一种比率型荧光检测系统及其检测方法及应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域技术领域，具体涉及一种比率型荧光检测系统及其检测方法及其应用。

背景技术

在目前的医学领域中，根据荧光检测原理对人体内物质检测已经日益成熟，目前大多数检测手段都是根据被检测物质具有荧光特性或者是通过荧光能量共振转移原理。该技术可具体描述为：通过被检测物质具有的荧光特性，在某特定波长的激发光照射下发射出比激发光波长更长的光，称为荧光；荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)之间的关系为：F＝2.3QKI0εCl，F＝KC，Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系数，l为光径长度。荧光共振能量转移是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光(敏化荧光)，也可以不发荧光(荧光猝灭)，通过在过程中发生的荧光强度变化和所检测物质的浓度存在一定的线性关系。

如授权公告号为CN107917905B的中国发明专利，公开了一种基于智能终端的比率型光度分析装置及方法，装置包括智能终端和光学辅助装置，所述光学辅助装置包括避光暗盒，避光暗盒内设置有连排双光度测量池，测量池背对检测器的外壁镀有或粘贴反射膜增强光信号，所述连排双光度测量池接收光源发出的光，样品溶液和参比溶液两个通道的光学图像信号依次经过滤光机构、聚光机构后被智能终端采集，测定其中的红、绿和蓝三原色的平均亮度，计算其亮度比，实现光度分析。上述方案的检测依赖于光亮度来进行分析，对激发光源的要求比较苛刻，并且由于环境光、激发光源散热等等问题的存在，会影响其检测精度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可有效避免来自环境的干扰，且检测精度高的比率型荧光检测系统及其检测方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种比率型荧光检测系统，包括遮光暗室，及设置于遮光暗室内的检测板、荧光检测模块、激发光源模块和MCU系统；所述检测板上设置有用于放置荧光探针和试剂的检测槽，所述激发光源模块正对检测槽；所述荧光检测模块包括两组，每组均包括滤光片和光电传感器，2片滤光片为中心波长不同的滤光片；所述MCU系统的输出端与激发光源模块连接，MCU系统的输入端与荧光检测模块连接，激发光源模块的输出光经荧光探针受激后发射的荧光再经滤光片过滤后射入光电传感器中。

为了方便更换荧光探针和试剂，优选的，所述检测板可里外移动的设置于遮光暗室内。

优选的，上述方案还包括显示单元，MCU系统的输出端与显示单元连接。

优选的，上述方案还包括上位机，MCU系统的输出端与上位机连接。

优选的，所述激发光源模块包括依次连接的恒流源、LED激发光源和耦合单元。

本发明还公开了一种比率型荧光检测系统的检测方法，包括以下步骤：

(1)拟合相关性曲线

①准备同种试剂不同浓度梯度的标准液，用于数据拟合；

②打开系统总开关，使得系统其他各个模块工作，之后打开激发光源模块开关，等待激发光源模块稳定；

③激发光源模块稳定后，将荧光探针放入检测槽中，然后将检测板推入遮光暗室中，等待光电传感器模块检测的数据稳定后，记录光电传感器检测到的初始数值FO1和F02；

④将检测板拉出，使用微量移液枪吸取标准液滴加在荧光探针上，使之反应80-120s后；

⑤记录当前吸取的标准液浓度值C和光频传感检测到的值F11和F12；

⑥重复步骤④、⑤，得到多组标准液浓度值C与之对应的F11、F12

⑦将标准液浓度值C与之对应的比值F11/F12二者拟合成具有相关性的曲线，得到试剂的浓度与比值之间的关系，将拟合后具有相关性的曲线公式烧入MCU系统中，并通过显示界面显示；

(2)同种试剂的待测液浓度的检测

取未知浓度的待测液重复④、⑤步骤，即可在显示界面观看到当前检测的待测液浓度，完成检测。

优选的，本方案通过更换不同的试剂即可完成该试剂浓度的检测。

优选的，所述荧光探针可更换。

本发明还公开了一种比率型荧光检测系统在血清胆红素定量检测中的应用。

优选的，所述荧光探针为红/蓝金纳米簇薄膜。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明采用比率型荧光探针具有自参比特性，对检测环境要求不再苛刻，可有效避免来自环境的干扰，检测精度高，并且可很大程度减少系统误差、抗干扰能力极强。

2.本发明不需要昂贵的大型设备，检测变得便捷式，使用廉价传感器即可获取荧光物质的信息，和其他普通的化学方法检测相比比率型荧光检测具有处理简单、灵敏度高、信号可调、无损、实时等优点。

3.本发明通过比率型荧光检测方法，通过低成本便可检测荧光物质或与之发生反应物质的浓度变化。

4.本发明将检测系统集成于小型的嵌入式系统中，使得检作简单、便捷。

附图说明

图1为本发明一种比率型荧光检测系统的结构示意图；

图2为图1的爆炸图；

图3为图1另外一个方向视图的爆炸图；

图4为本发明一种比率型荧光检测系统的模块框图；

图5为红/蓝金纳米簇薄膜与血清胆红素作用前后的发射光谱；

图6为血清胆红素浓度值C与之对应的比值F11/F12二者的相关性曲线。

附图标记：1、遮光暗室，2、检测板，3、检测槽，4、LED激发光源，5、光电传感器，6、MCU系统。

具体实施方式

为了使本发明的目的和优点更清楚明了，下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

本发明公开了一种比率型荧光检测系统，如图1、2、3、4所示，包括遮光暗室1、检测板2、荧光检测模块、激发光源模块和MCU系统6，所述荧光检测模块、激发光源模块和MCU系统6焊接于同一块电路板上。

所述遮光暗室1是通过PLA材料制作的，主要作用是减少环境光的干扰，遮光暗室1为内部中空的长方体结构，且沿长边的两侧板上开设有滑槽；所述检测板2为与遮光暗室1配合的长方形结构，检测板2的一端开设有用于放置荧光探针和试剂的检测槽3，检测板2沿滑槽里外移动(可推入或拉出遮光暗室1)，通过推拉检测板2，可方便的更换荧光探针和试剂，当然遮光暗室1也可以设计成开盖的形式来更换荧光探针和试剂。

所述激发光源模块包括依次连接的恒流源、LED激发光源4和耦合单元，LED激发光源4正对检测槽3安装，激发光源模块在进行耦合后照射到荧光探针上使之产生荧光效应。所述荧光检测模块包括两组，每组均包括滤光片和光电传感器5，其中检测槽3与光电传感器5模块呈45°夹角，光电传感器5模块将检测到的荧光信号转换为电信号输出；2片滤光片为中心波长不同的滤光片，其中一滤光片的中心波长为435-445nm，另一滤光片的波长为620-630nm；滤光片的作用主要是挑出特定波段的光进行检测及滤除杂光的干扰，如激发光源模块与外界未完全隔绝的环境光。所述MCU系统6的输出端与激发光源模块连接，MCU系统6的输入端与荧光检测模块连接，MCU系统6控制激发光源模块的工作状态，激发光源模块的输出光经荧光探针受激后发射的荧光再经滤光片过滤后射入光电传感器5中，光电传感器5再将检测到的信号发送至MCU系统6，由MCU系统6记录荧光探针的荧光强度变化，并且将两个光电传感器5所测的频率进行比例得到值，该值和荧光猝灭程度相关，并且荧光猝灭程度和试剂浓度成线性关系，通过不同浓度的试剂多次测量，MCU系统6根据这样的关系，拟合成荧光猝灭程度和试剂浓度的曲线关系，进行可以通过测量频率比值得到同种试剂的浓度。

本发明还包括显示单元和上位机，MCU系统6的输出端分别与显示单元和上位机连接。其中，显示单元用于显示光电传感器5所测得的荧光值、以及荧光猝灭程度(加入试剂前与加入试剂后的荧光比值)和试剂浓度成线性关系曲线图等，上位机用于存储数据、及荧光猝灭程度(加入试剂前与加入试剂后的荧光比值)和试剂浓度成线性关系曲线图等。

本发明还公开了上述比率型荧光检测系统的检测方法，包括以下步骤：首先利用已知浓度的试剂拟合其荧光猝灭程度和浓度的相关性曲线，其次利用拟合的相关性曲线和该测得的该试剂(浓度未知，称为待测试剂)的荧光猝灭程度得到该试剂(浓度未知，称为待测试剂)的浓度。

其中，拟合相关性曲线包括以下步骤：

①准备同种试剂不同浓度梯度的标准液(已知浓度)，用于数据拟合。

②打开系统总开关，使得系统其他各个模块工作，之后打开激发光源模块开关，等待激发光源稳定(显示界面的数值趋于稳定)。

③激发光源稳定后，将荧光探针放入检测槽3中，然后将检测板2轻轻推入遮光暗室1中，此时检测槽3与光电传感器5呈45°夹角，等待光电传感器5检测的数据稳定后，记录光电传感器5检测到的初始数值F01和F02。其中，F01为检测到蓝色荧光强度的值,F02为检测到红色荧光强度的值。(此处的F01/F02对应着试剂浓度为0的数值)。

④将检测板2拉出，使用微量移液枪吸取50uL的标准液滴加在荧光探针上，使之反应80-120s后，用滤纸将薄膜周围多余的溶液吸干，干燥后。

⑤记录当前吸取的标准液浓度值C和滴加标准液后光频传感检测到的值F11、F12。

⑥多次重复步骤④、⑤，得到多组标准液浓度值C与之对应的F11、F12，其中，F11为检测到蓝色荧光强度的值,F12为检测到红色荧光强度的值。在本优选实施方式中，重复5次；

⑦将标准液浓度值C与之对应的比值F11/F12二者拟合成具有相关性的曲线，得到试剂的浓度值C与之对应的比值F11/F12之间的关系，将拟合后具有相关性的曲线公式烧入MCU系统6中，并通过显示界面显示；

(2)同种试剂的待测液浓度的检测

取未知浓度的待测液，重复④、⑤步骤，具体为：激发光源稳定后，将检测板2拉出，使用微量移液枪吸取待测液滴加在荧光探针上，使之反应80-120s后，用滤纸将薄膜周围多余的溶液吸干，待干燥后，记录滴加待测液后光频传感检测到的值F11、F12，然后利用前述得到的浓度值C与之对应的比值F11/F12二者的相关性曲线，得到待测液浓度，待测液浓度可在显示界面直接观看到，完成检测。

通过更换不同的试剂、对应的荧光探针，重复上述步骤即可完成该试剂浓度的检测。

本发明还公开了上述比率型荧光检测系统在血清胆红素定量检测中的应用。所述试剂为血清胆红素，所述荧光探针为红/蓝金纳米簇薄膜。在检测中采用两个灵敏度不同的光电传感器5对加入血清胆红素后的红/蓝金纳米簇薄膜猝灭后的荧光强度进行检测。如图5所示为红/蓝金纳米簇薄膜(14层)与血清胆红素作用前后的发射光谱，很显然血清胆红素使薄膜的两个荧光峰强度均下降。由图5可知在未加入试剂前波长为440nm和623nm处存在荧光强度峰值，在加入试剂后两个峰值处均发生荧光猝灭，因此可使用比率型荧光检测方法对所加入试剂的浓度进行测定。表1为利用了比率型荧光检测系统测得的数值，总结了血清胆红素对红/蓝金纳米簇薄膜的荧光猝灭情况，以F01/F11(F01为血清胆红素加入前红金纳米簇薄膜的红色荧光峰强度，F11为血清胆红素加入后红金纳米簇薄膜的红色荧光峰强度)、F02/F12(F02为血清胆红素加入前蓝金纳米簇薄膜的蓝色荧光峰强度，F12为血清胆红素加入后蓝金纳米簇薄膜的蓝色荧光峰强度)表示猝灭效率。表1中的数据表明，在两个荧光峰中，血清胆红素对622nm处的红色荧光峰猝灭程度较大，意味着红色荧光纳米簇对血清胆红素的响应灵敏度较高。因此在次检测中，红光金纳米簇薄膜主要充当血清胆红素的检测单元，而蓝光金纳米簇薄膜更多的是作为参比单元。之后将两个光电传感器5所测的频率做比例运算得到的频率比值，该值和荧光猝灭程度相关，并且荧光猝灭程度和血清胆红素浓度成线性关系，因此可以通过测量频率比值得到血清胆红素浓度，如图6所示为血清胆红素浓度值C与之对应的比值F11/F12二者的相关性曲线。

表1：

表1中，F01/F11为蓝光金纳米簇荧光峰(443nm)在胆红素加入前(F01)、后(F11)的荧光强度值。F02/F12：红光金纳米簇荧光峰(622nm)在胆红素加入前(F02)、后(F12)的荧光强度值。拿F01/F11、F02/F12来对比，主要是得出红色荧光变化更明显，所以才使用F12(红色荧光强度)当分母，F11/F12分母变化越明显数值变大，而且变化梯度更明显。

据上所述荧光猝灭程度(F0/F)(F0为加入试剂前的荧光强度值，F为加入试剂后的荧光强度值),和血清胆红素浓度存在对应的线性关系，通过配置相应的标准液设计实验验证了这种方案的可行性。实验结果表明，本系统具有较好的准确性和稳定性，且本系统检测结果与标准仪器相比具有很强的相关性，两者相关系数达0.987，检测结果可实时显示，可实现对血清胆红素溶液的快速定量检测。

上述实施例，仅为对本发明的目的、技术方案和有益效果进一步详细说明的具体个例，本发明并非限定于此。凡在本发明的公开的范围之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。