一种m6A“阅读器”YTHDF2基因改造方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及一种m6A“阅读器”YTHDF2基因改造方法及其应用。

背景技术

RNA存在着150余种修饰，主要包括N6-甲基化腺苷(N6-methyladenosine，m6A)、5-甲基胞苷(m5C)、肌苷(I)、假尿嘧啶核苷(Ψ)、N1-甲基化腺苷(m1A)、5-羟甲基胞苷(hm5C)等修饰，这些修饰被发现存在于真核细胞mRNA中，能影响mRNA的代谢与功能。N6-methyladenosine(m6A)是真核细胞mRNA上最常见的一种转录后碱基修饰，出现频率大约是每条mRNA3-5个残基，真核细胞内超过80％的RNA碱基甲基化是m6A修饰(Zhao BS,Roundtree IA,He C.Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications,Nat Rev Mol Cell Biol,2017,18(1):31-42)。早在上世纪70年代，人们就已经在真核生物的mRNA和lncRNA中发现了m6A修饰。已知绝大部分真核生物中，mRNA5’UTR区域发生的甲基化修饰，在mRNA剪接、编辑、稳定性、降解、多腺苷酸化等方面发挥重要功能；而3’UTR区域发生的甲基化修饰有助于mRNA的出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白一起维持mRNA的结构稳定(Fu Y,Dominissini D,Rechavi G,He C.Gene expression regulationmediated through reversible m(6)A RNAmethylation.Nat Rev Genet,2014,15(5):293-306；Nandan S.Gokhale,et al.RNA modifications go viral,Plos pathogens,2017,1006188；Schwartz S,Mumbach MR,Jovanovic M,et al.Perturbation of m6Awriters reveals two distinct classes of mRNA methylation at internal and 5’sites.Cell Rep,2014,8(1):284-296)。大多数RNA甲基化酶的识别位点为RRACH，也有报道为[G/A/U][G>A]m6AC[U>A>C]。m6A甲基化修饰被证明是可逆的，由甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)等共同参与。人们发现，不少病毒RNA上存在多个m6A修饰位点(Lichinchi G,,et al.Dynamics of the human andviral m(6)A RNA methylomes during HIV-1infection of T cells.Naturemicrobiology.2016；1(4):16011)，但对m6A修饰对病毒复制有怎样的影响目前尚还不清楚。

近年来的研究表明，YTHDF是m6A的读取蛋白，YTHDF的结合会改变m6A RNA的翻译效率和稳定性(Wang X,et al.N6-methyladenosine-dependent regulation ofmessenger RNA stability.Nature,2014,505,117–120.Du H,et al.YTHDF2destabilizes m(6)A-containing RNA through direct recruitment of the CCR4-NOTdeadenylase complex.Nat.Commun.2016,7,12626.)。然而，在猪流行性腹泻病毒感染细胞的过程中，人们还不了解YTHDF蛋白是如何通过m6A影响病毒的增殖的(Nandan S.Gokhale,et al.N6-Methyladenosine in Flaviviridae Viral RNA Genomes RegulatesInfection.Cell Host Microbe.2016,20(5):654-665)。研究显示，YTHDF蛋白可以识别HCVRNA，并负调控HCV子代病毒的产生。由于HCV病毒的复制主要位于细胞内的脂质体内，他们利用免疫荧光技术对HCV感染的细胞内的YTHDF蛋白进行了定位，发现HCV感染诱导YTHDF蛋白向脂质体的定位，识别并结合HCV RNA，在病毒的生命周期内扮演重要角色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种m6A“阅读器”YTHDF2基因改造方法及其应用，利用YTHDF基因可识别病毒RNA并负调控病毒增殖的特性，将Vero细胞系YTHDF2基因进行改造，能够改变宿主细胞中mRNA甲基化水平，从而改变了病毒复制能力。

为实现上述目的，本发明提供一种m6A“阅读器”YTHDF2基因改造方法，利用基因编辑技术对YTHDF2基因进行改造，获得敲除YTHDF2基因的细胞系，包括：sgRNA序列设计，YTHDF2基因敲除，质粒构建和改造基因重组细胞系筛选。

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术。

本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Vero81细胞系为例进行改造，将其基因组中的YTHDF2基因进行突变改造。YTHDF2是近年来被鉴定的可以作为“阅读器”的蛋白，特异性识别转录本上m6A修饰位点。YTHDF2识别m6A修饰位点后，可通过对靶RNA稳定性的调节，参与一系列生理或病理过程的调控。但需要说明的是上述改造利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，但并未说明基因编辑技术只能选用CRISPR/Cas9技术，现有的基因编辑技术如TALEN技术、ZFN技术等均适用。

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述sgRNA序列选择所述m6A“阅读器”YTHDF2基因第三编码区和第四编码区前端1/3区域进行设计，所述序列如SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8所示。所述的m6A“阅读器”YTHDF2基因序列来原于Vero细胞YTHDF2基因，YTHDF2核苷酸序列和蛋白序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述YTHDF2基因敲除技术方法还包括退火体系为：sgRNA-F(100μM)1μL、sgRNA-R(100μM)1μL、10×T4 Ligation Buffer 1μL、ddH

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述质粒构建包括重组质粒构建和验证质粒构建，所述重组质粒为pCas9-YTHDF2-1、pCas9-YTHDF2-2、pCas9-YTHDF2-3，所述验证质粒为pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2。

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述重组细胞系为真核细胞。

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述真核细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞中的任一种。

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述哺乳动物细胞选自非洲绿猴肾细胞Vero 81。

对于上文所述技术方案中，进一步的，所述筛选出的重组细胞系为Vero81-YTHDF2-KD。

本发明通过sgRNA构建Cas9重组质粒，转染细胞后筛选出对YTHDF2基因具有高效切割性能的敲除重组细胞系。上述改造在HEK 293T细胞进行验证，并在Vero81细胞进行改造，本发明并未说明该改造只能适用于Vero81细胞系，对于其他细胞系均适用。

本发明的第二目的是提供一种由上述基因改造方法的应用，具体为基因改造方法在改变猪流行性腹泻病毒增殖中的应用。

本发明的有益效果：

本发明对具有特异性基因的细胞进行基因改造，进而利用靶向药物、免疫治疗等针对性的方法将基因改造后的细胞消灭。本发明第一次提出在Vero81细胞中使用CRISPR/Cas9技术对YTHDF2基因进行敲除、插入、碱基突变，为细胞学或基因学研究提供了全新的概念，具有十分广泛的应用前景。

本发明提供的Vero细胞系YTHDF2基因改造方法，能够改变宿主细胞中mRNA甲基化水平，从而改变病毒增殖能力，为研究病毒与宿主甲基化的关系提供可能。

附图说明

图1为本发明pCas9-YTHDF2重组质粒的菌液PCR鉴定示意图；1-15：菌液PCR产物；16：阴性对照；M：DNA Marker DL 2000；

图2为本发明pCDNA3.1-mcherry和YTHDF2 PCR产物的双酶切结果示意图；1：pCDNA3.1-mcherry质粒的双酶切结果；2：YTHDF2 PCR产物的双酶切结果；M：DNA Marker DL15000；

图3为本发明pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2重组质粒的菌液PCR鉴定示意图；1-5：菌液PCR产物；M：DNAMarker DL 2000；

图4为本发明pX459质粒图谱；

图5为本发明pCDNA3.1-mcherry质粒图谱；

图6为本发明pCas9-YTHDF2 sgRNA重组质粒切割显微荧光强度示意图；

A：pCas9-control+pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2；

B：pCas9-YTHDF2-1+pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2；

C：pCas9-YTHDF2-2+pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2；

D：pCas9-YTHDF2-3+pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2；

图7为本发明野生型和突变型细胞对猪流行性腹泻病毒增殖的影响。

本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规或显而易见实验方法进行。

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内文献或参考书籍所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》(第四版)，科学出版社；Jennifer Doudna,Prashant Mali编著.CRISRP-Cas:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器设备未注明生产商者，均为通过省级招标采购部门购买的常规产品。

本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施案例)中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。

根据非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)的YTHDF2基因序列进行BLAST比对分析，确定Vero细胞系Vero 81中YTHDF2的基因编号为103225249。编码YTHDF2的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述YTHDF2的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

实施案例1：CRISPR/Cas9改造Vero81细胞系YTHDF2蛋白

本发明实施例的细胞基因改造方法：

1、根据非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)的YTHDF2基因序列的编码区和非编码区，综合比对后选择第三编码区和第四编码区前端1/3区域进行sgRNA序列设计，并根据sgRNA设计原则选择三条sgRNA进行效率验证。本实施例中sgRNA选择原则为GC含量适中(40％-60％)，所选区域位于基因的前端。

在本实施案例中，YTHDF2的sgRNA序列如下：

sgRNA1-F(SEQ ID NO.3)：5’-CACCGTCTTATGGACAACTGAGCAA-3’与sgRNA1-R(SEQID NO.4)：5’-CTTGCTCAGTTGTCCATAAGACAAA-3’；

sgRNA2-F(SEQ ID NO.5)：5’-CACCGAGACGAAGAATGGCATTGCA-3’与sgRNA2-R(SEQID NO.6)：5’-CTGCAATGCCATTCTTCGTCTCAAA-3’；

sgRNA3-F(SEQ ID NO.)：5’-CACCGGTCCATTACTAGTAACATCG-3’与sgRNA3-R(SEQ IDNO.8)：5’-CCGATGTTACTAGTAATGGACCAAA-3’。

2、质粒构建及转化方法如下：使用寡糖核苷酸链sgRNA-F和sgRNA-R进行退火。

退火体系为：sgRNA-F(100μM)1μL、sgRNA-R(100μM)1μL、10×T4 Ligation Buffer1μL、ddH

按照以下退火程序进行退火：37℃30min，95℃30min，然后以5℃/min的温度均匀下降至25℃。

以pX459质粒(图4)为模板，进行酶切。取酶切产物50μg、退火产物(经1:200稀释)1μL、2×Quickligation Buffer 5μL、Quick Ligase 1μL，补加ddH

3、验证DNA质粒构建及扩增。

为了便于验证sgRNA的切割效率，本实施案例将供体DNA插入到pCDNA3.1-mcherry质粒(图5)中，得到验证重组质粒。

4、构建验证质粒pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2。

以Vero81细胞基因组DNA为模板，用引物YTHDF2-F(SEQ ID NO.9)：5’-CGGGATCCAATAATGCGTATACTGCCATGTC-3’和YTHDF2-R(SEQ ID NO.10)：5’-GGAATTCCACTTTCTTCTTCCTCTTGGCG-3’进行PCR扩增，扩增产物进行胶回收。PCR胶回收产物和pCDNA3.1-mcherry质粒分别进行BamHI和EcoRI双酶切，取胶回收产物和质粒各20μL，再分别加入BamHI2.5μL、EcoRI 2.5μL、10×K buffer 5μL，加水补足至50μL，混匀后37℃水浴4h，酶切结果如图2，胶回收后获得酶切产物。将两种酶切产物各2μL、T4连接酶1μL、T4连接酶缓冲液1μL，加水补足至10μL，混匀后置于4℃冰箱过夜连接。连接产物经转化、挑斑、测序鉴定后，提取质粒保存备用，命名为pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2，PCR鉴定结果如图3。

实施案例2：改造的Vero81细胞YTHDF2蛋白表达检测

1、pCas9-YTHDF2质粒切割效率验证。

从液氮罐中取出Vero81细胞迅速置于37℃流动的水浴锅中，大约2-3min融化完全后在细胞房超净台用酒精棉擦拭冻存管外部，转移至25mL细胞培养瓶中，4h细胞贴壁后更换相应的新鲜完全培养基，待细胞长满后，将细胞1:3传代。实验前24h将Vero81细胞接种至6孔细胞培养板中培养，待细胞密度达到70％～80％的汇合率即可。取出pCas9-YTHDF2-1、pCas9-YTHDF2-2、pCas9-YTHDF2-3和pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2质粒，利用NanoDrop2000测定核酸浓度。将转染试剂Lipofectamine 2000和pCas9-YTHDF2、pCDNA3.1-mcherry-YTHDF2按一定比例混合，并加入合适体积的无血清培养基，将混合液在室温静置10-15min，加入六孔板，并在4-6h换成10％FBS DMEM高糖培养基，培养24-48h后用荧光显微镜拍照计算荧光强度。结果如图6显示，pCas9-YTHDF2-1切割效率最高，选择其作为下阶段的材料。

2、Vero81细胞的转染和筛选。

实验前一天铺板Vero81细胞准备转染；实验当天从细胞培养箱中取出前一天的细胞于显微镜下观察细胞密度，达到70％～80％的汇合率即可进行转染。使用pCas9-YTHDF2-1质粒和Lipofectamine 2000进行转染，转染后24h加入终浓度为2ng/mL的嘌呤霉素进行筛选，9-10d后采用无限倍比稀释法进行单克隆细胞株的筛选。

3、Vero81细胞YTHDF2基因敲除结果验证。

对单克隆细胞株进行基因组DNA提取，以Vero81细胞基因组DNA为模板，用引物YTHDF2-F(SEQ ID NO.9)：5’-CGGGATCCAATAATGCGTATACTG CCATGTC-3’和YTHDF2-R(SEQ IDNO.10)：5’-GGAATTCCACTTTCTTCTTC CTCTTGGCG-3’进行PCR扩增，扩增产物进行胶回收测序。挑选测序结果为编码蛋白发生移码且生长状态良好的细胞系作为结果验证，命名为Vero81-YTHDF2-KD细胞系。

实施例3：改造的Vero细胞YTHDF2蛋白对病毒增殖的影响

YTHDF2基因敲除可以特异性的影响猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。实时荧光定量PCR扩增比较野生型Vero81细胞和改造后的Vero81细胞内猪流行性腹泻病毒N基因表达量中YTHDF2基因的表达量。从图7可知，相比于野生型Vero81细胞，猪流行性腹泻病毒在改造后的Vero81-YTHDF2-KD细胞增殖效果显著高于其在野生型细胞内的增殖。由此说明，敲除YTHDF2能显著促进病毒的复制。

最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。