产核苷的基因工程菌及其构建方法与应用

文献发布时间：2023-06-19 18:32:25

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种产核苷的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由D-核糖或D-Z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由D-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成，由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。D-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。

鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。

目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种产核苷的基因工程菌及其构建方法与应用。

本发明构思如下：通过修饰枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的鸟苷酸脱氢酶(由guaB基因编码)，使其活性增强，和/或弱化或失活假定蛋白YeaC(由yeaC基因编码)，使得微生物能够高效率、快速地生成鸟嘌呤核苷或次黄嘌呤核苷酸，并成功构建出能够高效生产核苷的基因工程菌。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种鸟苷酸脱氢酶突变体，所述突变体包含如下突变位点①～⑦中的至少一种：

①鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L突变为F；

②鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L突变为P；

③鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L突变为K；

④鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E突变为K；

⑤鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E突变为R；

⑥鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E突变为H；

⑦鸟苷酸脱氢酶第444位氨基酸由G突变为E；

本发明中，鸟苷酸脱氢酶来自芽孢杆菌属(Bacillus)，其在NCBI上的参考序列编号为WP_003150717.1。

第二方面，本发明提供编码所述鸟苷酸脱氢酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第三方面，本发明提供一种YeaC蛋白突变体，所述突变体包含YeaC蛋白第71位氨基酸由Q到终止子的突变。

本发明中，YeaC蛋白来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其在NCBI上的参考序列编号为WP_013351265.1。

第四方面，本发明提供编码所述鸟苷酸脱氢酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料或编码所述YeaC蛋白突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：

(1)用于核苷或与核苷相关的衍生物的发酵生产；

(2)用于提高核苷或与核苷相关的衍生物的发酵产量；

(3)用于构建产核苷或与核苷相关的衍生物的基因工程菌。

优选地，所述核苷或与核苷相关的衍生物可选自鸟苷、肌苷、腺苷、二乙酰鸟嘌呤、核黄素等。

第五方面，本发明提供产核苷或与核苷相关的衍生物的基因工程菌的构建方法，增强原始菌株中鸟苷酸脱氢酶基因，获得基因增强菌株；其中，鸟苷酸脱氢酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003150717.1。

所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强；

6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。

本发明中，所述原始菌株为具有核苷生产能力的细菌，优选芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)菌种，更优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，最优选解淀粉芽孢杆菌836。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)836可参见CN112574934A。Bacillus amyloliquefaciens 836包含guaA

优选地，所述方法包括：利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的鸟苷酸脱氢酶包含如下突变位点①～⑦中的至少一种：

①鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到F的突变；

②鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到P的突变；

③鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到K的突变；

④鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E到K的突变；

⑤鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E到R的突变；

⑥鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E到H的突变；

⑦鸟苷酸脱氢酶第444位氨基酸由G到E的突变。

第六方面，本发明提供产核苷或与核苷相关的衍生物的基因工程菌的构建方法，弱化原始菌株中编码YeaC蛋白的基因，获得基因弱化菌株；其中，YeaC蛋白在NCBI上的参考序列编号为WP_013351265.1。

所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

优选地，所述方法包括：利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的YeaC蛋白包含Q71*突变位点；其中，*为终止子。

第七方面，本发明提供产核苷或与核苷相关的衍生物的基因工程菌的构建方法，包括方案I和方案II；

方案I：

A、弱化原始菌株中编码YeaC蛋白的基因，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；以及

B、增强步骤A基因弱化菌株中的鸟苷酸脱氢酶基因，获得基因增强菌株。

方案II：

A、增强原始菌株中鸟苷酸脱氢酶基因，获得基因增强菌株；以及

B、弱化步骤A基因增强菌株中编码YeaC蛋白的基因，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

所述弱化方法包括：利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的YeaC蛋白包含Q71*突变位点；其中，*为终止子。

所述增强方法包括：利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的鸟苷酸脱氢酶包含如下突变位点①～⑦中的至少一种：

①鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到F的突变；

②鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到P的突变；

③鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到K的突变；

④鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E到K的突变；

⑤鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E到R的突变；

⑥鸟苷酸脱氢酶第481位氨基酸由E到H的突变；

⑦鸟苷酸脱氢酶第444位氨基酸由G到E的突变。

在本发明的一个具体实施方式中，所构建的产核苷的基因工程菌(菌株B.a 839)包含鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到F的突变以及第481位氨基酸由E到K的突变，与出发菌株B.a 836相比，鸟苷产量由1.1g/L提高到4.9g/L，糖(鸟)苷转化率提高4.1％。

在本发明的另一个具体实施方式中，所构建的产核苷的基因工程菌(菌株B.a8310)包含鸟苷酸脱氢酶第454位氨基酸由L到F的突变、第481位氨基酸由E到K的突变以及YeaC蛋白第71位氨基酸由Q到终止子的突变，与出发菌株B.a 836相比，鸟苷产量由1.1g/L提高到7.3g/L，糖苷转化率提高6.6％。

在本发明的又一个具体实施方式中，所构建的产核苷的基因工程菌(菌株B.a8311)包含鸟苷酸脱氢酶第444位氨基酸由G到E的突变，与出发菌株B.a 836相比，肌苷产量由0.6g/L提高到4.5g/L，糖苷转化率提高4.1％。

第八方面，本发明提供按照上述方法构建得到的产核苷或与核苷相关的衍生物的基因工程菌。

第九方面，本发明提供所述基因工程菌在核苷或与核苷相关的衍生物的发酵生产或提高核苷或与核苷相关的衍生物的发酵产量中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明以解淀粉芽孢杆菌836作为出发菌株，对其基因组进行改造，在鸟苷酸脱氢酶基因guaB中引入点突变(从而产生GuaB蛋白变体：L454F、L454P、L454K、E481K、E481R、E481H、G444E)和/或在yeaC基因(与ATP酶可能相关的基因)中引入点突变(从而产生YeaC蛋白变体：Q71*)。将含有GuaB、YeaC变体的解淀粉芽孢杆菌进行摇瓶发酵，发酵结果显示，突变菌株guaB

具体实施方式

本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，其细胞内编码鸟苷酸脱氢酶的guaB基因的第454位亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，具体为CTT突变为TTT；第481位氨基酸由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，具体为GAA突变为AAA；第444位甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)，具体为GGA突变为GAA。编码假定蛋白的yeaC基因第71位谷氨酰胺发生终止突变，具体为CAG突变为TAG。

guaB编码鸟苷酸脱氢酶，催化肌苷酸(IMP)生成黄苷酸(XMP)。本发明对鸟苷酸脱氢酶进行突变，最终提高了GMP的产量。所述微生物通过guaB基因修饰，使得所述菌株产生核苷的能力与未修饰的菌株相比增强。YeaC为假定蛋白，推测其与ATP酶相关。本发明将其71位氨基酸失活后获得的菌株较未失活菌株相比，鸟苷生产能力增强。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的引物序列如表1所示。

表1

实施例1解淀粉芽孢杆菌guaB

以菌株DSM7(参见文献Genome sequence of B.amyloliquefaciens type strainDSM7

实施例2解淀粉芽孢杆菌guaB

具体构建过程同实施例1，使用的引物为guaB-1f/2r和guaB-3f/3r，ORF区核苷酸序列见SEQ ID NO:3，氨基酸序列见SEQ ID NO:4。构建获得的质粒为pKSU-guaB

实施例3解淀粉芽孢杆菌guaB

以DSM7基因组为模板，使用的引物为guaB-1f/1r，guaB-2f/2r和guaB-3f/3r，将3个片段融合获得重组片段，质粒及菌株构建过程同实施例1，ORF区核苷酸序列见SEQ IDNO:5，氨基酸序列见SEQ ID NO:6。构建获得的质粒为pKSU-guaB

实施例4解淀粉芽孢杆菌yeaC

以DSM7基因组为模板，使用引物yeaC-1f/1r和yeaC-2f/2r扩增左右同源臂片段，获得yeaC

实施例5解淀粉芽孢杆菌guaB

以DSM7基因组为模板，使用的引物为guaB-1f/4r，guaB-4f/3r，扩增获得2个片段，再通过融合PCR获得重组片段，ORF区核苷酸序列见SEQ ID NO:9，氨基酸序列见SEQ ID NO:10。构建获得的质粒为pKSU-guaB

实施例6解淀粉芽孢杆菌guaB

参照实施例1方法，分别扩增获得guaB

实施例7突变菌株产核苷性能验证

1、将甘油中保存的菌种37℃过夜培养划出单克隆。

2、挑单菌落接种至30mL种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，玉米浆干粉5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰0.01g/L，pH7.0～7.2)中，摇床转速110rpm，37℃培养7～8h。

3、按10％v/v接种量转接至30ml发酵培养基(葡萄糖120g/L，酵母粉3.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵25g/L，硫酸锰0.01g/L，硫酸镁5g/L，谷氨酸钠10g/L，玉米浆干粉15g/L，碳酸钙25g/L，pH7.0～7.2)中，摇床转速130rpm，35℃培养70h。

4、使用液相色谱仪对发酵液中的核苷进行检测(表2)。

表2工程菌摇瓶发酵产鸟苷及肌苷评估结果(三次重复均值)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 梅花（上海）生物科技有限公司

<120> 产核苷的基因工程菌及其构建方法与应用

<130> KHP211117789.7

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgggaaa gtaaattttc aaaagaaggc ttaacgttcg atgatgtact gctcgtacca 60

gctcaatcag acgtacttcc gcgtgatgtg gatttgtctg ttgaactgac aaaaacgtta 120

aagcttaata ttcctgtcat cagtgcagga atggatacag taacagaatc agcaatggcg 180

attgcgatgg cccgacaagg cggcttgggc attattcata aaaacatgtc catcgaacag 240

caggctgaac atgttgacaa agtcaaacgt tctgaacggg gcgttattac aaatcccttc 300

tttttaacac ctgatcatca agtattcgat gcggagcatt tgatggggaa atacagaatt 360

tccggtgttc cgatcgtaga taataaagac gatcaaaagc tggtcggtat cattacaaac 420

cgcgatcttc gctttatctc tgattattca atgaaaatca gtgatgttat gacaaaagaa 480

gagctggtta cggctcctgt gggaaccaca ttagacgaag cggaaaaaat cttgcagaag 540

cataaaattg aaaaacttcc attagtggat gaccaaaaca aattaaaagg tcttatcacg 600

atcaaagata ttgaaaaggt tatcgaattc ccgaattcat ctaaagatga acacggacgc 660

ctgatcgtcg gcgctgcggt aggcgtgaca ggtgatacaa tgactcgtgt cagcaagctt 720

gttgaagcga atgtcgacgt tatcgtggtt gatacggctc acggacattc cagaggcgta 780

ctgaacacag ttgcgaaaat ccgtgagaca tatcctgaat tgaacattat cgcaggaaat 840

gttgctacgg ctgaagcgac aaaggctttg attgaagccg gagcaaacat tgtaaaagtg 900

ggaatcggac ctggatctat ctgtacgaca cgcgtcgttg caggcgtagg tgtaccgcaa 960

atcactgcga tttatgattg tgccactgaa gcgagaaaac acggcgcaac aattatcgcg 1020

gacggcggta ttaaattctc cggagatatt acgaaagcat tggcatccgg cggacatgct 1080

gtcatgcttg gaagcctgct tgccggtact tcagaaagcc cgggcgaaac tgaaatctat 1140

caaggcagaa gatttaaagt gtatcgcggt atgggttctg tcgctgccat ggaaaaaggc 1200

agtaaagacc gatatttcca agaagaaaat aagaaattcg tccctgaagg tatcgaagga 1260

cggactccgt acaaaggtcc tgtagaagaa acagtgtatc agcttgtcgg cggtcttcgt 1320

tcaggtatgg gatattgcgg ttcaaaagac ttgcgcgctt ttagagaaga agctcaattt 1380

atccgtatga caggagcagg tcttcgcgaa agccatccgc atgatgtcca aatcacgaag 1440

gaatcaccaa actacacaat ctcataa 1467

<210> 2

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val

1 5 10 15

Leu Leu Val Pro Ala Gln Ser Asp Val Leu Pro Arg Asp Val Asp Leu

20 25 30

Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser

35 40 45

Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala

50 55 60

Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln

65 70 75 80

Gln Ala Glu His Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile

85 90 95

Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu

100 105 110

His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asp Asn

115 120 125

Lys Asp Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg

130 135 140

Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu

145 150 155 160

Glu Leu Val Thr Ala Pro Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys

165 170 175

Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln

180 185 190

Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile

195 200 205

Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Glu His Gly Arg Leu Ile Val Gly

210 215 220

Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Ser Lys Leu

225 230 235 240

Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Val Asp Thr Ala His Gly His

245 250 255

Ser Arg Gly Val Leu Asn Thr Val Ala Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro

260 265 270

Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Lys

275 280 285

Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Gly Ile Gly Pro

290 295 300

Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln

305 310 315 320

Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Ala

325 330 335

Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys

340 345 350

Ala Leu Ala Ser Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala

355 360 365

Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg

370 375 380

Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly

385 390 395 400

Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu

405 410 415

Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val

420 425 430

Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser

435 440 445

Lys Asp Leu Arg Ala Phe Arg Glu Glu Ala Gln Phe Ile Arg Met Thr

450 455 460

Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Lys

465 470 475 480

Glu Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Ser

485

<210> 3

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3