一种抗骨质疏松药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种抗骨质疏松药物组合物及其制备方法，以及该中药组合物在治疗骨质疏松症上的应用。

背景技术

骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种全身性骨骼疾病，其明显特征表现为骨密度降低和骨质量下降(微结构改变)，从而导致骨强度降低，使得人体的骨微结构易遭到破坏，骨骼脆性增加。骨质疏松已严重影响个体生活水平和质量。预计到2050年，我国骨质疏松性患者人数将超过599万，相应医疗支出高达1745亿元，因此，防治骨质疏松症是当下重要的健康课题。

总所周知，人骨骼长期处于一种动态平衡，这一生理过程主要包括由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收，正常生理情况下骨形成与骨吸收处于动态平衡，当破骨细胞吸收和成骨细胞的骨形成之间的精确平衡被打破，即骨吸收增加，骨形成减少，骨完整性无法得以维持，从而引发骨质疏松。因此，促成骨细胞功能和/或抑制破骨细胞功能的药物成为研究热点。

目前常用于治疗骨质疏松症的药物，主要为骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化物等西药，但传统西药的治疗方法存在一定的局限性和不良反应，包括胃肠道不良反应、损伤肾功能、静脉血栓等，造成对OP的治疗往往难以达到满意的效果。如前所述，现有治疗骨质疏松的药物主要分为3大类：①抑制破骨细胞活性的药物(即骨吸收抑制剂)，主要有：雌激素、降钙素、双膦酸盐、异丙氧黄酮、选择性雌激素受体调节剂等，②促进成骨细胞生成的药物(即骨形成促进剂)，主要有：氯化物、甲状旁腺激素、蛋白合成激素；③促进骨化的药物(即骨矿化物)，主要有钙剂和维生素D及其衍生物等。专利CN102145106A的说明书第3段也指出：目前临床上治疗骨质疏松症的手段多以化药治疗为主，但若长期给药易引起神经系统、消化系统等一系列不良反应，一定程度上还会损害肝脏等脏器，例如：雌激素替代疗法可增加乳癌的危险性，氟化物可引起骨脆性增加……等等。

中医理论强调治病求本，即从整体观上分析疾病的病因和病机，认为OP属于“骨蚀”、“骨萎”、“骨痹”等范畴，认为“肾主骨，生髓”、“肾藏精，精生髓，髓养骨”，若肾精亏虚不能生髓，髓枯则骨枯，日久发为本病。因此，“肾藏精，主骨生髓”是中医防治OP的理论基础。“肾藏精”的科学内涵主要或部分体现为MSCs及微环境的调和状态，且补肾中药能同时激活MSCs和发挥微环境调节的作用，由此提出“肾虚”即表现为“肾藏精，精生髓”的功能低下，在细胞及分子层面体现在MSCs增殖、分化等功能及其微环境稳态的变化。OP的根本病机为“肾虚”，极有可能是肾虚导致MSCs增殖能力下降及成骨异常分化，进而导致骨吸收加速，骨量减少，微观结构破坏，骨脆性升高。而补肾调髓中药之所以能有效干预PMOP，可能与通过调控内源性MSCs的增殖和成骨分化有关。

本案申请人的课题组团队，近十年内针对抗骨质疏松症的中药组合物开发，积累的科研成果具体如下：

专利号ZL201110086501.2的中国发明专利公开了一种治疗骨质疏松症的中药组合物，包括如下质量配比的组分：熟地5-8份，杜仲2-5份，附子5-8份，枸杞2-5份，肉桂3-5份，山茱萸1-3份，桃仁3-5份，红花1-3份，山药2-5份，甘草3-5份；此外，还公开了采用醇水双提法制备含有上述组分的中药颗粒剂——补肾活血方。该颗粒剂能够有效提高大鼠骨密度、骨强度，通过降低尿脱氧吡啶酚(DPD)的含量、尿脱氧吡啶酚/尿肌酐水平，以及降低整合素αvβ3在破骨细胞上的表达，来抑制骨吸收速率，进而发挥治疗骨质疏松症的药效。然而，该专利技术方案的不足之处在于：补肾活血方萃取物得率低，仅2.3％，且肉桂中其他有效成分在长时间加热过程中容易损失，影响疗效。

在ZL201110086501.2的研究基础上，课题组团队进一步优化提取工艺以改善原补肾活血方萃取物得率低(仅2.3％)的技术缺陷，于专利号为ZL201310233904.4的中国发明专利中公开了一种新的补肾活血方萃取物的制备方法：即采用超临界流体萃取技术从上述补肾活血方中抽提得到脂溶性成分。该专利的实施例1制得了两种含脂溶性成分的中药萃取物SFEⅠ(澄黄色透明油状液体，得率5.1％)、SFEⅡ(棕色浸膏状半固体，得率9.5％)，均含有不同用量的桂皮醛、亚油酸和油酸成分，相比于ZL201110086501.2而言得率更高；此外，从该专利的实施例9、10、11中可知，专利ZL201310233904.4制得的中药萃取物SFEⅠ、SFEⅡ，其促进成骨细胞活性的作用均显著强于专利ZL201110086501.2获得的中药提取物。然而，该专利技术方案的不足之处在于：鉴于补肾活血方中的药效物质基础不明确，无法准确控制提取物的质量，造成抗骨质疏松疗效不稳定，限制了其进一步的临床应用与开发。

亦因此，课题组团队考虑在前期研究的基础上，进一步探究补肾活血方中的有效组分，再开展衍生性研究筛选出适宜的药效物质组分，并籍此构思开发出一种补肾活血方的改良型药物组合物：由含反式肉桂醛等挥发性物质、含亚油酸等高级脂肪酸以及γ-谷甾醇按一定比例组合而成。

需要说明的是，课题组团队检索了涉及有效组分肉桂醛、亚油酸、谷甾醇的相关文献，发现：

虽然文献报道肉桂醛可通过提升去卵巢诱导的骨质疏松大鼠模型的骨密度和骨量起到抗骨质疏松的效果(杜秀藩,黄弘轩,熊小龙,曾维鹏,黄晖,王广积,沈宁江,林坚平.肉桂醛对去卵巢诱导的骨质疏松大鼠模型骨密度和骨量的保护作用[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(9):1217-1220.)，但也有学者在细胞学研究中发现高浓度(128mg/ml)的肉桂醛对成骨细胞可产生抑制作用(邵培.桂皮醛对成骨细胞的增殖及其碱性磷酸酶活性的影响[D].四川大学,2007.)，提示单用肉桂醛作为药物治疗骨质疏松存在局限性。

谷甾醇可通过提高SD大鼠成骨细胞OPG/ODF比值和刺激卵巢颗粒细胞分化E2，从而促进和加强成骨作用，但是起效剂量达到2.5g/kg动物体重(曾莉萍,徐贤柱,饶华,王曼莹,蔡险峰,饶毅.杜仲叶β-谷甾醇对成骨细胞和卵巢颗粒细胞的影响[J].时珍国医国药,2012,23(5):1051-1053.)，提示单用谷甾醇成药性较差。

有动物实验研究发现高级脂肪酸可以通过减少骨髓脂肪组织扩张和减少骨质流失发挥抗骨质疏松作用；细胞实验研究也表明成骨细胞需要分解代谢外源性不饱和脂肪酸获取生长必需的营养物质与能量(Kelly,O.J.,Gilman,J.C.,et al.Long-chainpolyunsaturated fatty acids may mutually benefit both obesity andosteoporosis[J].Nutrition Research,2013,33(7):521-533.)，但是摄入过量不饱和脂肪酸(如大豆油)易产生过氧化脂质，会增加动脉粥样硬化和恶性肿瘤的发生几率(

可见，对于上述肉桂醛、亚油酸、谷甾醇中的任何一种有效组分，都不能单独开发成为抗骨质疏松症的药物，但若是组合在一起使用何种用量比会影响治疗骨质疏松症的药效也存在不确定性；对于本案申请人的课题组团队提出的一种含反式肉桂醛等挥发性物质、含亚油酸等高级不饱和脂肪酸以及γ-谷甾醇的药物组合物，目前也未见文献报道。

综上所述，如何开发一种对现有补肾活血方的改良型药物组合物，通过选用适宜质量配比的反式肉桂醛与γ-谷甾醇，以及选用适宜种类及用量的各有效组分，以确保药物质量稳定性和药效均一性，且相比于传统中药提取物和单一化合物具有更佳的抗骨质疏松症疗效，是本领域人员尚未解决的技术难题。

发明内容

本发明的第一发明目的在于，提供一种抗骨质疏松症的药物组合物及其制备方法，该药物组合物有明确的药效物质组分，各药效物质组分的质量配比适宜，以确保该药物组合物具有显著的促进成骨细胞增殖和诱导成骨分化活性，能够有效治疗骨质疏松症。

为实现本发明的第一目的，采用如下技术方案：

一种药物组合物，以总量100％计，由如下质量占比的原料组成：反式肉桂醛1-60％、α-衣兰油烯1-10％、γ-谷甾醇1-40％、顺-菖蒲烯1-20％、十六烷酸1-20％、顺-9-十八烯酸1-30％、亚油酸5-30％、亚麻酸5-30％。

优选的药物组合物，以总量100％计，由如下质量占比的原料组成：反式肉桂醛20-55％、α-衣兰油烯4-10％、γ-谷甾醇8-40％、顺-菖蒲烯4-15％、十六烷酸4-15％、顺-9-十八烯酸5-30％、亚油酸5-25％、亚麻酸5-25％。

优选的药物组合物，以总量100％计，由如下质量占比的原料组成：反式肉桂醛45-55％、α-衣兰油烯2-5％、γ-谷甾醇8-10％、顺-菖蒲烯5-8％、十六烷酸5-10％、顺-9-十八烯酸8-15％、亚油酸8-15％、亚麻酸5-10％。

优选的药物组合物，以总量100％计，由如下质量占比的的原料组成：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。

优选的药物组合物，以总量100％计，由如下质量占比的的原料组成：反式肉桂醛40％、α-衣兰油烯1％、γ-谷甾醇16％、顺-菖蒲烯1％、十六烷酸15％、顺-9-十八烯酸6％、亚油酸6％、亚麻酸15％。

进一步，在前述药物组合物中，反式肉桂醛与γ-谷甾醇的质量比为(2.5-6.25):1。

本发明的第二发明目的在于，提供一种上述药物组合物的应用，包括该药物组合物用于治疗骨质疏松症，以及用于制备成各种制剂形式。

为实现本发明的第二目的，采用如下技术方案：

一种如前所述的药物组合物在制备抗骨质疏松症药物中的应用，该药物能够促进成骨细胞增殖、诱导成骨分化。

进一步，该药物包含如前所述的药物组合物和药学上可接受的载体。具体而言，药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂或抗氧化剂。

此外，所述药学上可接受的载体还可以包括但不限于香味剂、甜味剂、防腐剂或着色剂。例如：山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、大豆磷脂、维生素C、维生素E、EDTA二钠、一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸钾、醋酸氯己定、麦芽糖、葡萄糖、右旋糖苷、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙或硬脂酸镁等。

本发明所述的药物组合物的给药途径，包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选的给药途径是口服给药或注射给药。

进一步，该药物的剂型可以是口服固体制剂、口服液体制剂或注射剂。

优选的，口服固体制剂选自胶囊剂、片剂；口服液体制剂选自水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂；注射剂选自乳剂、冻干粉针剂和水针剂。

更优选的，每100ml口服用乳剂中，由如前所述的药物组合物100g、大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂20-40g(优选30g)、油酸钠5-25g(优选10g)，蒸馏水加至100ml制成。

更优选的，胶囊剂由药液和胶液组成，每1000粒胶囊剂中，药液由如前所述的药物组合物100g、抗氧化剂和/或乳化剂3-20g(优选10g)制成；其中，抗氧化剂为维生素E，乳化剂为吐温80；胶液由重量比为1:(0.7-3):(1-7):(1-10)的明胶、纯化水、甘油和防腐剂(优选1:2.5:1:5)制成。

进一步，每1000粒胶囊剂中，药液由如前所述的药物组合物100g、抗氧化剂和/或乳化剂10g制成；其中，抗氧化剂为维生素E，乳化剂为吐温80；胶液由重量比为1:2.5:1:5的明胶、纯化水、甘油和防腐剂制成。

前述胶囊剂中，防腐剂选自包括但不限于的如下物质：苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等，优选山梨酸钾。

前述胶囊剂中，胶液的制备方法如下：依次将甘油、纯化水、防腐剂加入化胶罐内，加热至75-85℃后，再加入明胶不断搅拌、抽真空，直至明胶完全溶解，将胶液过滤，滤液在57-65℃下存放。

更优选的，每1000片所述的片剂中，由如前所述的药物组合物100g、滑石粉20-40g(优选25g)、液体石蜡5-15g(优选10g)、淀粉20-50g(优选30g)、酒石酸20-50g(优选25g)制成。其中，滑石粉是吸附有液状石蜡的滑石粉。

进一步，每1000片所述的片剂中，由如前所述的药物组合物100g、滑石粉25g、液体石蜡10g、淀粉30g、酒石酸25g制成。

与现有技术相比，本发明提供的一种抗骨质疏松症的药物组合物及其制备方法，有益效果在于：

本发明提供的药物组合物，相较于课题组团队在先申请的专利ZL201110086501.2中的中药提取物，明确了活性化合物成分及配比；本发明所述组合物能够使成骨细胞增殖率达到125-205％，ALP相对含量达到190-400％，钙化结节相对数量形成率达到110-700％，其中，优选的组合物能够使成骨细胞增殖达到145～200％，在抗骨质疏松质量方面具有积极效果。

附图说明

图1为实施例6用MTT法检测不同组合物对间充质干细胞C3H10T1/2(A)和前体成骨细胞MC3T3-E1细胞(B)增殖影响的柱形图；

注：与空白组相比较，

图2为实施例6不同组合物作用于MC3T3-E1细胞10天的ALP染色(A)显微图(放大×100倍)和茜素红染色(B)显微图(放大×100倍)。

图3为实施例7不同组合物作用于C3H10T1/2细胞10天ALP染色结果(A放大倍数：100)和碱性磷酸酶(ALP)相对含量结果(B)；

注：与空白组相比较，

图4为实施例7用结晶紫染色法检测不同天数、不同组合物促进C3H10T1/2成骨细胞集落形成的显微照片。

图5为实施例7用结晶紫染色法检测不同组合物对间充质干细胞C3H10T1/2细胞增殖率影响图；

注：与空白组相比较，

图6为实施例8不同组合物对MC3T3-E1成骨细胞内ALP含量影响图；

注：与空白组相比较，

图7为实施例9中不同时间的小鼠不同部位骨密度的DXA扫描图(A)、Masson三色染色图(B)。

图8为实施例9对照组与模型组给药前骨密度值(A)比较以及给药前后腰椎(B)、右股骨(C)、左股骨(D)测量点骨密度数据比较。

注：与模型组(第8、12周)相比较，

图9为实施例10不同含量比的反式肉桂醛与γ-谷甾醇形成的组合物对MC3T3-E1细胞增殖影响的柱形图；

注：与空白组相比较，

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1、本发明提供的药物组合物A

药物组合物A的配方(以质量占比计)：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。

药物组合物A的制备：按配方量，分别称取反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯4g、γ-谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g，总量100g，混匀，即得。

实施例2、本发明提供的药物组合物B

药物组合物B的配方(以质量占比计)：反式肉桂醛1％、α-衣兰油烯1％、γ-谷甾醇30％、顺-菖蒲烯12％、十六烷酸12％、顺-9-十八烯酸1％、亚油酸22％、亚麻酸21％。

药物组合物B的制备：按配方量，分别称取反式肉桂醛1g、α-衣兰油烯1g、γ-谷甾醇30g、顺-菖蒲烯12g、十六烷酸12g、顺-9-十八烯酸1g、亚油酸22g、亚麻酸21g，总量100g，混匀，即得。

实施例3、本发明提供的药物组合物C

药物组合物C的配方(以质量占比计)：反式肉桂醛40％、α-衣兰油烯1％、γ-谷甾醇16％、顺-菖蒲烯1％、十六烷酸15％、顺-9-十八烯酸6％、亚油酸6％、亚麻酸15％。

药物组合物C的制备：按配方量，分别称取反式肉桂醛40g、α-衣兰油烯1g、γ-谷甾醇16g、顺-菖蒲烯1g、十六烷酸15g、顺-9-十八烯酸6g、亚油酸6g、亚麻酸15g，总量100g，混匀，即得。

实施例4、本发明提供的药物组合物D

药物组合物D的配方(以质量占比计)：反式肉桂醛20％、α-衣兰油烯8％、γ-谷甾醇1％、顺-菖蒲烯15％、十六烷酸1％、顺-9-十八烯酸20％、亚油酸20％、亚麻酸15％。

药物组合物D的制备：按配方量，分别称取反式肉桂醛20g、α-衣兰油烯8g、γ-谷甾醇1g、顺-菖蒲烯15g、十六烷酸1g、顺-9-十八烯酸20g、亚油酸20g、亚麻酸15g，总量100g，混匀，即得。

实施例5、阳性对照药物A、B提取物的制备

阳性对照药物A配方：熟地黄90份，制附子60份，杜仲60份，山茱萸30份，枸杞60份，山药60份，甘草30份，红花20份，肉桂20份，桃仁40份。

醇提：将配方量的桃仁(40g)和肉桂(20g)混合粉碎至10-24目，加600mL体积浓度60％乙醇水溶液在25℃下浸泡1h后，70℃水浴回流提取3次，每次1.5h，各提取液滤过(利用漏斗滤纸滤过)，合并三次滤液后用旋蒸仪减压真空浓缩至250mL，获得醇提液。

水提：将配方量的熟地黄90g，制附子60g，杜仲60g，山茱萸30g，枸杞60g，山药60g，甘草30g，红花20g混合后粉碎至10-24目，加500mL蒸馏水，25℃下浸泡1h，95℃水浴回流提取3次，每次1.5h，将提取液减压真空浓缩达到1.05的相对密度，加入95％乙醇使提取液中乙醇的体积比调整为60％，4℃醇沉24h，滤过，回收乙醇至药液无醇味，再减压浓缩至250mL，获得水提液。再将醇提液和水提液混合均匀，最终得阳性对照药物A提取物500mL，生药量为0.94g/mL。

阳性对照药物B配方中的各原料及其用量比参照专利ZL201110086501.2中的实施例1，在本申请配方定为：熟地黄60份，制附子60份，杜仲40份，山茱萸20份，枸杞40份，山药40份，甘草40份，红花20份，肉桂40份，桃仁40份；阳性对照药物B的制备工艺仍采用传统的醇-水提取法，具体步骤参照专利ZL201310233904.4中的实施例7，最终得到阳性对照药物B，1g该药物相当于中药组合物生药量4.0g，药物相对密度为1.45。

以下实施例6-10系本发明的效果试验例，包括细胞水平的体外试验和动物水平的体内试验；需要说明的是，由于桂皮醛难溶于水(饱和溶解度<0.01g/L)，而细胞试验需要在以水为主培养液体系中完成，故无法直接溶解更高浓度含桂皮醛的组合物。本发明的研究重心是寻找拥有适宜用量比的各原料成分配伍成药物组合物，以考察该药物组合物对成骨细胞增殖的影响；而非是寻找助溶性佳、生物相容性好的辅料来促进高浓度下桂皮醛的溶解，因此，本发明在下述细胞水平的效果试验例中暂先放弃考察更高浓度含桂皮醛的药物组合物对成骨细胞增殖的影响。

实施例6、体外测定各药物组合物对间充质干细胞和成骨前体细胞的细胞增殖作用、成骨分化作用

1.实验材料及配置

(1)细胞株：C3H10T1/2(小鼠间充质干细胞)和MC3T3-E1(成骨前体细胞)，由浙江中医药大学骨研所馈赠。

(2)细胞培养基：添加体积浓度1％双抗Penicillin-Streptomycin(青霉素-链霉素，其中青霉素10000单位/mL，链霉素10000μg/mL)的DMEM培养基、体积浓度10％胎牛血清(GIBCO)。

(3)0.25％胰蛋白酶溶液(Trypsin)：购自杭州诺森德生物技术有限公司，-20℃保存。

(4)磷酸缓冲液(PBS)：购自杭州诺森德生物技术有限公司，4℃保存。

(5)结晶紫：购自上海源叶生物技术有限公司。

(6)MTT，ALP检测试剂盒：购自上海碧云天生物技术有限公司。

(7)Tris和茜素红粉末：购自Takara公司。

2.实验方法

(1)0.5％结晶紫染液配置：

取适量结晶紫粉末，置于研钵研细，用万分之一电子天平精密称取100mg，转移至洗净烧杯后加入20mL ddH

(2)结晶紫染色法测定细胞增殖情况：

将C3H10T1/2细胞接种至装有细胞培养基的细胞培养瓶，在细胞培养箱中37℃，5％CO

取离心管底部细胞团块加入2ml的细胞培养基反复吹打均匀制得均匀的细胞悬液，转移至普通无菌加样槽中，在96孔板每孔中加100μL，加好后置于超净台静置10min后移入的细胞培养箱(37℃，95％空气，5％CO

空白组每孔加100μL细胞培养基；

加药组每孔加100μL含药培养基，其中含药培养基是实施例1-3制备的药物组合物A、B、C，用细胞培养基制成0.0625、0.625、1.25、2.5、5、10μg/mL浓度的含药培养基；加药组的实验组别设有：组合物A、组合物B、组合物C；

阳性对照组每孔加入100μL阳性对照培养基，其中阳性对照培养基是将实施例5制备的阳性对照药物A、B提取物用细胞培养基以生药量计算配制成0.0625、0.625、1.25、2.5、5、10μg/mL浓度的阳性对照培养基；阳性对照组的实验组别设有：阳性药物提取物A、阳性药物提取物B。

各组继续培养24、48、72小时，每个浓度点重复三次。吸去培养基，用PBS洗去残留培养基后，每孔加0.1mL醋酸/甲醇(1:7，体积比)溶液固定细胞5min。

弃去细胞固定液，每孔加50μL 0.5％结晶紫染液，置于室温染色1小时。轻轻吸去染色液，用纯水洗涤96孔板各孔，直至各孔冲洗废液无紫色，室温风干后每孔加100μL甲醇(分析纯)，充分振荡后置于酶标仪570nm处测定吸光度(OD值)。

同样条件下，将C3H10T1/2细胞替换为MC3T3-E1细胞，同理测定吸光度(OD值)。

细胞增殖率(％)＝(药物处理组OD-空白组OD)/空白组OD×100％。

按照上述公式计算相对空白对照增殖率，结果见图1A和图1B。

从图1可知：

1)与空白组相比较，2个阳性对照组(阳性药物提取物A、阳性药物提取物B)均可显著促进细胞C3H10T1/2、MC3T3-E1增殖(P<0.01)，表明造模成功；

2)整体来看，阳性药物提取物A促进细胞增殖的作用略弱于阳性药物提取物B，但无显著差异(P>0.05)；

3)组合物B能起到一定的促进细胞C3H10T1/2、MC3T3-E1增殖作用，但效果略弱于或相当于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B，无显著差异(P>0.05)；

4)给药浓度为0.625～10μg/mL时，组合物A促进细胞C3H10T1/2、MC3T3-E1增殖作用的效果，均显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.01)；

5)给药浓度为2.5～5μg/mL时，组合物C促进细胞MC3T3-E1增殖作用的效果，显著优于阳性药物提取物B(P<0.05)；

给药浓度为1.25～2.5μg/mL时，组合物C促进细胞MC3T3-E1增殖作用的效果，显著优于阳性药物提取物A(P<0.01)。

(3)碱性磷酸酶(ALP)染色：

将MC3T3-E1细胞接种至细胞培养基，在37℃培养24h至对数生长期，经0.25％胰蛋白酶消化后制成1×104个/mL细胞悬液。每孔500μL将细胞悬液接种于24孔细胞板中，置于细胞培养箱中37℃培养24h后使细胞贴壁。

弃去细胞培养基，分成空白组、加药组和阳性对照组，其中：

空白组每孔各加100μL的细胞培养基；

加药组每孔加入100μL含药培养基，其中含药培养基是将实施例1-4中的组合物A、组合物B、组合物C和组合物D用细胞培养基配制的1.25μg/ml的含药培养基；加药组的实验组别设有：组合物A、组合物B、组合物C、组合物D。

阳性对照组加入100μL阳性对照培养基，其中阳性对照培养基是将实施例5方法制备的阳性对照药物A、B提取物用细胞培养基配制的以生药含量计1.25μg/ml的阳性对照培养基；阳性对照组的实验组别设有：阳性药物提取物A、阳性药物提取物B。

各组转移至细胞培养箱中继续培养10天后弃去培养液，每孔加入300μL PBS轻洗每孔残留培养基，再每孔加入400μL ALP试剂盒内的1-StepTMNBT/BCIP染色液，将24孔板置于37℃环境下染色1h。取出后轻轻吸去染色液，用纯水洗涤各孔。洗净后将细胞培养板倒扣于实验桌面上挥干多余水分，置于倒置显微镜下拍照，结果见图2A。

由图2A可知：不同配比组合物作用于MC3T3-E1细胞均能显著增强细胞内ALP表达，其中组合物C和组合物A促进细胞内ALP表达优于组合物B和组合物D，且不同组合物均优于阳性对照组。

(4)茜素红染色：

精密称取Tris粉末605.7mg，用双蒸水溶解制备得到0.05M Tris溶液。精密移取8.58mL浓盐酸至1000mL容量瓶中，用双蒸水定容至1000mL，即得0.1M HCl溶液。往0.05MTris溶液中逐滴滴入0.1M HCl溶液，至pH为8.3，即得pH＝8.3的Tris-HCl溶液。取适量茜素红粉末，置于研钵研细，用万分之一电子天平精密称取500mg，加入到上述pH＝8.3的Tris-HCl溶液，玻璃棒搅拌助溶，滤纸过滤，取续滤液即得0.5％茜素红染色液，室温备用。

按照步骤(3)项下进行细胞铺板和给药处理。分别给药作用10天后，弃去培养液，每孔加入300μL PBS洗去孔中残留液体，再加入400μL过滤得到备用的0.5％茜素红染色液，将24孔板置于37℃环境下染色0.5h。取出后弃去染色液，用纯水洗涤各孔。洗净后将细胞培养板倒扣于实验桌面上挥干多余水分，置于倒置显微镜下拍照，结果见图2B。

从图2B可知：不同配比组合物作用于MC3T3-E1细胞均能显著增强细胞钙化结节形成，从而促进成骨分化；其中组合物C和组合物A促进细胞成骨分化能力优于组合物B和组合物D，且不同组合物均优于阳性对照组。

3.实验结果

组合物A、组合物C作用于C3H10T1/2和MC3T3-E1细胞能够显著促进细胞增殖；组合物A、组合物C作用于MC3T3-E1显著增强细胞内ALP含量，成骨分化的效果优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B；组合物A、组合物B、组合物C和组合物D作用于MC3T3-E1细胞增加钙化结节含量效果显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B。

实施例7、各药物组合物促间充质干细胞C3H10T1/2增殖实验

(1)细胞培养：

取C3H10T1/2细胞常规贴壁生长，传代培养于细胞培养基(同实施例6)中，37℃、5％CO

(2)0.5％结晶紫染液配制：同实施例6。

(3)碱性磷酸酶(ALP)染色：

取对数生长期C3H10T1/2细胞，制备成8×10

作用10天后弃去培养液，每孔加入300μL的PBS轻洗每孔残留培养基，再加入400μL事先混匀的1-StepTMNBT/BCIP染色液，将24孔板置于37℃环境下染色1h。取出后轻轻吸去染色液，用纯水洗涤各孔。洗净后将细胞培养板倒扣于实验桌面上挥干多余水分，置于倒置显微镜下拍照，结果见图3A。

随后，向每孔加入1mL分析纯甲醇，于摇床上振荡10min(室温)。每孔移取100μL置新的96孔细胞板中，利用酶标仪在波长为570nm处测定OD值。

ALP相对表达＝(药物处理组OD-空白组OD)/空白组OD。

按照上述公式计算相对空白对照ALP表达差异倍数，结果见图3B。

从图3可知：

1)与空白组相比较，2个阳性对照组(阳性药物提取物A、阳性药物提取物B)作用于C3H10T1/2细胞均可显著提升细胞内ALP表达水平(P<0.01)，表明造模成功；

2)整体来看，阳性药物提取物A、阳性药物提取物B分别作用于C3H10T1/2细胞时，两者提升细胞内ALP表达水平的效果无显著差异(P>0.05)；

3)组合物B能起到一定的提升C3H10T1/2细胞内ALP表达水平的作用，但与阳性药物提取物A、阳性药物提取物B相比，无显著差异(P>0.05)；

4)给药浓度为1.25～10μg/mL时，组合物A提升C3H10T1/2细胞内ALP表达水平的效果，显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.01)；

5)给药浓度为5μg/mL时，组合物C提升C3H10T1/2细胞内ALP表达水平的效果，显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.01)。

(4)细胞集落形成试验法：

取对数生长期C3H10T1/2细胞，利用含有0.25％EDTA的胰酶消化培养瓶内细胞并加入2ml细胞培养基，吹打，制备成单细胞混悬液，分别用细胞培养基调整为12×10

各自接种于24孔培养板中(500μL/孔)，37℃，5％CO

空白组加入100μL/孔的细胞培养基；

加药组分别按100μL/孔加入细胞培养基配制的1.25μg/ml实施例1-3中的组合物A、组合物B、组合物C的培养液；加药组的实验组别设有：组合物A、组合物B、组合物C；

阳性对照组按100μL/孔加入细胞培养基配制的以生药量计1.25μg/ml实施例5制备的阳性对照药物A、B提取物的培养液；阳性对照组的实验组别设有：阳性药物提取物A、阳性药物提取物B。

各组转入培养箱中继续培养3天、10天(每隔3天换一次液)。采用细胞集落形成试验法-结晶紫染色法，于规定时间吸取原培养液，PBS清洗3次，用4℃预冷4％多聚甲醛溶液固定15min后，弃去4％多聚甲醛溶液，再用PBS清洗1次，每孔加入0.5％结晶紫染液，浸没孔表面，染色30min后，用流动的自来水洗去多余结晶紫溶液，洗至无颜色为止。将培养板倒置于室温中，使之干燥。利用显微镜扫描仪扫描获取各孔细胞克隆形成图片，结果见图4。

随后，向每孔加入1mL分析纯甲醇，于摇床上振荡10min(室温)，充分溶解后，每孔移取100μL置新的96孔细胞板中，利用酶标仪在波长为570nm处测定OD值。

细胞增殖率(％)＝(药物处理组OD-空白组OD)/空白组OD×100％。

按照上述公式计算间充干细胞增殖率，结果见图5。

从图4、图5中可知：

1)与空白组相比较，2个阳性对照组(阳性药物提取物A、阳性药物提取物B)均可显著提升C3H10T1/2细胞的增殖活性(P<0.05)，表明建模成功；

2)与空白组相比较，3个加药组(组合物A、组合物B、组合物C)在给药10天后均能显著提升C3H10T1/2细胞的增殖活性(P<0.05)；

3)给药浓度为1.25μg/mL、给药10天后，组合物B促进细胞C3H10T1/2增殖的效果略强于阳性药物提取物A、略弱于阳性药物提取物B，但均无显著差异(P>0.05)；

4)给药浓度为1.25μg/mL、给药3天或10天后，组合物A促进细胞C3H10T1/2增殖的效果，均显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.05)；

5)给药浓度为1.25μg/mL、给药3天或10天后，组合物C促进细胞C3H10T1/2增殖的效果，均显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.05)。

综上，本发明中不同组合物作用于细胞后，均可促进间充干细胞增殖，组合物A和组合物C的效果均优于组合物B和阳性对照药物提取组，且具有统计学差异(P＜0.01)。

实施例8、各药物组合物增强小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1碱性磷酸酶活性实验

1.实验方法

取对数生长期生长状态良好的MC3T3-E1细胞，利用胰酶消化制成细胞混悬液，分别用实施例6细胞培养基调整为12×10

设置空白组，加药组和阳性对照组，其中：

空白组加入100μL/孔的细胞培养基；

加药组分别按100μL/孔加入细胞培养基配制的1.25μg/ml实施例1-3中的组合物A、组合物B、组合物C的培养液；加药组的实验组别设有：组合物A、组合物B、组合物C；

阳性对照组按100μL/孔加入细胞培养基配制的以生药量计1.25μg/ml实施例5制备的阳性对照药物A、B提取物的培养液；阳性对照组的实验组别设有：阳性药物提取物A、阳性药物提取物B。

各组转入培养箱中继续培养3天、10天(每隔3天换一次液)。采用WAKOLabAssayTMALP Alkaline Phosphatase Assay Kit碱性磷酸酶定量检测盒测定细胞内ALP含量，细胞培养后，除去培养基，用PBS冲洗，各孔添加150μL、0.05％的曲拉通x，进行冻结→融化→冻结→融化操作，温度设定4℃，以15,000rpm离心15分钟处理。将上清液移到新的辅助管，以此作为细胞内测定ALP含量的样品。

依据定量检测试剂盒说明书，向96孔微孔板内添加100μL底物缓冲液和20μL样品。在摇床上充分振荡1分钟后，37℃孵育15分钟。再添加80μL反应终止液，再在摇床上充分振荡1分钟，用酶标仪测量405nm处的吸光值。同样方法进行空白(蒸馏水)和碱性磷酸酶标准品的检测。

ALP相对含量＝(药物处理组OD-空白组OD)/(标准品OD-空白组OD)×100％。

按照上述公式计算细胞内ALP相对含量，结果见图6。

2.实验结果

从图6可知：

1)与空白组相比较，2个阳性对照组(阳性药物提取物A、阳性药物提取物B)在给药10天后均可显著提升MC3T3-E1细胞内的ALP表达水平(P<0.01)，表明建模成功；

2)与空白组相比较，3个加药组(组合物A、组合物B、组合物C)在给药10天后均能显著提升MC3T3-E1细胞内的ALP表达水平(P<0.01)；

3)给药3天后，组合物A、组合物B、组合物C提升MC3T3-E1细胞内的ALP表达水平的效果，均显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.05)；

4)给药10天后，组合物A、组合物B、组合物C提升MC3T3-E1细胞内的ALP表达水平的效果，均显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.05)。

综上，从给药第3天到第10天，各组别的ALP活性均有明显统计学差异，ALP活性增加，组合物A、组合物B、组合物C均优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B。

实施例9、小鼠去卵巢致骨质疏松症模型构建方法和骨密度(BMD)的测定

(1)实验动物：ICR小鼠60只，清洁级，雌性、体重约20±5g，购自浙江中医药大学动物实验中心，实验在浙江中医药大学动物实验中心进行，室温20～23℃，相对湿度60～70％，12小时交替光照。

(2)模型构建方法：将小鼠头部放在含有恒定流量异氟烷的管道中，在麻醉条件下，打开小鼠腹腔，手术切除小鼠卵巢并缝合腹腔，建立小鼠骨质疏松模型。

(3)给药方案与测量方案：所有模型动物按体重随机分为6组，每组10只，分别为：对照组，模型组，给药组1、给药组2、给药组3和阳性对照组，其中：

对照组灌胃生理盐水；

模型组灌胃等体积生理盐水；

给药组1、给药组2和给药组3分别给予实施例1-3中组合物A、组合物B、组合物C的生理盐水溶液(0.625g/kg体重·天)；对应的实验组别设有：组合物A、组合物B、组合物C；

阳性对照组灌胃实施例5制备的阳性对照药物A提取物的生理盐水溶液(按临床给药剂量折算为6.25g/kg体重·天)；对应的实验组别设有：阳性药物提取物A。

每组灌胃给药，每天一次持续12周。在给药第8周、第12周，使用DEXA设备(HologicQDR 4500W，美国)测量每只动物腰椎、右股骨和左股骨的骨矿物质密度(BMD)值，不同时间点骨密度测量部位的结果见图7A，不同时间点骨密度测量值的结果见图8。

实验结束后，在深度麻醉下处死所有动物，采集股骨进行组织学分析。

(4)Masson染色：在第12周实验结束后，对采集的股骨，4℃下，将股骨在4％多聚甲醛中固定5天，随后置于甲酸溶液(80％)中14天进行脱钙，然后包埋在石蜡中。组织切片并贴在带正电的载玻片上。

最后，使用Masson三色染色试剂盒(Solarbio，北京，中国)对股骨进行染色，使用徕卡DMI6000 B显微镜(德国徕卡)对每张切片进行组织学评估，结果见图7B。

(5)实验结果

从图7A、图8A中可知：

1)与对照组相比较，模型组造模后腰椎、双侧股骨(即左股骨、右股骨，下同)的骨密度均显著下降(P<0.05)，表明小鼠去卵巢致骨质疏松症模型成功构建；

从图7B、图8B、图8C、图8D中可知：

1)与第0周的模型组相比较，造模第8至12周的模型组腰椎、双侧股骨的骨密度均显著下降(P<0.05)，表明造模成功；

2)与第8周的模型组相比较，组合物A、组合物B、组合物C、阳性药物提取物A均可显著提升腰椎、双侧股骨的骨密度值(P<0.05)；

与第12周的模型组相比较，组合物A、组合物B、组合物C、阳性药物提取物A均可显著提升腰椎、双侧股骨的骨密度值(P<0.05)；

3)给药第8周后与阳性药物提取物A相比较，组合物A提升小鼠腰椎、双侧股骨的骨密度的效果更优(P<0.05)；

4)给药第12周后与阳性药物提取物A相比较，组合物A和组合物C提升小鼠腰椎、双侧股骨的骨密度的效果均更优(P<0.05)。

综上，图7B和图8表明组合物A、组合物C相较于模型组和阳性提取物A具有显著延缓骨密度下降作用(P<0.05)。

实施例10、反式肉桂醛与γ-谷甾醇的含量比变化对成骨前体细胞的增殖作用影响差异

在实施例6-9实验的基础上，本案申请人发现：实施例1-4所得的组合物A、组合物B、组合物C、组合物D均能增强MC3T3-E1细胞内ALP的表达，尤以组合物A、组合物C的效果更佳。进一步研究发现，本申请设计的药物组合物中，反式肉桂醛与γ-谷甾醇的含量比对药效作用的影响甚为关键。

因此，在本实施例中，申请人拟对反式肉桂醛与γ-谷甾醇的含量比进行单因素影响的考察试验，具体考察方法为：

假定药物组合物中反式肉桂醛与γ-谷甾醇的总用量为一定值，其余原料及组分均固定不变，仅改变反式肉桂醛与γ-谷甾醇的含量比，考察不同含量比的药物组合物对成骨前体细胞MC3T3-E1的增殖作用影响差异。

本实施例中，设如下4个实验组：组合物A、组合物C’、组合物E、组合物F，其中：

组合物A：即实施例1的处方，组合物中反式肉桂醛:γ-谷甾醇＝6.25；

组合物C’：组合物中反式肉桂醛:γ-谷甾醇＝2.5，其它原料的种类及用量同实施例1；

组合物E：组合物中反式肉桂醛:γ-谷甾醇<2.5，其它原料的种类及用量同实施例1；

组合物F：组合物中反式肉桂醛:γ-谷甾醇>6.25，其它原料的种类及用量同实施例1。

本实施例中，上述4个实验组采用结晶紫染色法测定细胞增殖情况，测定方法同实施例6“2.实验方法”的步骤(1)和(2)，按如下公式计算细胞增殖率，结果见图9。

细胞增殖率(％)＝(药物处理组OD-空白组OD)/空白组OD×100％。

从图9中可知：

1)与空白组相比较，2个阳性对照组(阳性药物提取物A、阳性药物提取物B)均可显著促进细胞MC3T3-E1增殖(P<0.01)，表明造模成功；

2)整体来看，组合物A、组合物C’促进细胞MC3T3-E1增殖作用的效果，均显著优于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.01)；

组合物E、组合物F促进细胞MC3T3-E1增殖作用的效果，均显著弱于阳性药物提取物A、阳性药物提取物B(P<0.01)。

综上，当反式肉桂醛与γ-谷甾醇的含量比为(2.5～6.25):1时，本发明提供的药物组合物就有极佳的促成骨前体细胞增殖的作用，可用于开发成抗骨质疏松症的药物。

实施例10、药物组合物的口服乳剂

在实施例1的药物组合物A的配方条件下，制备本实施例所述的口服乳剂。

配方(以质量占比计)：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。

制备：

(1)按配方量，分别称取反式反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯4g、γ-谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g，混合均匀；

(2)称取10g油酸钠加入蒸馏水40mL，55℃磁力搅拌水浴锅中分散均匀，作为水相；将30g豆磷脂及步骤(1)所得的组合物进行混合制备含药油脂，55℃磁力搅拌水浴锅中分散均匀作为油相；在高剪切分散乳化机(HY-FA30，中国)搅拌下将水相慢慢加至油相中，6000r/min搅拌8min得初乳，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液或盐酸水溶液调节pH至7.5，用蒸馏水定容至100mL，均质压力50MPa，循环6次，得100mL乳白色的终乳，充氮灌装，室温下放置，即得。

实施例11、药物组合物的胶囊剂

在实施例1的药物组合物A的配方条件下，制备本实施例所述的胶囊剂。

配方(以质量占比计)：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。

制备：

(1)胶液配制：称取纯化水50g、甘油20g和山梨酸钾100g，依次加入旋转模压机胶罐内，加热至75℃后，再加入明胶20g，不断搅拌，直至明胶完全溶解，过70μm滤膜过滤，滤液即为胶液，在57～65℃下存放，备用；

(2)药液配制：将反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯4g、γ-谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g、维生素E10g、10g吐温80加入配料罐内，混合均匀，获得药液；

(3)压胶囊：选择旋转模压机压丸模具，在25℃、相对湿度小于35％条件下进行压丸定型后干燥，约压丸1000粒，剔除大小不合格，用95％药用乙醇洗丸后，继续干燥至含水量小于12％，目检剔除不合格胶囊，包装，即得。

实施例12、药物组合物的片剂

在实施例1的药物组合物A的配方条件下，制备本实施例所述的片剂。

配方(以质量占比计)：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。

组合物：反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯4g、γ-谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g。

辅料：液状石蜡10g、滑石粉25g、淀粉30g、酒石酸25g。

制备：

将组合物与1/3量的淀粉和酒石酸混匀，制软材，过14目尼龙筛制湿颗粒，于70℃干燥，干颗粒用12目尼龙筛整粒，加入剩余的淀粉(预先100-105℃干燥)及吸附含有10g液状石蜡的25g滑石粉共同混匀后再过12目尼龙筛，颗粒经含量测定合格后，用12mm冲压片，约冲压片1000片，即得。

需要说明的是，上述实施例10-12只是举例表明以实施例1所述的药物组合物A配方为基础可开发剂型的多样性，包括但不限于实施例10-12所述的口服乳剂、胶囊剂、片剂，还可以是口服混悬液、口服溶液剂、口服糖浆剂、注射用乳剂、冻干粉针剂、水针剂……等等。更进一步说明，不论该剂型是固体制剂、液体制剂、注射剂、外用制剂还是其它新型递送系统，也不论药物组合物给药途径的多样化(包括但不限于：口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药等)，只要所开发的药物组合物具有成药性的剂型，皆可应用。

此外，上述实施例1-4的药物组合物处方也是举例说明，只要本发明提供的药物组合物中反式肉桂醛与γ-谷甾醇的含量比为(2.5～6.25):1时，就有极佳的促成骨前体细胞增殖的作用，具备产业化开发成抗骨质疏松症药物的潜力。