多肽及其用途

技术领域

本发明涉及药物研发领域，具体涉及多肽的医药用途。

背景技术

创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder,PTSD)是指个体经历、目睹或遭遇到一个或多个涉及自身或他人的实际死亡，或受到死亡的威胁，或严重的受伤，或躯体完整性受到威胁后，所导致的个体延迟出现和持续存在的精神障碍。研究表明，PTSD由创伤时对压力的失败反应所促发，所以其会带来一系列的改变，包括激素、神经化学和大脑结构缺陷。有假说认为，创伤时皮质醇失调可能会在外周和中枢神经系统延迟去甲肾上腺素对突触的作用，影响了事件的记忆巩固。相反，肾上腺素能激活有助于皮质醇低水平下的学习。此外，PTSD的理化失调影响5-羟色胺能和多巴胺能机制。

为了提供更为丰富、更佳的治疗策略并更好地阐明发病机制，仍存在着探索与发现PTSD的发病机制和治疗靶点的强烈需求。

发明内容

为达到上述目的，发明人进行了研究，发现多巴胺(Dopamine,DA)受体中的D2受体与5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受体中的5-HT2CR存在二聚体的作用，进一步结果表明该二聚体能够作为PTSD治疗的靶点，从而完成了本发明。

具体而言，DA受体是通过其相应的膜受体发挥作用的一种位于生物体内的受体。DA受体可分为五种：D1、D2、D3、D4和D5。D2受体(D2R)在脑内表达广泛。

5-HT受体是一群于中枢神经系统中央处和末梢神经系统周边出现的G蛋白偶联受体及配体门控离子通道。5HT受体可分为七个亚科5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT5、5-HT6和5-HT7。5-HT2受体又有A、B、C三种亚型，即，5-HT2A、5-HT2B和5-HT2C三种受体蛋白。其中，5-HT2CR在整个大脑中广泛表达，包括边缘-中边缘皮质和纹状体区域，如VTA、NAc、PFC、杏仁核、海马、背侧纹状体，主要是突触前定位。

在认识到存在D2R和5-HT2CR二聚体的基础上，发明人进一步研究发现D2R例如可通过其K226-L240区域(下文称为KL肽，序列如SEQ ID NO:1所示)与5-HT2CR相互作用，随后经动物模型验证了通过KL肽干扰D2R/5-HT2CR复合物的相互作用，能够起到治疗PTSD的作用。

据此，在第一方面，本发明提供了一种多肽，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。此外，还提供了本发明的多肽在制备用于治疗和/或预防PTSD的药物中的用途。

在一些实施方式中，本发明的多肽长度可为15至30aa。例如，16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa、25aa、26aa、27aa、28aa或29aa。

在一些实施方式中，本发明的多肽可源自D2R。可通过生物信息库(如Genbank、EMI、DDBJ等)查询多肽所源自的D2R，并在此基础上确认多肽的序列。例如，在多肽源自D2R(Genbank登录号：CAB56463)的情况下，除SEQ ID NO:1所示的序列(即CAB56463中氨基酸序列的第226至240位)外，多肽还可以包括一个或更多个额外的氨基酸残基；例如，多肽的序列可以如CAB56463中的第225至240位所示，在这种情况下，其具有16个氨基酸残基。

在一些实施方式中，D2R源自灵长目动物。

在具体的实施方式中，D2R源自人。

在一些实施方式中，本发明的多肽由源自人D2R的至多30个连续氨基酸残基组成，并且含有SEQ ID NO:1所示的序列。

在示例性的实施方式中，本发明的多肽由源自人D2R的至多29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16个连续氨基酸残基组成，并且含有SEQ ID NO:1所示的序列。

在具体的实施方式中，源自人的D2R氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

如本文所使用的，术语“治疗”是指在患者中引起希望的或有益的作用，所述希望的或有益的作用可包括减少疾病一个或更多个症状的频率或严重性，或者阻抑或抑制疾病、病症或失调的进一步发展。

如本文所使用的，术语“预防”是指防止或延缓疾病的发生，或者防止其临床或亚临床症状的出现。

此外，发明人经进一步研究中发现：本发明的多肽对于抑郁症和焦虑症也有用。

据此，提供了本发明的多肽在制备用于治疗和/或预防抑郁症的药物中的用途。同时，提供了本发明的多肽在制备用于治疗和/或预防焦虑症的药物中的用途。

如本文所使用的，“抑郁症”是指以心境低落为主，与其处境不相称，可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，甚至发生木僵。

如本文所使用的，“焦虑症”是指一种以焦虑情绪为主的神经症。

本发明的多肽通过病理中一种的新的机制(破坏D2R/5-HT2CR复合物)起到抗PTSD的作用，具有较好的临床开发价值。此外，本发明的多肽亦可实现抗抑郁、抗焦虑的作用。

值得说明的是，如下文中实施例4和5，及图6、10和11中所证实的，本发明的多肽破坏D2R/5-HT2CR复合物的相互作用，但对DA或5-HT的表达并没有显著影响。换句话说，本发明的多肽通过特异性破坏D2R/5-HT2CR复合物的相互作用起作用。

在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明的多肽。

在一个替代性的实施方式中，本发明的核酸分子是本发明的多肽编码序列的反向互补序列。

在示例性的实施方式中，本发明的核酸分子如SEQ ID NO:4所示。

此外，还提供了本发明的核酸分子在制备用于治疗和/或预防PTSD、抑郁症和/或焦虑症的药物中的用途。

本发明的核酸分子可用于生产本发明的多肽，根据所采用的表达系统，本领域技术人员能够适当地对核酸分子的序列进行调整(如基于所选择表达系统的密码子偏好性)。

在第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本发明的核酸分子。此外，还提供了本发明的表达载体在制备用于治疗和/或预防PTSD、抑郁症和/或焦虑症的药物中的用途。

可以利用多种已知方法将本发明的核酸分子插入到表达载体中。例如，可将核酸分子插入适当的限制性内切核酸酶位点。用于克隆、分离、扩增及纯化的标准技术，及操作中涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶学反应以及各种分离技术，属于本领域技术人员已知并常用的技术。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或表达载体。此外，还提供了本发明的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防PTSD、抑郁症和/或焦虑症的药物中的用途。

可以使用多种表达系统，如原核表达系统和真核表达系统中的表达载体和宿主细胞来生产本发明的多肽。接下来以哺乳动物表达系统为例进行说明，宿主细胞可包括猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系以及能够表达相容性载体的其它细胞系，如C127、3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列。源自例如SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非转录性遗传元件。可以通过本领域技术人员熟悉的多种方法，包括但不限于例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔，将表达载体引入宿主细胞中。

在第五方面，本发明提供了一种复合体，其包括本发明的多肽及连接于其上的用于通透血脑屏障的(转运)载体。本发明的复合体旨在使本发明多肽更适合于递送至人体或动物体，以治疗和/或预防PTSD、抑郁症和/或焦虑症。

在示例性的实施方式中，用于通透血脑屏障的载体可以是：HIV-1Tat蛋白、胰岛素、阳离子化白蛋白、抗大鼠转铁蛋白受体的单抗(OX26)、人胰岛素受体鼠源性单抗(HIRMAb)、Penetratin、Tat蛋白的转导结构域、Pep-1肽、S4

本发明的多肽可通过适当的连接技术与用于通透血脑屏障的载体连接。示例性的连接技术可以是亲和素-生物素技术、基于聚乙二醇(PEG)的空间臂技术、融合蛋白技术等。例如，在使用HIV-1Tat蛋白的转导结构域作为通透血脑屏障的载体的情况下，可以通过融合蛋白技术，直接将本发明的多肽与Tat蛋白的转导结构域相连。

在一些实施方式中，使用融合蛋白技术的情况下，也可以使用连接子(Linker)将本发明的多肽与用于通透血脑屏障的载体相连。示例性的连接子可以是带有甘氨酸的柔性连接子，如G、GSG、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG、GGGGSGGG、GGGGS和SGG等。

附图说明

图1示出了对小鼠的海马组织进行免疫共沉淀的免疫印迹结果；

图2示出了SPS小鼠模型进行的免疫共沉淀的免疫印迹结果；

图3示出了实施例3中所涉及的片段在D2R上的位置；

图4示出了使用实施例3中的片段对小鼠海马组织进行GST pulldown分析的免疫印迹结果；

图5示出了实施例4的实验设计流程图；

图6示出了对经多肽处理的293T细胞进行免疫共沉淀的免疫印迹结果；

图7示出了对经对多肽处理的SPS小鼠海马组织进行免疫共沉淀的免疫印迹结果(左)；多肽处理对SPS小鼠的静止水平的影响(右)；

图8示出了多肽对SPS小鼠海马中皮质酮水平的影响；

图9示出了多肽对SPS小鼠海马和皮质中皮质醇水平的影响；

图10示出了多肽对SPS小鼠海马和皮质中DA水平的影响；

图11示出了多肽对SPS小鼠海马和皮质中5-HT水平的影响；

图12示出了实施例6中，对经多肽处理的CRS小鼠进行OFT、TST、FST和SPT分析的结果；其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图13示出了实施例7中，对经多肽处理的CRS小鼠进行OFT分析的结果，其中，*P<0.05，**P<0.01；

图14示出了实施例7中，对经多肽处理的CRS小鼠进行EPM分析的结果，其中，**P<0.01。

具体实施方式

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产产商的，为可以通过商购获得的常规产品。

Balb/c小鼠购自中国广东省医学实验动物中心，雄性，12-14周龄，其饲养在18-22℃下，12小时光照/12小时黑暗。在整个过程中可以自由获得饮食和自来水。

成年C57BL/6J小鼠(雄性，12-14周)饲养在18-22℃下，12小时光照/12小时黑暗。在整个过程中可以自由获得饮食和自来水。

结果以均值+s.e.m.表示。使用Graphpad Prism 8软件进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)和事后比较来评估平均值之间的潜在差异。除非另有说明，否则在整个研究过程中使用独立样本t检验比较任何给定的两组。除非另有说明，检验的显著性水平设定为P<0.05。

实施例1体内形成D2R/5-HT2CR复合物的确认

使用来自Balb/c小鼠海马组织的蛋白质样本(100-500μg的蛋白质)进行免疫共沉淀。使用抗5-HT2CR和D2R、D2R或5-HT2CR的小鼠单克隆抗体与25μl蛋白A/G+琼脂糖珠浆(SantaCruz生物技术，sc-2001)进行沉淀。

沉淀后进行免疫印迹分析：经变性(100℃，10min)的蛋白质在8％SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜，用TBST(Tris缓冲盐水，0.1％Tween 20)中的脱脂奶封闭膜；接下来用一抗4℃孵育过夜；最后采用HRP偶联的二抗处理1小时并使用ECL超级信号化学发光试剂盒(4A生物技术公司，cat：4AW011-500)检测信号，使用图像实验室软件对条带进行密度分析，结果如图1所示。

由图1可知，5-HT2CR抗体在海马组织中pulldown D2R，证实了D2R与5-HT2CR的偶联。

实施例2复合物对于PTSD的病理意义验证

为了确定这种偶联是否与PTSD有关，我们构建了单次长时间应激(Singleprolonged stress,SPS)模型：

使用雄性Balb/c小鼠建立SPS模型。改良的SPS方案用于包含一系列的应激暴露：约束应激(在具有若干通风孔的50毫升塑料管内)2小时，休息3min，被迫在透明玻璃缸中游泳12min(～24℃)，休息15min(在温暖的灯下干燥)，捕食者(大鼠)气味暴露20min，随后进行乙醚麻醉(直到小鼠完全失去意识)。之后，小鼠被转移回具有新鲜垫料的所住笼子里。对照组小鼠被分组安置，没有接受任何应激暴露。模型建立后，所有小鼠均被不受干扰地饲养一周。

使用所构建的SPS小鼠模型按照实施例1中的免疫共沉淀和免疫印迹方法，研究该模型中D2R和5-HT2CR的相互作用，结果如图2所示。

由图2可知，在SPS模型中发现D2R和5-HT2CR显著的相互作用，这证实了它们的二聚化。

实施例3复合物相互结合位点的确认

为了确认D2R/5-HT2CR复合物的相互结合位点，首先扩增D2R全长cDNA克隆(Genbank登录号：X51645)得到D2R的CT区域(D2R-CT，T428-C443)和D2R第三胞内环(IL3)区域(D2R-IL3，K211-Q373)的cDNA片段。将这些片段亚克隆到pGEX-4T-3质粒(优宝no：VT1255)的BamH1/EcoR1或BamH1/Xho1位点。适当时地合并起始蛋氨酸残基和终止密码子。对所有构建物都进行了重测序以确认适当地实现了剪接融合。使用E.coli BL21活性细胞(康体健康生命技术公司，no：KTSM104L)进行表达，并从细菌裂解液中纯化得到含有D2R的IL3区域的GST融合蛋白(GST-D2R-IL3)、含有D2R的CT区域的GST融合蛋白(GST-D2R-CT)。其中，CT区域和IL3区域的编码序列在D2R上的具体位置如图3所示。

将溶解的小鼠海马组织提取物(蛋白500μg)用1×PBS/1％Triton X-100稀释，随后与饱和仅GST蛋白或上述15μg GST融合蛋白的20μl蛋白GST树脂在4℃孵育过夜。珠子用1×PBS/1％Triton X-100洗涤1-8次。结合蛋白用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(YeSen，no：20315ES05)洗脱，用SDS-PAGE分离，用各自的抗体进行免疫印迹，结果如图4中A所示。

由图4中A可知，D2R的IL3区域可以pulldown 5-HT2CR。

接下来，为了进一步挖掘D2R与5-HT2CR之间的相互作用序列/位点，我们将该IL3区域分割为：D2R的KVC(K211-V270)区域、D2R的ES(E271-S321)区域和D2R的PQ(P322-Q373)区域，这些区域在D2R上的具体位置如图3所示。

按照本实施例中的方法，使用含有D2R的KVC区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KVC)、含有D2R的ES区域的GST融合蛋白(GST-D2R-ES)、含有D2R的PQ区域的GST融合蛋白(GST-D2R-PQ)进行pulldown分析，免疫印迹结果如图4中B所示。

由图4中B可知，D2R的KVC区域可以pulldown 5-HT2CR。

进一步地，我们将该KVC区域分割为：D2R的KT(K211-T225)区域、D2R的KL(K226-L240)区域、D2R的KV(K241-V255)区域和D2R的IV(I256-V270)区域，这些区域在D2R上的具体位置如图3所示。

按照本实施例中的方法，使用含有D2R的KT区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KT)、D2R的KL区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KL)、D2R的KV区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KV)和含有D2R的IV区域的GST融合蛋白(GST-D2R-IV)进行pulldown分析，免疫印迹结果如图4中C所示。

由图4中C可知，D2R可以通过KL多肽(K226-L240)可以从小鼠海马组织中亲和5-HT2CR，表明D2R可以通过K226-L240区域与5-HT2CR相互作用。

实施例4多肽减轻D2R/5-HT2CR二聚作用的确认

为了探索竞争肽KL多肽解偶联5HT2CR和D2R是否可以逆转它们的二聚相关效应，将D2R的KL区域(K226-L240)C端与HIV-1型Tat蛋白的转导结构域(如SEQ ID NO:5所示，下文称为TAT)的N端融合，得到可以通透血脑屏障的融合蛋白，命名为TAT-D2R-KL。

接下来，在5-HT2CR和D2R激动剂的存在下，用TAT-D2R-KL处理293T细胞，TAT处理用作对照。具体过程如图5所示，其中，人293T细胞系在高糖改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，该培养基中添加了10％的胎牛血清(FBS)。细胞维持在95％空气、5％二氧化碳气氛的37℃培养箱中。当细胞生长到70％密度时，转染使用时比例为1:1的5-HT2CR与D2R质粒(购自Addgene和Vigenebio(Cat#66411和CH805293))。

按照实施例1中的方法对处理后的细胞进行分析，结果如图6所示。可见，TAT-D2R-KL处理显著降低了5-HT2CR和D2R的相互作用。

实施例5多肽抗PTSD作用的评估

为了评价本发明多肽的抗PTSD作用，按照实施例2建立了SPS小鼠模型，

在两种情境下进行恐惧条件反射、安全学习和回忆测试(情境A中进行恐惧条件反射和安全学习；情境B中的回忆测试)。情境A和情境B中的形状和气味都是不同的。室内地板在测试前用1％的醋酸或75％的乙醇清洗。放置在实验测试室顶部的摄像机记录静止行为(freezing behavior)，在实验完成后，根据记录的视频手动计算静止水平。静止行为的标准是如果除正常呼吸外，在2秒内未检测到移动，则认为小鼠为静止。实验小鼠收到了4次CS+和CS-的刺激(30秒，60dB；CS+：50ms pips音调(3kHz)；CS-：白噪声)。在第2天进行恐惧条件反射实验，通过将CS+与US(2s足部电击，0.8mA)配对(3次CS+/US配对，试验间隔(ITI)：90s)。第3天，小鼠在情景B下进行测试，分别有5或15次CS+和CS-。安全学习(第9天)时小鼠用TAT-D2R-KL处理SPS小鼠1个半小时(腹腔内给药，3nm TAT肽，100μl/10g小鼠)，然后在情景A中以伪随机方式(ITI：90s)接受CS+和CS-，其中CS+和US配对，而CS-从未被足部电击强化。在第10天，在情景B中对多肽处理过的小鼠再次进行测试。

有趣的是，随着5-HT2CR和D2R相互作用的下降，TAT-D2R-KL处理降低了SPS小鼠的静止水平(图7)。此外，TAT-D2R-KL显著降低了SPS小鼠海马中升高的皮质酮(图8)水平。然而，TAT-D2R-KL未显著改变SPS小鼠海马和皮质中皮质醇(图9)、DA(图10)的水平，并且没有降低SPS小鼠海马中上调的5-HT(图11)。

以上结果证实了本发明的多肽通过解偶联D2R/5-HT2CR复合物实现了PTSD作用。

实施例6使用药物评价模型评估多肽的抗抑郁能力

为进一步评估多肽作为抗抑郁药物的能力，构建了CRS和CMS小鼠模型，具体构建方式如下：

CRS：

C57BL/6J小鼠每天水平固定6小时(10点到16点)在丙烯酸圆柱形平底头第一约束器(25×90mm)中，持续2周。过滤器有几个插槽，可以根据每只小鼠的大小牢固地束缚小鼠，并抑制肢体的身体运动而不会引起疼痛。在被限制后，小鼠立即被放回自己的笼子里。非约束小鼠(对照)在没有进行CRS程序时仍留在自住的笼子里，对照小鼠和CRS小鼠在CRS暴露期间都无法获得食物和水。

CMS：

C57BL/6J小鼠受到各种压力，包括：约束(4小时)、笼倾斜(45次，每次12小时)、光-暗周期逆转(一次)、闪光(12小时)和脏笼(2次，每次14小时)。该方案持续6周。对照小鼠没有受到相应压力。

使用TAT、TAT-D2R-KL处理小鼠(处理方式均为单次腹腔给药，3nmol/g)；在处理1小时后进行旷场试验(OFT)、强迫游泳试验(FST)，悬尾试验(TST)和SPT(糖水偏好实验)。

试验方法如下：

OFT(用于测试总距离)：小鼠适应实验环境1小时，并放置在45×45×30cm的腔室中。记录一段5分钟的视频，观察小鼠的运动活动。测量和分析小鼠覆盖的总距离，并以毫米表示。

FST：小鼠被放置在一个充满水(水温23±1℃)的有机玻璃圆柱体中(高度70厘米，直径30厘米)，水的高度为30厘米以上。对小鼠录像5分钟并进行分析，记录静止的时长。小鼠一动不动地漂浮在水中或使鼻子高于水面时被定义为静止；在整个圆柱体上的水平运动时被定义为游泳；而对着圆柱体壁的垂直运动时被定义为攀爬。

TST：小鼠分别以胶带悬挂在地板上方40厘米处，矩形隔间(长度55厘米×宽度20厘米×深度11.5厘米)内。记录视频共5分钟，记录静止的时长。采用EthoVisionXT软件进行记录和分析。

SPT(糖水偏好实验)：使用两瓶自由选择范式进行。小鼠用1％的蔗糖溶液习惯3天，并随机分组。为了评估它们个体的蔗糖摄入量，小鼠在3天内剥夺24小时的水和食物。第二天，每只老鼠都可以自由接触两瓶含有蔗糖和水的瓶子。2.5小时后改变水和含蔗糖瓶的位置，总试验时间为5小时。最后，记录所消耗的水和蔗糖溶液的体积，并按下式(I)计算：

由图12中分析结果可知，TAT-D2R-KL处理对小鼠总运动能力无影响，TAT-D2R-KL处理的小鼠相较于TAT处理的小鼠均显著地减少了静止时间，并且显著地增强了蔗糖偏好，呈现显著的抗抑郁作用。

实施例7使用药物评价模型评估多肽的抗焦虑能力

为了评价本发明的多肽抗焦虑样作用，采用实施例6中的方法构建CRS小鼠模型，使用TAT、TAT-D2R-KL处理小鼠(处理方式均为单次腹腔给药，3nmol/g)，在处理1小时后进行用于测试中央区停留时间的旷场试验(OFT)和高架十字迷宫试验(EPM)。试验方法如下：

OFT(用于测试中央区停留时间)：将旷底面等分成25个等面积的格子，中间9个格子区域为中央区。小鼠接受多肽处理1小时后放置于中央区记录5min，记录小鼠在中央区停留的时间。

EPM：由两个开放臂(25cm×8cm)和两个闭合臂(25cm×8cm)组成，交叉处为中央区(8cm×8cm)，离地40cm高。接受多肽处理1小时后，将小鼠面向开放臂放置于中央区，记录其自由活动5min。每只动物检测完成后，用70％酒精擦拭装置。记录小鼠在开放臂停留的时间、在闭合臂停留时间和小鼠总运动距离。

OFT结果示于图13中，TAT-D2R-KL多肽能显著增加了小鼠在中央区的停留时间。EPM结果示于图14中，TAT-D2R-KL多肽显著增加了小鼠的开放臂停留时间，表明本发明的多肽有效地降低了焦虑情绪。

序列表

<110> 深圳辰扬生物科技有限公司

<120> 多肽及其用途

<130> 2202339-I-CP-CYSW

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala His Leu Arg Ala Pro Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln

1 5 10 15

Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Asp Gly Lys Ala Asp Arg Pro

20 25 30

His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Thr Leu Leu Thr Leu Leu Ile Ala Val Ile

35 40 45

Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala

50 55 60

Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp

65 70 75 80

Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val

85 90 95

Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr

100 105 110

Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile

115 120 125

Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr

130 135 140

Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ser Ile Val Trp

145 150 155 160

Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn

165 170 175

Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr

180 185 190

Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val

195 200 205

Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn

210 215 220

Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala His Leu Arg Ala Pro Leu

225 230 235 240

Lys Gly Asn Cys Thr His Pro Glu Asp Met Lys Leu Cys Thr Val Ile

245 250 255

Met Lys Ser Asn Gly Ser Phe Pro Val Asn Arg Arg Arg Val Glu Ala

260 265 270

Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser Ser Thr Ser

275 280 285

Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His Gln

290 295 300

Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser Thr Pro Asp

305 310 315 320

Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys

325 330 335

Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg

340 345 350

Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu

355 360 365

Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile

370 375 380

Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp

385 390 395 400

Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr

405 410 415

Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu

420 425 430

Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile Leu His Cys

435 440

<210> 3

<211> 1525

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

ctggccaccc agtcggtcca ccgccctgat ggatccactg aatctgtcct ggtatgatga 60

tgatctggag aggcagaact ggagccggcc cttcaacggg tcagacggga aggcggacag 120

accccactac aactactatg ccacactgct caccctgctc atcgctgtca tcgtcttcgg 180

caacgtgctg gtgtgcatgg ctgtgtcccg cgagaaggcg ctgcagacca ccaccaacta 240

cctgatcgtc agcctcgcag tggccgacct cctcgtcgcc acactggtca tgccctgggt 300

tgtctacctg gaggtggtag gtgagtggaa attcagcagg attcactgtg acatcttcgt 360

cactctggac gtcatgatgt gcacggcgag catcctgaac ttgtgtgcca tcagcatcga 420

caggtacaca gctgtggcca tgcccatgct gtacaatacg cgctacagct ccaagcgccg 480

ggtcaccgtc atgatctcca tcgtctgggt cctgtccttc accatctcct gcccactcct 540

cttcggactc aataacgcag accagaacga gtgcatcatt gccaacccgg ccttcgtggt 600

ctactcctcc atcgtctcct tctacgtgcc cttcattgtc accctgctgg tctatatcaa 660

gatctacatt gtcctccgca gacgccgcaa gcgagtcaac accaaacgca gcagccgagc 720

tttcagggcc cacctgaggg ctccactaaa gggcaactgt actcaccccg aggacatgaa 780

actctgcacc gttatcatga agtctaatgg gagtttccca gtgaacaggc ggagagtgga 840

ggctgcccgg cgagcccagg agctggagat ggagatgctc tccagcacca gcccacccga 900

gaggacccgg tacagcccca tcccacccag ccaccaccag ctgactctcc ccgacccgtc 960

ccaccatggt ctccacagca ctcccgacag ccccgccaaa ccagagaaga atgggcatgc 1020

caaagaccac cccaagattg ccaagatctt tgagatccag accatgccca atggcaaaac 1080

ccggacctcc ctcaagacca tgagccgtag gaagctctcc cagcagaagg agaagaaagc 1140

cactcagatg ctcgccattg ttctcggcgt gttcatcatc tgctggctgc ccttcttcat 1200

cacacacatc ctgaacatac actgtgactg caacatcccg cctgtcctgt acagcgcctt 1260

cacgtggctg ggctatgtca acagcgccgt gaaccccatc atctacacca ccttcaacat 1320

tgagttccgc aaggccttcc tgaagatcct ccactgctga ctctgctgcc tgcccgcaca 1380

gcagcctgct tcccacctcc ctgcccaggc cggccagcct cacccttgcg aaccgtgagc 1440

aggaaggcct gggtggatcg gcctcctctt caccccggca ggccctgcag tgttcgcttg 1500

gctccatgct cctcactgcc cgcac 1525

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaacgcagca gccgagcttt cagggcccac ctgagggctc cacta 45

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

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