MDM2抑制剂在调控结肠癌化疗药物敏感性中的应用
文献发布时间:2023-06-19 11:24:21
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及MDM2抑制剂与结肠癌化疗药物联合使用,用于增加结肠癌化疗敏感性。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的胃肠道恶性肿瘤,是造成人类癌症相关死亡的第二大原因。目前对于结直肠癌的治疗仍以手术结合放化疗的方案为主,其中辅助化疗的敏感性是影响患者生存期的主要因素之一。研究显示,大多数患者在各种辅助化疗后3-12个月就会出现药物敏感性低、化疗耐受等现象。因此迫切需要寻找和补充新的更有效的克服耐药策略,从而实现更好的治疗效果。
MDM2(murine doubleminute 2,鼠双微体基因2)MDM2是一种E3泛素连接酶,通过与靶蛋白结合对其进行泛素化修饰介导蛋白质的降解,从而参与多种细胞生物学行为的调控。当细胞中MDM2高表达时,p53活性受到强烈抑制,导致p53无法发挥作用,造成细胞持续增殖从而诱导肿瘤的发生。对此,人们研发了多种MDM2抑制剂,其中Nutlin-3a是研究最为深入和广泛的一个靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂。
5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)作为胃肠道恶性肿瘤的一线治疗药物,单药或联合用药在结直肠癌的临床治疗中取得良好效果。然而,5-FU治疗的临床获益往往是短暂的,使用5-FU的患者易对其产生耐药性而使得总体有效率较低,大大降低化疗效果。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand,TRAIL)能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性作用,具有极大的临床应用前景。然而,相当多的肿瘤细胞对TRAIL具耐药阻碍了TRAIL的应用。
发明内容
本发明的目的是提供临床治疗结肠癌的新的用药趋势。发明人在临床实践中,发现MDM2抑制剂可改善结肠癌化疗药物的敏感性。在同等浓度下,将MDM2抑制剂与结肠癌化疗药物(5-FU及TRAIL)联合使用,可增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制能力。
第一方面,本发明提供MDM2抑制剂在调控结肠癌对化疗药物敏感性中的应用。
第二方面,本发明提供MDM2抑制剂在制备提高结肠癌对化疗药物敏感性药物中的应用。所述MDM2抑制剂可用于制备提高结肠癌对TRAIL敏感性的药物;所述MDM2抑制剂用于制备提高结肠癌对5-氟脲嘧啶敏感性的药物。
在本发明所提供的应用中,Nutlin-3a通过诱导内质网应激从而增加结肠癌化疗敏感性,或Nutlin-3a通过诱导自噬增加结肠癌化疗敏感性。
第三方面,本发明提供一种组合物在制备治疗结肠癌药物中的应用,所述组合物包含MDM2抑制剂、5-氟脲嘧啶和/或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL);在本发明所提供的药物组合物中,所述MDM2抑制剂为Nutlin-3a。
本发明提供的组合物,可抑制结肠癌细胞的生长、增殖或克隆;也可诱导结肠癌细胞的凋亡。
本发明提供的组合物,可抑制人结肠癌细胞RKO或人结肠癌细胞HCT116的生长、增殖或克隆;或抑制裸鼠结肠癌皮下实体瘤的生长。
第四方面,本发明还提供上述应用在制备提高结肠癌治疗效果的药物中的应用。具体地,为了制备提高结肠癌治疗效果的药物,将MDM2抑制剂与5-氟脲嘧啶或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合使用。
本发明的有益效果至少在于:
(1)本发明通过实验证明,将Nutlin-3a和5-FU联合使用,可以显著增强5-FU的治疗效果;将Nutlin-3a和TRAIL联合使用,可以显著增强TRAIL的治疗效果,联合使用后显著抑制结肠癌细胞的生长、增殖,诱导结肠癌细胞的凋亡;
(2)本发明通过体外实验证实,将Nutlin-3a和5-FU联合使用或Nutlin-3a和TRAIL联合使用增强了裸鼠皮下瘤模型中的抗肿瘤效果,实现了协同增效的作用;
(3)本发明提供的Nutlin-3a和5-FU联用以及Nutlin-3a和TRAIL联合用药治疗结肠癌的新方案,为结肠癌的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径,解决了临床治疗中结直肠癌患者经常发生化疗敏感性差的问题,还为MDM2抑制剂Nutlin-3a的应用提供了新的领域。
附图说明
图1为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理下的人结肠癌细胞存活率图。
图2为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理下的人结肠癌细胞克隆形成图。
图3为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理下的人结肠癌细胞凋亡情况图。
图4为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理人结肠癌细胞后的凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的Western blotting结果图。
图5为实施例2中应用CompuSyn软件分析得到的RKO细胞各联合实验组的联合指数CI图。
图6为实施例2中应用CompuSyn软件分析得到的HCT116细胞各联合实验组的联合指数CI图。
图7为实施例2中Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理时,人结肠癌RKO细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的Western blotting结果图。
图8为实施例2中Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理时,人结肠癌HCT116细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的Western blotting结果图。
图9为实施例2中MDM2抑制剂Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理下的结肠癌细胞RKO细胞凋亡情况图。
图10为实施例2中MDM2抑制剂Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理下的结肠癌细胞HCT116细胞凋亡情况图。
图11为实施例3中Nutlin-3a单独用药或分别与5-FU、TRAIL联合用药处理下,结肠癌细胞增殖情况图。
图12为实施例3中Nutlin-3a单独用药或分别与5-FU、TRAIL联合用药处理下,结肠癌细胞成瘤图。
图13为实施例3中Nutlin-3a单独用药或分别与5-FU、TRAIL联合用药处理下裸鼠皮下结肠癌模型实体瘤TUNEL检测凋亡情况图,图示标尺为100μm。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。本发明使用针对于MDM2的小分子抑制剂Nutlin-3a以及化疗药物5-FU以及TRAIL,以下所述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本发明具体实施例中主要说明Nutlin-3a能够增强结肠癌细胞对化疗药物5-FU以及TRAIL的敏感性,为临床癌症治疗提供新型的药物联合使用的范例。
本发明进行实验所要用到的材料与试剂:
细胞来源:人源结肠癌细胞HCT116细胞和RKO细胞购自美国American typeculture collection(ATCC)公司。
本研究中用到的细胞有人结肠癌HCT1160细胞和RKO细胞,两种细胞用DMEM培养基培养。细胞培养基购买于Gibco公司,用于培养细胞前加入10%胎牛血清和1%的青霉素与链霉素。
本研究用到的抗体详细信息见表1。
表1抗体信息表
药物来源:MDM2抑制剂Nutlin-3a购自Sigma公司;5-FU和TRAIL均购自MCE公司。
MDM2抑制剂Nutlin-3a粉末用DMSO配成10mM初浓度,从MCE公司购买的5-FU粉末用DMSO配成10mM初浓度,TRAIL粉末用DMSO配成1mM初浓度。使用时加到培养基中的Nutlin-3a浓度范围为12.5-100μM,联合用药时,其中Nutlin-3a固定使用浓度为45uM,5-FU固定使用浓度为50ug/ml,TRAIL固定使用浓度为100ng/ml。
实施例1 MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞存活、增殖和凋亡的影响
1、MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞存活率的影响
选取人的结肠癌细胞HCT-116和人结肠癌细胞RKO,用含有10%FBS和1%双抗的DMEM培养基,常规培养于37℃、5%CO
细胞存活率(cell viability rate)=A用药组/A对照组×100%。
结果如图1所示,结肠癌细胞RKO和HCT116经过不同浓度MDM2抑制剂Nutlin-3a后,细胞存活率明显下降。
Nutlin-3a浓度为12.5μM时,人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为66.51%;Nutlin-3a浓度为25μM时,人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为35.55%;Nutlin-3a浓度为50μM时,人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为24.97%;Nutlin-3a浓度为100μM时,人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为23.28%。
Nutlin-3a浓度为12.5μM时,人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为92.77%;Nutlin-3a浓度为25μM时,人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为82.16%;Nutlin-3a浓度为50μM时,人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为28.08%;Nutlin-3a浓度为100μM时,人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为15.09%。
表明MDM2抑制剂Nutlin-3a能够有效降低结肠癌细胞的存活率并且呈浓度依赖性。
2、MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞增殖的影响
将处于对数生长期的结直肠癌细胞RKO、HCT-116弃去培养瓶中培养液,加入1ml0.25%胰蛋白酶消化细胞1~2分钟,制成细胞悬液,取每孔500个细胞均匀铺到六孔板中,待细胞完全贴壁后,更换含不同浓度Nutlin-3a的培养基,继续在37℃培养箱中孵育细胞,孔板中出现肉眼可见克隆时终止培养,吸去培养基,用PBS小心清洗,4%的组织固定液固定细胞20分钟,弃去固定液,用结晶紫染色20分钟,PBS清洗,在空气中风干后拍照。
结果如图2所示,结肠癌细胞RKO和HCT116经过不同浓度MDM2抑制剂Nutlin-3a后,克隆形成数目明显下降,表明MDM2抑制剂Nutlin-3a可以显著抑制结肠癌细胞RKO和HCT116克隆形成能力,抑制其增殖能力。
3、MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞凋亡的影响
将对数生长期的RKO和HCT116细胞用胰酶消化后,取5×10
图3结果显示,对照组人结肠癌细胞RKO凋亡率为1.98%;Nutlin-3a浓度为35μM时,人结肠癌细胞RKO的凋亡率为3.73%;Nutlin-3a浓度为50μM时,人结肠癌细胞RKO的凋亡率为4.6%;Nutlin-3a浓度为75μM时,人结肠癌细胞RKO的凋亡率为14.43%;
对照组人结肠癌细胞HCT116凋亡率为2.48%;Nutlin-3a浓度为35μM时,人结肠癌细胞HCT116的凋亡率为3.13%;Nutlin-3a浓度为50μM时,人结肠癌细胞HCT116的凋亡率为8.72%;Nutlin-3a浓度为75μM时,人结肠癌细胞HCT116的凋亡率为11.13%。
Nutlin-3a处理组凋亡率高于对照组,并呈现剂量的依懒性。
取对数生长期的结肠癌细胞,常规胰酶消化细胞,消化后均匀接种到6cm的皿里,等到细胞完全贴壁后,换新鲜培养基并加药,Nutlin-3a浓度设置为:0μM、35μM、50μM、75μM;在显微镜下观察细胞形态,约20小时后,观察到最大加药浓度细胞大概有50%细胞皱缩、漂浮时,收集细胞,加入适量的裂解液使沉淀充分裂解,离心后取上清。按照说明书上的方法用BCA法测量蛋白浓度,根据蛋白浓度计算出上样体积,剩余蛋白样品加入适量5×的蛋白上样缓冲液,使5×的蛋白上样缓冲液在蛋白中稀释成1×,混匀,置于金属浴中,100℃加热10min变性,根据标准方法进行免疫印迹分析,相关抗体见抗体信息表。
结果如图4所示,Nutlin-3a浓度为0μM、35uM、50uM、75uM时,人结肠癌细胞RKO凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为:0.20、0.51、0.75、0.95。人结肠癌细胞HCT116凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为:0.06、0.13、0.57、1.52。
随着药物浓度的增加,Nutlin-3a诱导结肠癌细胞RKO和HCT116凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达逐渐增强。
实施例2 MDM2抑制剂Nutlin-3a分别与5-FU、TRAIL联合用药对结肠癌细胞存活、增殖和凋亡的影响
常规培养结肠癌细胞RKO、HCT116,消化后并将细胞以1.2×10
表2 RKO细胞不同药物处理组的联合指数CI
图5及表2结果显示,在RKO细胞中,5-FU与Nutlin-3a联用,其中给药浓度5-FU50ug/ml和Nutlin-3a 55uM时,CI<0.9,药物联合具有协同效果;TRAIL与Nutlin-3a联用,其中给药浓度TRAIL 100ng/ml和Nutlin-3a 55uM时,CI<0.9,药物协同效率最高。因此Nutlin-3a与5FU/TRAIL联用能够协同抑制RKO细胞的增殖,其中给药浓度为5-FU 50ug/ml、TRAIL 100ng/ml和Nutlin-3a 55uM。这表明在结肠癌细胞RKO中Nutli-3a对5-FU和TRAIL有很强的药物增敏作用。
Nutlin-3a与5FU/TRAIL联用在HCT116细胞中的协同增效探究结果如图6和表3所示。
表3结肠癌细胞HCT116不同药物处理组的联合指数CI
图6及表3结果显示,在HCT116细胞中5-FU与Nutlin-3a联用,大部分CI<0.9,因此5-FU与Nutlin-3a联用能够协同抑制HCT116细胞的存活率,其中给药浓度为5-FU 60ug/ml和Nutlin-3a 55uM时,药物协同效率最高。TRAIL与Nutlin-3a联用,其中给药浓度TRAIL100ng/ml和Nutlin-3a 55uM时,CI<0.9,二者具有协同作用。因此Nutlin-3a与5FU/TRAIL联用能够协同抑制HCT116细胞的增殖,其中给药浓度为5-FU 60ug/ml、TRAIL 100ng/ml和Nutlin-3a 55uM。这表明在结肠癌细胞HCT116中Nutli-3a对5-FU和TRAIL有很强的药物增敏作用。
将RKO和HCT116细胞以5×10
图7结果显示,结肠癌RKO中:对照组,5-FU,Nutlin-3a,Nutlin-3a+5-FU凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为:0.04、0.07、0.18、1.05;对照组,TRAIL,Nutlin-3a,Nutlin-3a+TRAIL凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为:0.05、0.03、0.35、1.08。
图8结果显示结肠癌HCT116中:对照组,5-FU,Nutlin-3a,Nutlin-3a+5-FU凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为:0.06、0.22、0.28、1.12;对照组,TRAIL,Nutlin-3a,Nutlin-3a+TRAIL凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为:0.09、0.33、0.16、0.77。
合加药组结肠癌RKO和HCT116细胞的凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3蛋白水平均比单独加药组明显要高,这提示Nutlin-3a与5-FU和TRAIL联合使用能够显著增强5-FU和TRAIL诱导结肠癌细胞凋亡的能力。
将RKO和HCT116细胞用胰酶消化,以4×10
图9结果显示,结肠癌RKO中:对照组,5-FU,TRAIL,Nutlin-3a,Nutlin-3a+5-FU,Nutlin-3a+TRAIL分别处理细胞后,RKO的凋亡率分别为:2.41%、10.18%、4.95%、5.9%,17.59%,17.69%。
图10结果显示,结肠癌HCT116中:对照组,5-FU,TRAIL,Nutlin-3a,Nutlin-3a+5-FU,Nutlin-3a+TRAIL分别处理细胞后,HCT116的凋亡率分别为:2.49%、5.36%、4.72%、10.85%,23.75%,18.24%。
5-FU和TRAIL联合药物组结肠癌RKO和HCT116细胞的凋亡相关蛋白Cleavedcaspase-3蛋白水平均比单独加药组明显要高,这提示Nutlin-3a与5-FU和TRAIL联合使用,显著增强了5-FU和TRAIL诱导细胞凋亡的效果。
实施例3 Nutlin-3a分别与5-FU和TRAIL联合使用在动物水平的抗肿瘤作用
实施例2的体外实验证明了在细胞水平上,Nutlin-3a分别与5-FU和TRAIL联合使用对RKO细胞和HCT116细胞具有明显的肿瘤杀伤作用。
本实施例进行动物水平的实验,具体步骤如下:
大量培养HCT116细胞,通过皮下注入约5周大的裸鼠体内,每只裸鼠皮下约注射1×10
图11的结果显示随着注射药物天数的增加,PBS组的裸鼠肿瘤体积增长的最快,其次是5-FU组,再是TRAIL组,而Nutlin-3a与5-FU和TRAIL药物联合组经过15天的测量,肿瘤体积几乎没有增长,说明药物联合处理对裸鼠体内的肿瘤具有很好的抑制作用。待药物处理15天时,我们把每组每只裸鼠的肿瘤组织切下并按组按大小排好,可以清楚的看到药物联合组对肿瘤的抑制作用非常明显(图12)。肿瘤的石蜡组织切片TUNEL染色显示药物联用的肿瘤组织中TUNEL荧光强度明显增强,凋亡率增加(图13)。这些与体外的细胞实验结果一致。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
- MDM2抑制剂在调控结肠癌化疗药物敏感性中的应用
- IL-6R抑制剂及IL-4R抑制剂联合用药在乳腺癌化疗药物的中的应用