一种考拉杆菌在制备肠道修复制剂中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，更具体地，涉及一种考拉杆菌在制备肠道修复制剂中的应用。

背景技术

肠镜检查是大肠癌体检的必须项目，2017年美国MSTF新发布的结直肠癌(CRC)筛查指南：结肠镜检查和粪便免疫化学测试(FIT)是各种筛查的基石，结肠镜检查为第一选择。对于高危人群，每年体检是早期预防最有效的办法；目前肠镜检查中，使用大量的聚乙二醇(PEG2000～4000)作为泻药和润滑；PEG的大量使用，会导致肠道微生物的长期和不可逆损伤，对健康造成极大危害。

对于普通人群，肠镜处理后可能出现：持久的影响肠道菌群的组成和体内稳态，包括菌群占比发生改变，某些菌群会彻底消失必须外源补充才能恢复；肠粘膜损伤，肠镜检查属于有创的检查方法，最大的危害容易损伤肠道黏膜，检查后容易出现轻微的下腹部疼痛，腹胀，消化不良等症状，甚至引发肠道创伤性炎症。如果肠道内有炎症或者黏膜损伤，还容易导致肠粘膜出血或者穿孔，感染其他并发症。

对于有病灶患者，肠镜及手术后除上述危害外可能还有手术后肠道粘膜破坏，造成伤口，易感染；癌细胞的移位。

综上所述，肠镜检查后对人体健康存在很大的潜在危害，而促进清肠或肠镜后肠道修复对保障人体健康是十分必要的，然而现有关于促进肠镜后肠道修复的研究较少，目前尚未见相关报道。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种考拉杆菌在制备肠道修复制剂中的应用，其目的在于发现Phascolarctobacterium faecium菌株特异性促进创伤性肠道损伤的修复，尤其是肠镜后肠道的快速修复，由此解决现有肠镜后肠道恢复较慢、易引发炎症或感染的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种考拉杆菌在制备肠道修复剂中的应用，其特征在于，所述考拉杆菌为Phascolarctobacterium faecium菌株。

优选地，所述考拉杆菌在制备肠道修复剂中的应用，其应用于制备促进肠道菌群紊乱修复的益生菌修复剂、肠道创伤性损伤修复制剂、或者应用于制备预防肠道炎症的药物。

优选地，所述考拉杆菌在制备肠道修复剂中的应用，其应用于制备促进肠镜后肠道修复的益生菌修复剂。

优选地，所述考拉杆菌在制备肠道修复剂中的应用，其应用于制备调节肠镜后肠道菌群失衡的益生菌剂和/或制备增强肠道炎症抵抗能力或缓解肠道相关症状的益生菌剂；所述肠道相关症状，包括轻微的下腹部疼痛，腹胀，或消化不良导致的体重下降。

优选地，所述考拉杆菌在制备肠道修复剂中的应用，其所述益生菌剂，Phascolarctobacterium faecium菌株有效活菌数为5×10

按照本发明的另一个方面，提供了一种肠道修复制剂，其活性成分包括考拉杆菌Phascolarctobacterium faecium菌株；所述Phascolarctobacterium faecium菌株的有效活菌数为5×10

优选地，所述肠道修复制剂，其活性成分还包括产琥珀酸的益生菌、可食用的产琥珀酸的益生元和/或琥珀酸及其盐的化合物中一种或多种组合。

优选地，所述肠道修复制剂，其活性成分还包括产琥珀酸的益生菌或琥珀酸中一种或多种组合。

优选地，所述肠道修复制剂，其活性成分还包括Bacteroides thetaiotaomicron菌，有效活菌数为5×10

优选地，所述肠道修复制剂，其为肠溶剂。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于发现Phascolarctobacterium faecium菌株能够特异性快速修复肠镜后肠道的修复，能够取得下列有益效果：

本发明发现Phascolarctobacterium faecium菌株对肠道创伤性损伤或者菌群紊乱的肠道有显著促进修复的作用，如显著地促进肠镜后肠道的修复，可以应用于制备肠道的修复剂，尤其是应用于制备肠镜后肠道的益生菌修复剂，实验结果表明，相比对照组，Phascolarctobacterium faecium菌对肠镜后肠道修复的促进作用明显，尤其是有效活菌数为5×10

另外，本发明还发现该菌株能够增强肠道对炎症的抵抗能力，可以应用于制备预防肠道相关炎症的药物，尤其是制备预防肠镜后肠道炎症的药物。

附图说明

图1是恢复慢组(左)与恢复快组(右)富集菌群差异比较

图2是对照组和Pf菌株组小鼠经肠镜清肠处理(PEG)及DSS炎症诱导后体重比变化；

图3是灌胃Pf菌株对人源化小鼠肠镜清肠处理(PEG)及DSS炎症诱导后体重比的影响

图4是对照组小鼠(灌胃PBS)DSS前(左)及DSS后(右)结肠HE染色图；

图5是经人源化的小鼠DSS(左)前及DSS后(右)结肠HE染色图；

图6是经人源化的小鼠灌胃Pf菌株后DSS前(左)及DSS后(右)结肠HE染色图；

图7是人源化小鼠实验中不同处理组小鼠结肠炎评分；

图8是Pf菌株在不同培养基培养条件下吸光度值对比；其中“-琥珀酸钠”表示培养基中无琥珀酸钠；“+琥珀酸钠”表示培养基中含有琥珀酸钠。

图9是不同菌株处理小鼠体重比变化。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

肠道创伤性损伤，容易导致肠道局部炎症，甚至引起肠道及全身问题。创伤性损伤包括钝器挤压、摩擦划伤，或者锐器创口导致的肠粘膜机械损伤，例如误食异物导致的肠道划伤、肠道相关手术的刀口等等，尤其常见的是肠镜检查。

肠镜检查是大肠癌筛查的金标准，进行肠镜检查必须进行清肠处理，而此处理造成的最明显的改变即是清除了肠道的微生物，破坏了肠道微生态平衡并会由此引发一系列肠道问题(如肠道微生物长期或不可逆损伤，免疫力降低等)，这种破坏短期内无法完全恢复，同时不同人群的恢复能力有显著差异，破坏后的肠道环境容易遭受炎症等情况的侵袭，所以促进肠镜后肠道屏障的快速恢复，有利于肠道的健康及对炎症的抵御。

肠道创伤性损伤，由于肠粘膜遭到破坏，肠道原本的微生态被打破，尤其是肠道内化学环境复杂，微生态难以在创面定植；甚至由于创面的特殊环境，有害菌定植后导致更为严重的炎症或者其他不良反应。

尤其是在肠镜后肠道微生物菌群重塑过程，如何快速恢复并且朝有利方向恢复是其中的关键环节，肠道微生态的快速恢复通过补充肠道微生物是最快捷的途径，而其中某些关键菌在肠道重塑中则起着至关重要的作用。

虽肠道菌群对肠道健康有着重要影响，但肠道内的微生菌群数量庞大，菌群极其复杂，其中至少存在着1000～1150种细菌，而且肠道内环境极其复杂，外源菌种在肠道内的定植效果是难以确定的，且其对肠镜后肠道的修复作用也是难以保证的。

经过大量实验，我们发现一种考拉杆菌：Phascolarctobacterium faecium菌株，简称Pf菌，能够显著促进肠镜后肠道的修复，可以应用于制备肠道修复剂，尤其是制备促进肠镜后肠道修复的益生菌剂。进一步地，我们还发现该菌株能够显著增强肠道对外界炎症压力的抵抗能力，可以应用于制备肠道抗炎产品，尤其是应用于制备预防肠道炎症的药物，特别是预防肠镜后引发的肠道相关炎症的药物。

本发明提供了一种考拉杆菌在制备肠道修复剂中的应用。

所述应用，应用于制备促进肠道机械性操作造成的肠道菌群紊乱修复的益生菌修复剂或者应用于制备预防肠道炎症的药物，尤其是应用于制备促进肠镜后肠道修复的益生菌修复剂，特别是制备调节肠镜后肠道菌群失衡的益生菌剂和/或制备缓解肠道粘膜损伤或肠道相关症状的益生菌剂；所述肠道相关症状，包括轻微的下腹部疼痛，腹胀，或消化不良导致的体重下降。

所述益生菌修复剂，Phascolarctobacterium faecium菌株有效活菌数，优选5×10

所述益生菌修复剂，优选还包括产琥珀酸的益生菌、可食用的产琥珀酸的益生元和/或琥珀酸及其盐的化合物中一种或多种组合；更优选，包括产琥珀酸的益生菌或琥珀酸中一种或多种组合，采用产琥珀酸的益生菌或琥珀酸可以促进该菌株的增殖，更加利于肠道的修复，另外，添加产琥珀酸的菌株与该菌株联合使用具有协同作用，肠道修复效果更佳，例如Bacteroides thetaiotaomicron，简称Bt菌株。

另一方面，本发明还提供了一种肠道修复制剂，所述肠道修复制剂，其活性成分包括考拉杆菌Phascolarctobacterium faecium菌株；所述Phascolarctobacterium faecium菌株的有效活菌数为5×10

所述肠道修复制剂，优选药学上可接受的肠溶剂。

以下为实施例：

实施例1临床样本长达菌群大数据分析

通过采集临床肠镜人群不同时期粪便及血液样本，进行宏基因组测序、检测血清免疫学指标，通过生物信息学分析，发现肠镜后人群的肠道菌群存在恢复趋势不一致的现象；通过beta多样性分析对恢复快慢不同人群的肠道菌群进行分析对比，找到恢复快慢不同人群肠道中存在的差异菌株。

结果如图1，显示恢复较快的人群的考拉杆菌pf菌株丰度明显高于回复较慢的人群。

实施例2PEG处理及炎症诱导小鼠模型中Pf菌株的肠道修复效果

以下实施例中Pf菌为Phascolarctobacterium faeciumJCM 30894菌株；DSS为葡聚糖硫酸钠；人源化小鼠为灌胃肠道修复慢粪便样本的小鼠；Bt菌为Bacteroidesthetaiotaomicron；HFD为高脂饮食。以上菌株购于河南省工业微生物菌种工程技术研究中心，河南省北纳生物检验检测有限公司。

PEG处理：每次灌胃200ul，聚乙二醇溶液含有稀释在无菌自来水中的聚乙二醇3350(77.5克/升)、氯化钠(1.9克/升)、硫酸钠(7.4克/升)、氯化钾(0.98克/升)和碳酸氢钠(2.2克/升)，分成五等份，禁食2小时后，每隔30分钟口服一次。最后一次聚乙二醇给药后6小时进行粪便微生物群转移。

DSS处理：2％DSS配制添加进小鼠饮用水中。

Pf菌株菌悬液制备：将传代两次的新鲜菌液以2％(v/v)的接种量接入液体培养基，并在37℃的厌氧恒温培养箱中培养24hr左右。6000rpm离心10min，无菌生理盐水洗涤一次，随后使用无菌生理盐水重悬震荡混匀，调整菌悬液浓度至1×10

6周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPf级)40只，每笼5只，小鼠被安置在恒温25±2℃，相对湿度为50±5％，昼夜循环12/12h。正常饮食(ND)适应一周后，实验小鼠正常饮食，期间每周记录进食量，并称量体重，随机分组。将小鼠分为两组，每组10只，进行PEG处理后灌胃益生菌悬液200ul，隔天灌胃一次，共灌胃一周，两周后每组5只进行DSS处理，监测小鼠体重变化及其他炎症指标，体重比变化结果见图2。其中，对照组(PBS)为正常饮食(ND)小鼠，Pf菌株组为PEG处理后灌胃Pf益生菌悬液。

由图2可知，前期对照组和Pf菌株组体重比变化平稳，维持在1左右，且两组无明显差异；DSS处理后，对照组和灌胃Pf菌株组，小鼠体重比值均下降，但对照组显著下降，对照组与Pf菌株组两组的体重比值呈现极显著差异，Pf菌株组小鼠体重比值显著比对照组大，说明，DSS处理后灌胃Pf菌株，小鼠体重下降程度比对照组明显小得多，可见，灌胃Pf菌株有利于促进小鼠体重恢复，这可能是因为灌胃Pf菌株改善了小鼠食欲，当然我们从体重方面数据也更加直观的看到Pf菌株对肠镜清肠后肠道修复的促进作用。

实施例3PEG处理及炎症诱导的人源化小鼠模型中Pf菌株的肠道修复效果

为了更真实的模拟人类肠道状况，在实施例1的基础上，对小鼠进行了人源化处理，即小鼠移植了恢复慢组人群的粪便，在此基础上进行了临床肠镜中的清肠处理(PEG处理)，同时通过DSS诱导小鼠肠炎，具体实验如下：

抗生素治疗：抗生素溶液由氨苄西林、新霉素、甲硝唑和万古霉素用无菌水稀释后配制而成。小鼠给予氨苄西林、新霉素、甲硝唑200mg/kg，万古霉素100mg/kg，每日1次。

PEG处理：每次灌胃200ul，聚乙二醇溶液含有稀释在无菌自来水中的聚乙二醇3350(77.5克/升)、氯化钠(1.9克/升)、硫酸钠(7.4克/升)、氯化钾(0.98克/升)和碳酸氢钠(2.2克/升)，分成五等份，禁食2小时后，每隔30分钟口服一次。最后一次聚乙二醇给药后6小时进行粪便微生物群转移。

DSS处理：2％DSS处理7天，每隔一天换新的DSS溶液。

Pf菌株菌悬液制备：将传代两次的新鲜菌液以2％(v/v)的接种量接入液体培养基，并在37℃的厌氧恒温培养箱中培养24hr左右。6000rpm离心10min，无菌生理盐水洗涤一次，随后使用无菌生理盐水重悬震荡混匀，调整菌悬液浓度至1×10

6周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPf级)40只，每笼5只，小鼠被安置在恒温25±2℃，相对湿度为50±5％，昼夜循环12/12h。正常饮食(ND)适应一周后，实验小鼠正常饮食，间每周记录进食量，并称量体重，随机分组。将小鼠分为两组，每组10只，进行抗生素治疗8天，PEG处理后灌胃粪便样本(恢复慢)+益生菌悬液200ul，隔天灌胃一次，共灌胃一周，两周后每组5只进行DSS处理，监测小鼠体重变化及其他炎症指标，小鼠体重比变化见图3，DSS前(左)及DSS后(右)结肠HE染色，见图4～6，小鼠结肠炎评分，见图7。其中，对照组(PBS)为正常饮食(ND)小鼠，人源化小鼠组为移植恢复慢组粪便样本的小鼠组，Pf菌株组为人源化小鼠PEG处理后灌胃Pf菌株益生菌悬液。

由图3可知，分组后进行DSS处理，对照组、人源化小鼠组和Pf菌株组，三组小鼠体重比呈现下降，且三者体重比值有着明显差异，其中Pf菌株组体重比值＞对照组＞人源化小鼠组，且DSS处理5天后Pf菌株组体重比值为0.9，可见，Pf菌株组小鼠体重下降程度极轻；而人源化小鼠组DSS处理5天后体重比为0.8，说明，Pf菌株能改善人源化小鼠肠道恢复慢的不利因素，进一步说明，Pf菌株能够显著促进肠道修复。

由图4～6可知，上述三组结肠HE染色图有着显著差异，从图4～6可以看出，经DSS处理后，三组结肠粘膜层有着不同程度的损伤及炎性细胞浸润，其中人源化小鼠组与对照组相比，其对DSS的耐受性显然要弱很多，结肠发生了严重的损害，有显著的炎症浸润；而Pf菌株组与对照组相比，人源化小鼠灌胃Pf菌株后小鼠对DSS的耐受性更强，结肠的损害减轻，且三组中pf菌株组炎性细胞浸润程度最轻，可见，灌胃Pf菌株后小鼠肠道对炎症的抵抗能力显著优于其他组，进一步说明了在人源化小鼠中，Pf菌株对肠镜清肠后的肠道修复有显著的促进作用，能明显增强肠道对炎症的抵抗能力。

由图7可知，经DSS处理后各组小鼠结肠炎评分均显著高于未经DSS处理组，说明DSS诱导炎症模型建立成功；经DSS处理后，Pf菌株组小鼠结肠炎评分＜对照组＜人源化小鼠组，其中灌胃Pf菌株组和人源化小鼠组的结肠炎评分有着显著差异，说明，灌胃Pf菌株能够显著增强肠道对炎症的抵抗能力，Pf菌株可以显著改善肠道炎症症状。

综上可知，无论从体重方面直观的看到还是从小鼠结肠的HE染色图片及结肠炎症评分均已表明，灌胃Pf菌株对肠镜清肠后肠道修复，促进作用显著，以及能够显著增强肠道对外界炎症压力的抵抗能力。

实施例4Pf菌株的体外促生长实验

培养基(-琥珀酸钠)：

胰蛋白胨5g，肉蛋白胨5g，酵母提取物10g，盐溶液40ml，刃天青(0.1％w/v)0.5ml,Na

盐溶液：CaCl

培养基(+琥珀酸钠)：

胰蛋白胨5g，肉蛋白胨5g，酵母提取物10g，盐溶液40ml，刃天青(0.1％w/v)0.5ml，Na

盐溶液：CaCl

分别在培养基(-琥珀酸钠)和培养基(+琥珀酸钠)培养Pf菌株，菌株吸光度值，结果见图8。

由图8可知，在添加琥珀酸钠的培养基中，Pf菌株可以正常生长，在缺乏琥珀酸钠的培养基中Pf菌株不能生长，说明，琥珀酸或琥珀酸钠是其生长所必需的碳源，可见，添加产琥珀酸的益生菌或可食用的产琥珀酸的益生元或者含琥珀酸及其盐的产品，利于肠道Pf菌株的生长，可间接促进肠道修复并还有可能增强肠道对炎症的抵抗能力。

由此可知，将Pf菌株和产琥珀酸的益生菌或可食用的产琥珀酸的益生元或者琥珀酸及其盐中一种或多种进行复配的益生菌剂，其对肠道修复的效果更佳。

实施例5不同菌株处理对小鼠肠道修复的影响

实验组别：HFD+PEG+PBS(对照组)，HFD+PEG+Pf，HFD+PEG+Pf+Bt

实验方法：除小鼠饮食为高脂饮食(HFD)外，其余操作同实施例2，小鼠体重比变化见图9。

由图9结果可知，三组小鼠体重变化体现出显著差异，其中小鼠体重下降程度由高到底依次为HFD+PEG+PBS、HFD+PEG+Pf、HFD+PEG+Pf+Bt，可见同时添加Pf菌和Bt菌，对小鼠体重的降低有着显著抑制作用，其抑制效果优于单独的Pf菌，说明Pf菌和Bt菌联合使用具有协同作用，相对于单独Pf菌株，其对小鼠肠道的修复效果更快更好。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。