一种蛋白纳米酶及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种蛋白纳米酶及其制备方法和在制备抗皮肤衰老护肤品、防治溃疡药物、镇痛药物、消炎药物、止血药物、创面修复药物或防治射线辐射损伤药物中的用途。

背景技术

近来，由于纳米技术的不断发展和产业成熟，研究发现新型人工酶—纳米酶具有开发成本低、易于生物化学修饰、催化效率高、生物活性更好、生物稳定性好等优点，比如Fe

硒是人体必需微量元素，在生理活动中发挥着重要作用。硒具有抗氧化、调节免疫、拮抗有害重金属等重要生物功能。缺硒与40多种疾病相关，特别严重的如AIDS、乙型肝炎、肝癌、克山病、大骨节病、心脑血管疾病等。同时，全球90％以上的地区和人群均受到缺硒的影响。然而，补硒面临其有效性和安全性剂量谱狭窄的第一大问题，如亚硒酸钠(小鼠急性毒性LD

前期研究发现纳米硒颗粒具有清除自由基和超氧根的类氧化酶性质，但尚未见到白蛋白硒纳米酶的绿色制备及在皮肤衰老、溃疡、镇痛、消炎、止血、创面修复和射线辐射损伤方面具有良好的防治功效。

发明内容

为了解决现有技术存在的硒元素补充有效剂量和安全性性狭窄等缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种蛋白硒纳米酶的制备方法，该方法操作简单，将硒化合物和鱼精蛋白混合液加入富含巯基群的还原型蛋白溶液中，集成鱼精蛋白碱性氨基酸诱导组装、还原蛋白内部过量巯基群及硒化合物离子在白蛋白内部被还原，获得颗粒均一，良好分散，可室温长期保存及在体液中稳定的新型蛋白硒纳米酶。

本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的蛋白硒纳米酶。

本发明的再一目的在于提供一种上述蛋白硒纳米酶的用途。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种蛋白硒纳米酶的制备方法，将硒化合物和鱼精蛋白加入经过二硫键还原剂处理后的蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液中，硒化合物在蛋白内部原位还原成单质纳米硒，集成蛋白内部N、S、O活性基团和过量巯基群，以及单质纳米硒和鱼精蛋白的碱性氨基酸诱导组装，获得蛋白硒纳米酶。

所述二硫键还原剂为还原型谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)或三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)；

所述白蛋白为含二硫键的蛋白，包括天然来源或工程化重组得到的人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、驴血清白蛋白、转铁蛋白中的一种以上；

所述硒化合物为二氧化硒、亚硒酸盐、硒酸盐或其硒的硫代衍生物。

上述的制备方法，具体包括如下步骤：

A、将鱼精蛋白溶于水，再加入硒化合物，制备得到硒化合物和鱼精蛋白混合溶液；

B、将白蛋白加入二硫键还原剂溶液中，置入密封或除氧的瓶中，搅拌均匀，在33～60℃反应10～300min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液；

C、向步骤B所得白蛋白溶液中加入步骤A所得混合溶液，得到白蛋白终浓度为0.01～100mg/mL的反应液，4～24℃密封条件下进行搅拌反应1～12小时，再经过透析，得到蛋白硒纳米酶溶液。

步骤A所述鱼精蛋白在混合溶液中质量浓度为0.1～10％，所述硒化合物在混合溶液中浓度为1～10mM。

步骤B所述二硫键还原剂溶液是指二硫键还原剂的磷酸盐或生理盐水溶液，pH值为5.0～9.0，其浓度为0.01～60mM，优选为0.1～40mM，更加优选为1～80mg/mL；所述白蛋白在还原型白蛋白溶液中的浓度为0.01～200mg/mL，更加优选为0.5～100mg/mL。

步骤B所述反应是在37～50℃条件下反应30～200min。

步骤C所述透析是将溶液放入透析袋，并于0～30℃的磷酸缓冲溶液或生理盐水中透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物；透析分子截留不低于1000；所述白蛋白终浓度为30～60mg/mL。

一种由上述的制备方法制备得到的蛋白硒纳米酶。

所述蛋白硒纳米酶的粒径分布范围为10～250nm，优选为10～180nm；蛋白硒纳米酶中的硒：鱼精蛋白：白蛋白的摩尔比为1：(1/600～1/30)：(1/30～1)，优选地，硒：鱼精蛋白：白蛋白的摩尔比为1：(1/500～1/50)：(1/20～2)。

所述蛋白硒纳米酶在低温和常温情况下，在溶液中和各种体液中均可稳定存在。

上述的蛋白硒纳米酶在制备抗皮肤衰老护肤品、防治溃疡药物、镇痛药物、消炎药物、止血药物、创面修复药物或防治射线辐射损伤药物中的用途。

蛋白硒纳米酶在使用的时候可以制成、口服制剂和非口服制剂。

本发明的原理：

本发明白蛋白在二硫键还原剂处理后蛋白内部空间结构打开，打开后的白蛋白是带负电荷的，而鱼精蛋白在中性和酸性环境下是带正电荷的，正负电荷互相吸引就拉近了白蛋白的重新组装。而白蛋白中被二硫键断开的-SH巯基之间也可以互相重新组装。白蛋白分子内的-SH巯基还将硒化合物原位还原成零价的纳米硒，纳米硒与蛋白上的N、O和S结合重新组装。本发明集合了上述多种效应，获得良好稳定性的新型的蛋白硒纳米酶

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明将硒化合物和鱼精蛋白复合液加入还原型白蛋白溶液中，通过和鱼精蛋白碱性氨基酸诱导组装效应、集成还原蛋白内部过量巯基群及硒化合物在白蛋白内部被还原，获得良好稳定性的新型的蛋白硒纳米酶。功能研究表明，该白蛋白硒纳米酶在皮肤衰老、溃疡、镇痛、消炎、止血、创面修复和射线辐射损伤方面具有很好的功能。

附图说明

图1为APSeM的DLS水合粒径图。

图2为APSeM的TEM电镜图。

图3为APSeM和NSe的氧化酶模拟评价图。

图4为APSeM和NSe对正常皮肤细胞毒性影响图。

图5为APSeM和NSe对辐射胶原细胞HaCaT的生存率影响图。

图6为APSeM和NSe对辐射胶原细胞HaCaT的增殖率影响图。

图7为APSeM和NSe对辐射小鼠皮肤胶原组织影响图。

图8为APSeM和NSe对辐射小鼠皮肤的HE影响图。

图9为APSeM和NSe对辐射小鼠皮肤胶原蛋白代谢因子Col1a1、Col3a3和MMP1的mRNA影响图。

图10为APSeM和NSe对辐射小鼠皮肤炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA影响图。

图11为APSeM和NSe对辐射小鼠皮肤氧化应激信号Nrf2和Gpx1的mRNA影响图。

图12为APSeM和NSe对辐射小鼠皮肤衰老标志物P16和P21的mRNA影响图。

图13为APSeM和NSe对辐射小鼠皮肤抗氧化蛋白SOD和MDA表达影响图。

图14为APSeM和NSe对放射肠炎小鼠血清炎症因子和过氧化物酶的影响图。

图15为APSeM和NSe对放射肠炎小鼠体重影响图。

图16为APSeM和NSe对放射肠炎小鼠生存期影响图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1纳米硒(NSe)的制备：

参照张劲松的专利申请(公开号CN1059638C)和文献(Life Sciences 2004；75：237-244.)进行纳米硒的制备：即将1mL的25mM的亚硒酸钠和4ml含有20mg牛血清白蛋白的25mM谷胱甘肽(GSH)混合均匀，然后用1M的氢氧化钠调pH为7.2，即获得红色的纳米硒和反应副产物GSSG混合物，用透析袋经过96小时透析，冻干，获得含有牛血清白蛋白的红色纳米硒(NSe)，纳米颗粒NSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约20～60nm。

实施例2白蛋白硒纳米酶(APSeM)的制备：

A、将鱼精蛋白溶于去离子水，再加入硒化合物，搅拌充分，制备得到硒化合物和鱼精蛋白混合溶液(简称A溶液)；鱼精蛋白在混合溶液中的质量浓度为0.5％，硒化合物在混合溶液中浓度为10mM；

B、将人血清白蛋白(HSA)加入10mM的GSH新鲜溶液(pH值为6.0)中，置入密封的瓶中，搅拌均匀，在35℃反应90min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液(简称B溶液)，HSA在还原型白蛋白溶液中的终浓度为60mg/mL；

C、向还原型白蛋白溶液中加入硒化合物和鱼精蛋白混合溶液，获得白蛋白的终浓度为30mg/mL的反应溶液(简称C溶液)，密闭在4℃搅拌12小时，得到红透的蛋白硒纳米酶溶液，放入透析袋(MW不小于1000)，并于4℃环境中按6～12小时/次进行透析3天，将多余的还原剂和硒化合物及其副产物除去，得得白蛋白硒纳米酶。

D、经过BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，且取样在50％硝酸于60℃水浴锅中消化过夜，ICP-MS检测，计算Se与HSA的摩尔分子比约为8.5:1；纳米尺寸均一，分布均匀(见图1和图2)，平均粒径约20～30nm。

实施例3～9白蛋白硒纳米酶(APSeM)的制备：

参照实施例2制备流程，在实施例3～9中，我们进行了制备条件的调整，其中还原剂在实施例3，7和9用GSH，实施例4，5和8用TCEP；实施例6用DTT；实施例7用转铁蛋白，实施例8用牛血清白蛋白；实施例9用卵白蛋白制备；其他条件与实施例2一致。

表1：实施例3～9中各投料条件的优化比例

实施例10白蛋白硒纳米酶(APSeM)的表征和鉴定：

采用动态光散射仪DLS，对前述实施例2获得的白蛋白硒纳米酶和人血清白蛋白(HSA)分别进行测定其水合粒径，从结果来看，HSA和APSeM水合粒径大约为10nm和100nm左右，PDI值均<0.20，提示水溶液中的分散性良好，具体如图1。同时，对实施例2获得的白蛋白硒纳米酶进行了透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope)TEM确证，扫描结果表明其脱水后的粒径约25nm左右，具体如图2。

为了比较实施例2的APSeM和对照实施例1中NSe的元素组成区别，将其分别溶解在去离子水中，然后用15000g离心1小时，收集APSeM和NSe的沉淀，对离心上清中Se元素和白蛋白的浓度进行测定，发现NSe颗粒中99.99％成分为Se元素，0.01％的组成为分散剂白蛋白的物理吸附和白蛋白半胱氨酸通过SH于NSe的键合效应；而APSeM组成则不同，Se元素的含量为1.03％，其他组成的98.97％含量为蛋白质化合物。经过圆二色谱测定，APSeM具有与白蛋白几乎一样的特征峰，提示APSeM确实是通过自主组装制备成功，且没有改变HSA的高级结构。进一步进行傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析，跟NSe的光谱不同，发现APSeM纳米颗粒组成中可以发现HSA的C＝O键(～1730和1680cm

实施例11白蛋白硒纳米酶(APSeM)的氧化酶模拟评价：

为了探究NSe(实施例1所得)或APSeM(实施例2所得)模拟氧化酶活性，在10mL的离心管中先加入3.7mL的醋酸钠(0.2M，pH 4.0)，取200μL的纳米粒子(20μg/mL)或去离子水(对照)加入到缓冲溶液，混匀；然后，加入100μL体积0.1mM浓度的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液。25℃的室温下，反应60min，每10min检测反应体系在652nm处的吸光度。实验结果表明(如图3)，APSeM具有NSe不可比拟的纳米氧化酶特性。

实施例12白蛋白硒纳米酶(APSeM)的保存放置时间稳定性评价：

对实施例3所得APSeM纳米颗粒的水合粒径和色泽进行观察，证明其可以在不同温度和时间条件下长期稳定保存(具体见表2和表3)。

表2不同放置温度和时间下的观察

表3不同放置温度和时间的纳米粒径改变(平均值±SD)

实施例13白蛋白硒纳米酶(APSeM)在模拟体液中的稳定性评价：

参考中国药典，配置人工胃液和人工肠液；实验所用血浆为临床所用的替代血浆样品。

针对前述实施例4所制得的APSeM，分别取0.5mL稀释至2mL，加入截留分子量为3500的密理博(millipore)透析管中，放入37℃恒温的1000mL的人工体液中搅拌，经过ICP-MS分析，表4结果提示APSeM在人工体液中可以稳定存在。

表4 APSeM在人工体液中的稳定性评价(平均值±SD)

实施例14 APSeM的急性毒性、生物利用度和体内活性评价：

采用本发明实施例5所得APSeM对小鼠的急性毒性进行测试，APSeM的LD

对正常和癌细胞活性的作用：跟亚硒酸钠对比，在10～800ng/mL时，APSeM对H

口服对小鼠细胞硒酶活性的作用：昆明小鼠通过灌胃口服APSeM和亚硒酸钠(0.5和1.0mg/kg)，与亚硒酸钠比，1.0mg/kg组APSeM可以显著提高GPx酶活性，小鼠肝脏中的GPx1，GPx4基因具有显著上调作用(5.1～10.3倍)，对小鼠而对TR诱导效应弱于亚硒酸钠。

口服生物利用度比较：与有机硒硒蛋氨酸和无机纳米硒NSe灌胃比较，我们发现APSeM具有更好的生物吸收利用度(4.7～8.7倍)。

硒元素的组织器官分布：我们在缺硒小鼠模型上灌胃2.0mg/kg的硒元素，发现APSeM可以明显提高昆明小鼠的全血和各组织器官中的硒元素水平，尤其是在小鼠肝脏、血细胞和肾脏系统的补硒作用较快。

实施例15 APSeM抗皮肤衰老的体外和体内活性评价：

细胞评价实验：皮肤细胞株L929和HaCaT均购买于中国科学院上海细胞库，其中L929细胞用于评价本发明实施例5制备的APSeM及NSe对正常皮肤细胞的毒性情况和考察剂量安全性；HaCaT细胞和APSeM及NSe共孵12个小时后，采用紫外灯(照射细胞的UVB紫外灯为311nm，16cm距离，辐照18s，80mJ/cm

动物评价实验：6周龄的ICR小鼠，在麻醉下去毛，将0.1mL的100ng/mL的APSeM、NSe和生理盐水对照组在皮下进行注射，在紫外灯340nm，20cm距离，8W功率，30s，3次/周，连续10周诱导皮肤光老化。在实验结束后，麻醉小鼠进行牺牲，将对应的皮肤组织进行取样，拍照，做基因水平、免疫组化HE与Masson染色胶原纤维蛋白及相关蛋白表达水平的生理生化分析(mRNA:胶原蛋白代谢因子Col1a1、Col3a3、MMP1；炎症因子TNF-α、IL-1β；氧化应激信号Nrf2、Gpx1；衰老标志物P16和P21；Actin或Gapdh为对照；皮肤组织的抗氧化蛋白表达：SOD、MDA)，如图4～13所示，*表示与模型组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；**表示与模型组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异。这些实验结果发现，ASeM对正常皮肤细胞的安全性显著提高，对辐射后的胶原细胞HaCaT的生存、增值率和活力具可以显著改善；在ICR小鼠模型上，APSeM在整体上达到对照组皮肤的光滑、白嫩和细腻度，在mRNA与蛋白分子水平是均可以抵抗UVB紫外灯诱导的光损伤效应，与修复胶原蛋白、减少炎症因子、降低氧化应激和抵抗衰老机理有关；这些结果表明APSeM比NSe具有更优秀的抗皮肤老化作用，有助于皮肤老化损伤的修复功能。

实施例16 APSeM在口腔口臭、溃疡、龋齿、止血和创面修复的临床应用

将实施例4中制备的APSeM按5％的体积比复配在无菌生理盐水中作为漱口水使用：

(1)某女患者，李某，35岁，长期咀嚼槟榔导致牙周疼痛、炎症，咬不动硬食物，也吃不了辛辣饭菜，用市面上常用的抗炎脱敏的口腔药物治疗10天后未见疗效。每次含漱本发明漱口水5分钟，3次后，患者牙痛显著缓解；3天后，炎症部位消肿，可正常进食。

(2)某女患者，蔡某，46岁，长期抽烟，加上长期槟榔，牙周疼痛发炎。经过一天早中晚含漱本发明漱口水各一次，5分钟/次，患者牙疼即止，三天后可正常进食；患者反馈她含漱2天，停3天，止痛牙疼效果仍然有效。

(3)某女患者，冯某，52岁；长期口臭。按5分钟/次，每日3次含漱且咽入，一周后，患者反馈口臭明显清除；并且经过幽门螺旋杆菌测定，患者的HP指数显著降低。

(4)某男患者，刘某，29岁，阻生智齿拔除术后3天，被拔牙部位的创面仍存在自发性出血，用无菌棉球浸泡本漱口水，给患者压迫拔牙创口5分钟，止血效果显著；患者拔牙部位的自发性出血立即停止。

(5)某女患者，丁某，28岁，采用正畸支抗钉植入术后，按3次/天含漱本发明漱口水，每次5分钟，植入创面在第3天已基本愈合。

(6)某男患者，朗某，37岁，行右下阻生齿拔除术，按3次/天含漱本发明漱口水，每次5分钟，患者拔牙创面愈合快，第6天已经基本愈合。

(7)某男患者，王某，39岁；糖尿病并发引起牙周炎红肿，口腔溃疡。服用本发明漱口水且咽下，每天三次，每次含漱一周后，炎症减轻，5个月后基本痊愈。

(8)某女患者，李某，29岁；口腔异味显著，肠道便秘；含漱本发明漱口水3次/天，1周后，异味明显减轻，医院胃镜检查结果显示患者的HP指数降低，便秘减轻。

(9)某男患者，王某，25岁；进行植入义齿，具有严重创面；患者含本发明漱口水5分钟并且咽下，一日三次，出血即止，疼痛感得到缓解；含漱3天后，患者创面基本痊愈。

(10)某男患者，谭某，36岁；患者拔智齿后，含漱本发明漱口水5分钟且咽下，一日三次，出血即止，疼痛缓解。连续使用3天后，患者创面完全愈合。

实施例17 APSeM的镇痛作用实验

17.1材料与方法：

17.1.1药品与仪器：将300ng/mL的本发明实施例5的APSeM和等剂量的NSe(实施例1所得)分别稀释在生理盐水中(10％)，配制成实验研究用漱口水，其他仪器均为实验室常用。

17.1.2实验动物：来源于上海斯莱克实验动物有限公司的昆明小鼠/雄性(体重20g左右)和雄性Wistar大鼠(体重180g左右)。

17.1.3实验方法

17.1.3.1 APSeM对热板致小鼠痛阈值的影响

将雌性昆明小鼠放置在55℃的智能热板仪内，参考5s<正常痛域值<30s，记录正常痛阈值的小鼠放入热板仪至出现舔后足的时间(s)，30只/3组，即APSeM(生理盐水配)、NSe(生理盐水配)、生理盐水对照组。按0.2mL/10g灌胃，3次/天，连续6天，于末次给药后半个小时后测痛阈值。

16.1.3.2 APSeM对醋酸致小鼠扭体反应的影响

取小鼠30只/3组，按0.2mL/10g灌胃6天；末次给药后0.5小时，腹腔注射0.8％的醋酸0.2mL/只，小鼠出现扭体反应(腹部内凹，躯干与后肢伸张，臀部高起等行为反应)；观察并记录注射醋酸后15min内小鼠出现扭体反应的次数。

17.2实验结果

17.2.1 APSeM对热板致小鼠痛域影响

从表5可以看出，APSeM能显著提高小鼠痛阈，与对照、NSe组比较具有显著性差异(p<0.01)，提示APSeM具有功能效应，且对比的NSe未见提高痛阈值效应。

表5 APSeM漱口水对热板致小鼠痛域值的影响(n＝10)

注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01。

17.2.2 APSeM对醋酸致小鼠扭体反应的影响

从表6可以看出，APSeM能显著降低醋酸致小鼠扭体反应的次数，与空白对照和NSe组比较具有显著性差异，证实APSeM的功能效应；而NSe尚未发现相关功能。

表6 APSeM对醋酸致小鼠扭体反应的影响(n＝10)

注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01。

上述实验数据充分说明APSeM具有明显效果的镇痛作用。

实施例18 APSeM的抗炎作用评价

18.1材料与方法

18.1.1材料与试剂：将300ng/mL的本发明实施例5的APSeM和等剂量的NSe(实施例1所得)分别稀释在生理盐水中(10％)配制成实验研究用漱口水，其他同上来源动物，其他均为常用试剂和实验设备。

18.1.2方法

18.1.2.1 APSeM对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

取昆明小鼠30只/3组，即APSeM、NSe和生理盐水对照组。按30mL/kg灌胃，2次/天，连续6天；末次涂药后30min时于每只小鼠右耳廓内外两侧涂抹二甲苯0.05mL诱导致炎，左耳空白对照。涂抹30min后，经颈椎脱臼方式处死小鼠，沿小鼠耳廓基线用手术剪刀剪下左右两耳，然后用直径8mm的打孔器取下左右双耳相应部位的耳片，进行称重和记录，根据两耳片的重量差值，计算肿胀抑制百分率来评价小鼠耳廓肿胀度。耳廓肿胀度＝右耳廓重-左耳廓重，肿胀抑制百分率(％)＝[(空白对照组耳廓肿胀度-药物处理组耳廓肿胀度)/空白对照组耳廓肿胀度]×100％。

18.1.2.2 APSeM对冰醋酸诱导小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响

取雄性小鼠30只/3组，30mL/kg灌胃，2次/天，连续6天；末次给药后30min，分别给小鼠按10mL/kg尾静脉注射伊文思蓝(0.5％)，并立即按10mL/kg腹腔注射醋酸(0.6％)；注射完30min后，小鼠经颈椎脱臼处死，接着用6mL生理盐水对腹腔进行冲洗，收集冲洗液，3000rpm进行10min离心，轻取上清液于590nm处测得吸光度(A)。结合腹腔液中伊文思蓝的含量，来判断漱口水对小鼠腹腔毛细血管通透性。

18.1.2.3 APSeM对鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的影响

取雄性大鼠30只/3组，5mL/kg灌胃，2次/天，连续6天；末次给药后30min，再分别给大鼠灌水5mL/只，并在右踝关节处用Mark笔划圈标记，方便测定大鼠右足跖容积；同时，将10％新鲜鸡蛋清0.1mL/只在大鼠足跖中部皮下注射诱导致炎，制备足跖肿胀炎症模型。

18.1.2.3.1足跖肿胀度评价：致炎后0.5，1，2，4，6小时，测定大鼠的足跖容积，按足跖肿胀度＝(致炎后-致炎前)足跖容积差值计算足跖肿胀度。

18.1.2.3.2大鼠血清IL-1β浓度测定：在末次测定足跖肿胀度后，麻醉大鼠，眼眶采抗凝血，3000rpm离心得血清，ELISA法测定血清中IL-1β的含量。

18.1.2.4.3足跖组织PGE2浓度测定：在末次测定足跖肿胀度后，麻醉处死大鼠，在其踝关节上0.5cm处剪下肿胀足跖；进行称重并剪碎，用5mL的预冷生理盐水浸泡1h，充分涡旋混后，3000rpm，15min；取上清液0.5mL，再加入0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液2mL，50℃恒温放置20min；用分析纯甲醇定容至5mL，紫外可见分光光度计于278nm处测定吸光度(A)，然后按每克组织的吸光度值表示PGE2浓度，即按PGE2(μg/g)＝(E278×13.13×Vt×D)/W。其中E278：278nm吸光值；Vt：浸泡液的总体积；D：稀释倍数；W：右下肢的重量)。

18.2实验结果

18.2.1 APSeM对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的作用

由表7可知，APSeM能显著抑制由二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，抑制百分率达到63％，而NSe组有效性仅有14.51，两者具有显著性差异。

表7 APSeM对小鼠耳廓肿胀的影响(n＝10)

注：与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与NSe比较，

18.2.2 APSeM对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的作用

由表8可知，与对照组比较，APSeM比NSe组更具有显著性作用。

表8 APSeM对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响(n＝15)

注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；与NSe比较，

18.2.3 APSeM对鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的影响

由表9可知，与对照组比较，APSeM组大鼠足跖肿胀度显著降低，NSe作用很微弱。

表9 APSeM对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响(n＝10)

注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；与NSe比较，

18.2.4 APSeM对蛋清致足跖肿胀大鼠血清IL-β和炎性组织PGE2浓度的影响

由表10可知，APSeM和NSe组大鼠血清IL-1β和PGE2的浓度显著降低，其中APSeM比NSe的效果更好，且两者显著差异。

表10 APSeM对蛋清致足跖肿胀大鼠血清IL-β和炎性组织PGE2的影响(n＝10)

注：与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；与NSe比较：

实施例19 APSeM对大鼠肝脏止血实验评价

取雌/雄性各半大鼠(200g左右体重)20只/2组，胶原蛋白海绵组(参照)和APSeM冻干明胶组(在胶原蛋白海绵表面加入10％重量/体积比的200ng/mL的本发明实施例5制备的APSeM溶液，冷冻干燥制得)；经1％戊巴比妥腹腔注射麻醉(40mg/kg)后，解剖开腹，暴露肝脏，用组织钳将左叶中间位置切取一块(5x3x2mm)，造成敞开型伤口，自由出血5s，将两组止血膜敷上，10g砝码按压20s，拿走观察30s，记录止血时间；称重对手术中使用的无菌纱布吸收用药后所流出血液，计算手术中的出血量和止血时间，具体如表7所示。手术后2周，分别将其中5只大鼠进行解剖考察创面的血肿、腹腔粘连等情况。2周后，创面止血部位组织未见坏死、水肿、炎症细胞浸润等组织学病变，也未见组织毒性改变。这些结果提示白蛋白纳米硒具有显著的止血功能。

表11 APSeM对大鼠肝脏止血使用的影响(n＝10)

注：与胶原蛋白组比较：**p<0.01。

实施例20 APSeM对糖尿病大鼠创面修复评价

参照文献方法制造糖尿病大鼠创面模型，即为取雌/雄性各半大鼠(200g左右体重)30只/3组，65mg/kg尾静脉注射STZ，然后于5，10，15天从眼眶取血测定血糖，以大于16.7mmol/L为造模成功；麻醉大鼠，脱毛，从背部剪下2x1cm的皮肤，为糖尿病创面模型；分别给予生理盐水、透明质酸凝胶、本发明实施例5制备的APSeM凝胶(将10％的300ng/mLAPSeM体积比掺入透明质酸中制备)，按2天/次涂抹，连续给药2周14天；然后，通过免疫组织化学和拍照计算创面愈合率(将愈合好的创面和原始创面的百分比计算)进行综合评价，如表12所示，结果提示APSeM具有促进创面愈合的优秀功能。

表12 APSeM对大鼠创面修复的影响(n＝10)

注：与对照组比较：**p<0.01。

实施例21 APSeM对放射性大鼠皮损的修复评价：

取6周龄的雄性SD大鼠(230g左右)，每组8只，本戊巴比妥麻醉后，经过瓦里安23EX直线加速器产生的6MEV电子线照射皮肤(4cmx5cm)，非Mark笔圈部位用铅衣遮盖，给予放疗剂量总计50Gy；在实验组的圈定皮肤位置用棉签涂抹本发明实施例5制备的APSeM(200ng/mL)/2天，3次/周，连续6周，拍照收集皮损恢复情况。实验结果发现APSeM组6只大鼠的皮损全部愈合(100％)，且皮肤红润，与其他非辐射皮肤接近，且毛囊正常生长；而对照组的仅1只大鼠的皮损基本康复伴有红色斑块炎症点(12.5％)，其他7只大鼠皮损康复面积均低于60％；提示APSeM具有非常优秀的抗放射皮肤损伤效应。

实施例22 APSeM对放射性小鼠血液系统的逆转评价：

取在SPF环境中适应一周的昆明雄性小鼠(20g左右)，每组10只，用医用电子直线加速器(瑞典医科达)X射线辐射5.0Gy；辐射距离50cm；对照组为单纯未进行辐射的正常健康小鼠；模型组为辐射后给生理盐水，采用本发明实施例5制备的APSeM按50～200μg/kg体重给药，2天/次，连续5周；摘小鼠眼球收集血液进行抗凝全血液进行系统分析，结果如表13所示。实验结果表明，APSeM干预具有非常显著地改善X射线辐射造血系统损伤的功能。

表13 APSeM对X射线辐射小鼠的造血系统影响(n＝6，平均值±SD)

Δ，与对照组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；ΔΔ，与对照组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异；*，与模型组比较，p＜0.05，具有显著统计学意义；**，与模型组比较，p＜0.01，具有非常显著性差异。

实施例23 APSeM鼠肠炎的修复作用小对放射性：

按每组10只小鼠，采用6MV X射线单次15.0Gy剂量辐射小鼠腹部，其他部位用铅板防护；Mark标记3.0x5.0cm照射面积，照射高度100cm；以小鼠出现稀便、黏液血便为造模成功。正常组小鼠不做任何处理，造模小鼠随机分组(生理盐水、NSe(200μg/kg)、采用本发明实施例5制备的APSeM(200μg/kg)予第7天开始灌胃，每天一次，连续1周；记录小鼠生存情况，然后予末次给药12小时后处死小鼠，收集血清进行炎症因子和过氧化物酶(MPO)测定，取出回盲部以上肠段约5cm液氮保存做组织评分和炎症因子(炎症正相关因子IL-6)和血二胺氧化酶(DAO)表达水平分析。从组织学评分表14～16和图14可得出，APSeM比NSe具有更好的抗放射肠炎修复活性，两者具有显著性差异；具体与减少炎症因子IL-2，IL-6，TNF-α，过氧化物酶MPO和血二胺氧化酶DAO的表达水平密切相关。

表14 APSeM对放射肠炎小鼠肠道组织学评分统计

注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01；与NSe比较：

表15 APSeM对肠道组织IL-6相关基因mRNA的改变

注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01；与NSe比较：

表16 APSeM对肠道组织血二胺氧化酶(DAO)含量改变

注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01；与NSe比较：

实施例24 APSeM作用治疗肠炎的急性小鼠诱导DSS对：

将6～8周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠用注入3％质量分数DSS的饮用水诱导急性肠炎模型至模型组全部死亡，大概1周时间。因本实验为治疗实验，我们在7天诱导死亡肠炎模型基础上，为减少死亡率，控制诱导4天，每组5只；然后进行生理盐水、NSe(200μg/kg)和采用本发明实施例5制备的APSeM(200μg/kg)进行治疗，观察死亡率和体重改变情况。统计结果如图15和16所示，提示APSeM可以对DSS模型小鼠的生存率和小鼠体重进行恢复，证明APSeM对DSS诱导小鼠急性肠炎具有确定的治疗功能，而NSe组则没有相关治疗作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。