一种葡萄牙棒孢酵母及其在白酒酿造中的应用

技术领域

本发明涉及白酒酿造技术领域，具体涉及一种葡萄牙棒孢酵母及其在白酒酿造中的应用。

背景技术

米香型白酒的生产方法可分为三种：固态发酵法、半固态发酵法和液态发酵法。半固态发酵法生产米香型白酒是以大米为原料，小曲作为糖化发酵剂，发酵前期酒醅为固态，主要进行糖化，有少量酒精产生；后期通过加水稀释酒醅为半固态状进行酒精发酵；最终经过蒸馏、陈酿和勾兑等工艺而制成。

白酒是由水、乙醇和其他呈香呈味的微量成分构成，其中水和乙醇占总量的98％～99％，而微量成分仅占1％～2％。白酒中微量成分的种类十分丰富，根据化学性质可以将其分成醇类、醛类、酸类、酯类、酮类、缩醛类化合物、芳香族化合物及吡嗪类等化合物。在白酒风味成分中，醇类物质是白酒醇甜的主要来源和助香剂，乙醛和乙缩醛等能够协调香气、修饰白酒风味，适量有机酸能够使白酒的香气和口感更加丰满，酯类物质是白酒香气的主体成分。

现有技术研究表明：与其他香型的白酒相比，米香型白酒的风味成分种类相对较少，其突出的主体香气成分包括乳酸乙酯、乙酸乙酯和β-苯乙醇。因此，提高米香型白酒中酯类物质含量对于提高米香型白酒的香味具有重要的意义。

本发明在前期的发明专利CN 114181845 A中公开了一种酿酒酵母及其在白酒酿造中的应用。所述的酿酒酵母协同老八尺酒曲得到的米香型白酒其乳酸乙酯和乙酸乙酯在挥发性成分中的含量分别为17.44％和5.69％。但是，该专利公开的酿酒酵母必须协同老八尺酒曲才能制备得到乳酸乙酯和乙酸乙酯含量高的米香型白酒；然而，使用该酿酒酵母采用其它酒曲搭窝制备得到的米香型白酒，其中的乳酸乙酯和乙酸乙酯含量并不高；并且老八尺酒曲为梅州市平远县老八尺酒厂生产的酒曲，其在市场上的销量有限，因此也限制了其它酒厂的规模化的生产。

综上所述，提供一种不用协同特定酒曲的产酯酵母就可以制备得到乳酸乙酯和乙酸乙酯含量高的米香型白酒具有更加广阔的应用价值。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种葡萄牙棒孢酵母。

所述的葡萄牙棒孢酵母，其保藏编号为GDMCC No：61758，命名为Clavisporalusitaniae YJ18。

该菌株于2021年6月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

本发明还提供上述葡萄牙棒孢酵母在白酒酿造中的应用。

优选地，所述的葡萄牙棒孢酵母在白酒酿造中提高白酒酯类物质含量的应用。

优选地，所述的白酒为米香型白酒。

优选地，所述的酯类物质为乳酸乙酯和乙酸乙酯。

本发明还提供了一种米香型白酒的酿造方法，该方法在米香型白酒的酿造过程中采用本发明所述的葡萄牙棒孢酵母。

优选地，在发酵中采用本发明所述的葡萄牙棒孢酵母。

有益效果：本发明提供了一种全新的葡萄牙棒孢酵母，该葡萄牙棒孢酵母具有非常优异的产乳酸乙酯和乙酸乙酯能力且其产乳酸乙酯和乙酸乙酯的能力要显著高于专利CN 114181845 A公开的酿酒酵母。

尤其在具体的米香型白酒的酿造过程中，该葡萄牙棒孢酵母不用协同特定的酒曲就可以制备得到乳酸乙酯和乙酸乙酯含量高的米香型白酒；并且采用该葡萄牙棒孢酵母制备得到的米香型白酒，比采用专利CN 114181845 A中公开的酿酒酵母制备得到的米香型白酒具有更高的乳酸乙酯和乙酸乙酯含量。

附图说明

图1为分离得到的8株不同菌落形态的酵母菌其扩增产物电泳图。

图2为分离得到的8株不同菌落形态的酵母菌的系统发育树。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1葡萄牙棒孢酵母的分离与鉴定

(1)样品处理

分别称取鹰金钱酒曲以及烧麸曲样品5.00g，加入装有45mL无菌生理盐水的三角瓶中，200r/min振荡30min，充分混匀。取1mL样液，加入含9mL麦氏培养基的试管中，28℃、120r/min振荡培养24h。

(2)酵母菌的分离纯化

吸取稀释倍数为10

(3)酵母菌的鉴定

3.1形态学鉴定：用美蓝染液对酵母进行染色、镜检。

3.2分子生物学鉴定：

鉴定方法：采用酵母基因组DNA提取试剂盒分别提取8株不同菌落形态的酵母菌DNA，接着采用通用引物扩增出26S rDNA序列并进行纯化及测序；然后在数据库中比对26SrDNA序列，对筛选菌株进行分子学鉴定。通用引物序列参照文献“彭俊,杨团元,刘蒲临,等.白酒酿造酒醅与周边土壤中酵母菌多样性及东方伊萨酵母发酵特性比较[J].中国酿造,2019,38(08):77-84)”，并由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成，使用浓度20μmol/L，-20℃保存。PCR扩增反应体系见表1，PCR扩增程序条件见表2。采用DNA产物纯化试剂盒纯化所得PCR产物，并送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将测序结果与NationalCenter for Biotechnology Information数据库进行BLAST比对分析，采用MEGA X软件，构建系统发育树。

表1.PCR扩增反应体系

表2.PCR扩增程序条件

鉴定结果：8株不同菌落形态的酵母菌，其PCR扩增产物电泳图如1所示。由图1可看出，所有菌株PCR扩增的条带较清晰，无拖尾现象，可用于测序。与Marker对比，PCR扩增所得DNA分子大小在500～750bp间。

将PCR产物进行测序，结果与National Center for Biotechnology Information数据库进行BLAST比对，得出菌株鉴定结果见表3。采用MEGAX软件，根据BLAST比对结果选取同源性最高的相关菌株26S rDNA区域序列作为参比对象，构建8株菌株的系统发育树，见图2。

表3、图1和图2标记的菌株YJ18即本发明所述的命名为Clavispora lusitaniaeYJ18的葡萄牙棒孢酵母。

表3.菌株26S rDNA序列同源性分析结果

由表3和图2中同源性分析结果可以看出，本发明所述保藏编号为GDMCC No：61758的菌株其与Clavispora lusitaniae YM26322的同源性为100％；因此将其命名为Clavispora lusitaniae YJ18。

本发明所述保藏编号为GDMCC No：61758的菌株命名为Clavispora lusitaniaeYJ18葡萄牙棒孢酵母，其主要形态特征如下：细胞形态特征为椭圆形，单端出芽明显，进行无性繁殖；菌落特征为在固体培养基中菌落乳白色，粘稠，边缘平滑整齐，表面平坦，光照下反光。

实验例1葡萄糖基质环境对Clavispora lusitaniae YJ18的影响

在250mL锥形瓶中加入100mL的葡萄糖发酵培养基(葡萄糖质量分数为12％)分别接种酵母菌种子液(酵母菌种子液加入量为葡萄糖发酵培养基体积的10％；酵母菌种子液中酵母菌的浓度为1×10

所测试的酵母菌种子液为含有Clavispora lusitaniae YJ18的酵母菌种子液。

顶空固相微萃取-气质联用技术分析发酵液中酯类物质的具体方法为：将萃取针(50/30μm DVB/CAR/PDMS)于250℃条件下活化10min，备用。吸取7mL发酵液于25mL样品瓶中，加入NaCl 1.4g和磁力转子，盖上铝盖；然后将样品置于磁力搅拌加热器上，45℃预热5min；插入已活化的萃取针，吸附萃取50min；随即将萃取针插入GC-MS仪器进样口中，250℃解析5min。GC条件：采用DB-WAX UI色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，美国Agilent公司。进样口温度250℃，不分流，氦气作为载气。升温程序：起始温度40℃，保持2min，以5℃/min升温到100℃，保持10min，以10℃/min升温到200℃，保持10min。MS条件：EI电离源；离子源温度：230℃；电子能量：70eV；采集模式：全扫描；质量扫描范围(m/z)：50～550。

实验结果表明：在葡萄糖基质环境中Clavispora lusitaniae YJ18产乳酸乙酯和乙酸乙酯的总量为14.45mg/L。显著高于CN 114181845 A中公开的酿酒酵母的11.26mg/L(见其说明书第47段记载)。由此可见，本发明提供的Clavispora lusitaniae YJ18具有优异的产乳酸乙酯和乙酸乙酯的能力，且其产乳酸乙酯和乙酸乙酯的能力要显著高于专利CN114181845 A公开的酿酒酵母。

实施例2半固态米香型白酒的酿造方法

(1)洗米：称取没有霉味的大米250g，冲洗两遍。

(2)蒸饭：用盆将洗干净的大米装好，加入190mL水，置于高压灭菌锅内，115℃蒸煮15min；蒸完的米粒应该无夹生、有弹性但不粘手，达到熟而不烂。

(3)拌曲搭窝：待米饭摊凉后，分别拌入台湾根霉悬液(台湾根霉悬液的加入重量为大米重量的1％)，充分搅拌均匀，装入2L发酵罐中，搭窝，并用纱布封口后放入生化培养箱，于34℃条件下糖化48h。

(4)发酵：糖化结束后，加入Clavispora lusitaniae YJ18菌悬液(每100g大米加入12mL Clavispora lusitaniae YJ18菌悬液，且酵母菌悬液浓度为1×10

(5)蒸馏：发酵结束后，向醪液中加入250mL水，蒸馏得到酒液；

所述的台湾根霉悬液通过如下方法制备得到：取1支30℃下培养5d的根霉斜面，将斜面上的孢子加入到10mL无菌水中，制得根霉孢子悬液。

实验例2制备得到的米香型白酒中风味物质的检测方法

(1)标准溶液配制步骤：准确吸取甲醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、正辛醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、乳酸乙酯、乙醛、乙缩醛、糠醛、苯甲醛、苯乙酮、乙酸、辛酸、葵酸、壬酸各2.0mL，置于100mL容量瓶中，用体积分数为60％的乙醇定容，混匀，得各成分的标准储备液；准确吸取各成分的标准储备液0mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL分别置于100mL样品瓶中，用60％的乙醇定容得各成分的不同浓度梯度的标准溶液；

(2)标准曲线建立步骤：准确吸取各成分的不同浓度梯度的标准溶液10.0mL，各加入0.10mL内标溶液；分别上样，用气相色谱检测各成分；以各成分与内标物浓度比为横坐标，各成分与内标物峰面积比为纵坐标，建立各成分标准曲线；

(3)米香型白酒中挥发性风味物质的含量测定步骤：准确吸取10.0mL米香型白酒，加入0.10mL内标溶液，混匀，上样，用气相色谱检测各挥发性风味物质与内标物峰面积比；将各挥发性风味物质与内标物峰面积比代入各成分标准曲线，进而得到各挥发性风味物质浓度。

步骤(2)和(3)中所述的内标溶液通过如下方法制备得到：准确吸取2.0mL乙酸正戊酯，用60％(v/v)乙醇溶液定容至100mL，混匀，配制成体积分数为2％的内标溶液。

步骤(2)标准曲线建立的气相色谱条件与步骤(3)中米香型白酒挥发性风味物质的含量测定的气相色谱条件相同。

所述的气相色谱条件为：采用DB-WAX UI色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，美国Agilent公司)；进样口温度220℃，进样量1μL，分流比100:1，流速1mL/min，FID检测器温度220℃；氢气(H

该检测方法得到的各挥发性风味物质的标准曲线以及保留时间见表4所示。采用该检测方法测试实施例2制备得到的米香型白酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯在挥发性风味物质中的含量，检测结果见表5。

表4各挥发性风味物质的标准曲线以及保留时间

表5.米香型白酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯在挥发性成分中的含量

由表5实验数据可以看出，采用本发明所述的葡萄牙棒孢酵母制备得到的米香型白酒其乳酸乙酯和乙酸乙酯在挥发性成分中的含量分别为20.58％和7.73％，显著高于采用专利CN114181845 A中公开的酿酒酵母制备得到的米香型白酒(其分别为17.44％和5.69％，具体见其说明书第76段表5记载)。

由此可见，采用本发明所述葡萄牙棒孢酵母不用协同特定的老八尺酒曲就可以制备得到乳酸乙酯和乙酸乙酯含量高的米香型白酒；并且采用该葡萄牙棒孢酵母制备得到的米香型白酒，比采用专利CN 114181845 A中公开的酿酒酵母制备得到的米香型白酒具有更高的乳酸乙酯和乙酸乙酯含量。