ser Leu Cys Ile Leu Leu Thr Lys Glu Glu

1340 1345 1350

Leu Val Ala Thr Leu His Gly Cys Ser Val Ala Ile Cys Asp Lys

1355 1360 1365

Ile Lys Gln Ser Ala Glu Gly Ala Ile Gln Ala Val Val Glu Phe

1370 1375 1380

Val Thr Lys Arg Gly Arg Glu Leu Thr Glu Ile Asp Ile Ser Arg

1385 1390 1395

Thr Thr Gln Ser Leu Ile Ser Ala Thr Val His Ala Thr Asp Lys

1400 1405 1410

His Leu Arg Val Glu Thr Leu Gly Ala Ile Ser Ser Leu Ala Glu

1415 1420 1425

Asn Thr Ser Pro Arg Thr Val Phe Asp Glu Val Leu Ala Ala Ala

1430 1435 1440

Gly Arg Asp Thr Ile Thr Lys Asp Ile Ser Arg Leu Arg Gly Gly

1445 1450 1455

Trp Pro Met Gln Asp Ala Phe Tyr Ala Phe Ser Gln His Met Val

1460 1465 1470

Leu Ser Val Leu Phe Leu Glu His Val Ile Ser Val Leu Ser Gln

1475 1480 1485

Ile Pro Ile Leu Lys Gly Asp Val Glu Arg Leu Glu Asp Ser Gln

1490 1495 1500

Val Asp Ser His Thr Glu Asp Gly Lys Leu Gln Ala Ala Ile Phe

1505 1510 1515

Ala Leu Thr Ala Phe Phe Arg Gly Gly Gly Lys Val Gly Lys Arg

1520 1525 1530

Ala Val Glu Gln Asn Tyr Ala Ser Val Leu Ser Glu Leu Thr Leu

1535 1540 1545

Gln Leu Gly Ser Cys His Gly Leu Thr Tyr Ser Gly Gln His Glu

1550 1555 1560

Pro Leu Arg Asn Leu Leu Thr Ala Phe Gln Ala Phe Cys Glu Cys

1565 1570 1575

Val Gly Asp Leu Glu Met Gly Lys Ile Leu Ala Arg Asp Gly Glu

1580 1585 1590

Leu Leu Glu Asn Glu Arg Trp Ile Ser Leu Ile Gly Asp Ile Ala

1595 1600 1605

Gly Cys Ile Ser Ile Lys Arg Pro Lys Glu Val Gln Asn Ile Cys

1610 1615 1620

Leu Phe Phe Gln Asn Ser Leu Asp Arg Pro Gln Lys Tyr Gln Arg

1625 1630 1635

Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Glu Phe Val Arg Tyr Ser Gly

1640 1645 1650

Gly Leu Gly Ser Leu Leu Glu Gln Met Val Glu Val Leu Cys Arg

1655 1660 1665

His Val Ser Asp Glu Ser Ser Thr Val Arg Arg Leu Cys Leu Arg

1670 1675 1680

Gly Leu Val Gln Ile Pro Leu Ile His Ile Leu Lys Tyr Thr Ala

1685 1690 1695

Gln Val Leu Gly Val Ile Leu Ala Leu Leu Asp Asp Leu Asp Glu

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Ser Val Gln Leu Thr Ala Val Ser Cys Leu Leu Met Ile Leu Asn

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Ser Ser Pro Asp Asp Ala Val Glu Pro Ile Leu Leu Asn Leu Ser

1730 1735 1740

Ile Arg Leu Arg Asn Leu Gln Thr Ser Met Asn Ala Lys Met Arg

1745 1750 1755

Ala Thr Ser Phe Ala Val Phe Gly Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Ile

1760 1765 1770

Gly Val Leu Ser Glu Ala Phe Val Glu Gln Val His Ala Ala Val

1775 1780 1785

Pro Arg Leu Val Leu His Leu His Asp Glu Asp Phe Ser Val Arg

1790 1795 1800

Leu Ala Cys Arg Asn Thr Leu Lys Gln Val Cys Pro Leu Met Glu

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Ile Glu Gly Met Leu Ala Val Leu Asn Thr His Ser Phe Leu Ser

1820 1825 1830

Asp His Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Phe Leu Arg Asp Ile Ala Lys

1835 1840 1845

Gln Phe Thr Gln His Leu Pro Ser Arg Val Asp Ser Tyr Met Ala

1850 1855 1860

Ser Thr Val Gln Ala Phe Asp Ala Pro Trp Pro Ile Ile Gln Ala

1865 1870 1875

Asn Ala Ile Tyr Phe Cys Ser Ser Met Leu Ser Leu Ser Asp Asn

1880 1885 1890

Gln His Ile Leu Ala Val Tyr His Ser Gln Val Phe Gly Met Leu

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Val Gly Lys Leu Ser Arg Ser Pro Asp Ala Val Val Arg Ala Thr

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Ser Ser Ala Ala Leu Gly Leu Leu Leu Lys Ser Ser His Leu Cys

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Ser Trp Arg Ala Val Glu Leu Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ser Arg

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