一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

萜类化合物，又称类异戊二烯，由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物构成，是植物的次生代谢产物。柠檬烯属于单环单萜类化合物，是一种来源于植物的天然活性化合物，化学式为C

目前D-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的，但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点，大量提取D-柠檬烯受原料与工艺的限制。利用化学方法也能够合成柠檬烯，但化学合成法需要采用高温、高压和昂贵的催化剂，而且生产设备复杂、原料利用率低、环境污染严重。本世纪初合成生物学技术的兴起，为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具，打破了物种间的界限，使微生物异源合成D-柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成D-柠檬烯的微生物细胞工厂，实现微生物发酵法替换传统的植物提取法和化学合成法，具有重要的经济与社会效益。目前代谢工程应用于柠檬烯的生产主要以酿酒酵母与大肠杆菌为底盘细胞，酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂，被广泛的应用于各种生物燃料、化工产品、医药保健品等的合成，酿酒酵母在萜类化合物的生产中应用较广泛。

Si Cheng等人通过工程改造竞争性基因ERG20的葡萄糖感应启动子HXT1以及引入由植物NPPS和植物LS利用底物NPP组成的OLB途径等策略，补料分批发酵实现柠檬烯产量917.7mg/L。胡智慧等人采用过表达或共过表达MVA关键基因、关键酶启动子优化，关键酶点突变随机突变相结、表达相关转运蛋白以增加耐受性等策略，连续发酵实现柠檬烯产量62.31mg/L。Xue Zhang等人通过设计PDH旁路简化MVA途径、弱化竞争旁路，增加胞质乙酰辅酶A含量，摇瓶补料发酵120h柠檬烯产量达到1446.56mg/L，罐上分批补料发酵实现柠檬烯产量2230mg/L，是目前国内外报道的产量最高水平。关于合成生物学的技术和方法，目前国内外现有技术柠檬烯产量无法满足工业化应用的要求。申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌MKL8，已实现D-柠檬烯摇瓶发酵657mg/L，该菌株生产D-柠檬烯的能力仍有较大的提升空间。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株，综合运用细胞质与线粒体双重调控使柠檬烯的产量得到进一步的提升。

本发明的第一个目的是提供一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株，所述的菌株以酿酒酵母MKL8为宿主，敲除了柠檬酸合酶基因CIT2和谷氨酸脱氢酶(NADP(+))基因GDH1，并增加了柠檬烯合酶tLimS拷贝数。

进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1所示的序列：

MERRSGNYNPSRWDVNFIQSLLSDYKEDKHVIRASELVTLVKMELEKETDQIRQLELIDDLQRMGLSDHFQNEFKEILSSIYLDHHYYKNPFPKEERDLYSTSLAFRLLREHGFQVAQEVFDSFKNEEGEFKESLSDDTRGLLQLYEASFLLTEGETTLESAREFATKFLEEKVNEGGVDGDLLTRIAYSLDIPLHWRIKRPNAPVWIEWYRKRPDMNPVVLELAILDLNIVQAQFQEELKESFRWWRNTGFVEKLPFARDRLVECYFWNTGIIEPRQHASARIMMGKVNALITVIDDIYDVYGTLEELEQFTDLIRRWDINSIDQLPDYMQLCFLALNNFVDDTSYDVMKEKGVNVIPYLRQSWVDLADKYMVEARWFYGGHKPSLEEYLENSWQSISGPCMLTHIFFRVTDSFTKETVDSLYKYHDLVRWSSFVLRLADDLGTSVEEVSRGDVPKSLQCYMSDYNASEAEARKHVKWLIAEVWKKMNAERVSKDSPFGKDFIGCAVDLGRMAQLMYHNGDGHGTQHPIIHQQMTRTLFEPFA。

进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS基因通过诱导型启动子GAL10进行表达。

进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS的表达位点为酿酒酵母基因组的1021b位点、208a位点、308a位点、720a位点、YPRCδ15c位点、1014a位点中的至少两处。

进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS的拷贝数由2增加至6。

进一步地，所述的柠檬酸合酶基因的NCBI编号为NP 009931.1，所述的谷氨酸脱氢酶(NADP(+))基因的NCBI编号为NP_015020.3，所述的柠檬烯合酶基因的NCBI编号为AAC37366.1。此处柠檬烯合酶基因是未截短的序列。

进一步地，所述的重组酵母菌株还包括将柠檬烯合成途径酶定位至线粒体表达。

进一步地，所述的柠檬烯合成途径酶包括甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1、乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶基因ERG13、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸ERG8和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19、法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20ww和柠檬烯合酶基因tLimS。

进一步地，所述的截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2所示的序列：

atggaccaattggtgaaaactgaagtcaccaagaagtcttttactgctcctgtacaaaaggcttctacaccagttttaaccaataaaacagtcatttctggatcgaaagtcaaaagtttatcatctgcgcaatcgagctcatcaggaccttcatcatctagtgaggaagatgattcccgcgatattgaaagcttggataagaaaatacgtcctttagaagaattagaagcattattaagtagtggaaatacaaaacaattgaagaacaaagaggtcgctgccttggttattcacggtaagttacctttgtacgctttggagaaaaaattaggtgatactacgagagcggttgcggtacgtaggaaggctctttcaattttggcagaagctcctgtattagcatctgatcgtttaccatataaaaattatgactacgaccgcgtatttggcgcttgttgtgaaaatgttataggttacatgcctttgcccgttggtgttataggccccttggttatcgatggtacatcttatcatataccaatggcaactacagagggttgtttggtagcttctgccatgcgtggctgtaaggcaatcaatgctggcggtggtgcaacaactgttttaactaaggatggtatgacaagaggcccagtagtccgtttcccaactttgaaaagatctggtgcctgtaagatatggttagactcagaagagggacaaaacgcaattaaaaaagcttttaactctacatcaagatttgcacgtctgcaacatattcaaacttgtctagcaggagatttactcttcatgagatttagaacaactactggtgacgcaatgggtatgaatatgatttctaaaggtgtcgaatactcattaaagcaaatggtagaagagtatggctgggaagatatggaggttgtctccgtttctggtaactactgtaccgacaaaaaaccagctgccatcaactggatcgaaggtcgtggtaagagtgtcgtcgcagaagctactattcctggtgatgttgtcagaaaagtgttaaaaagtgatgtttccgcattggttgagttgaacattgctaagaatttggttggatctgcaatggctgggtctgttggtggatttaacgcacatgcagctaatttagtgacagctgttttcttggcattaggacaagatcctgcacaaaatgttgaaagttccaactgtataacattgatgaaagaagtggacggtgatttgagaatttccgtatccatgccatccatcgaagtaggtaccatcggtggtggtactgttctagaaccacaaggtgccatgttggacttattaggtgtaagaggcccgcatgctaccgctcctggtaccaacgcacgtcaattagcaagaatagttgcctgtgccgtcttggcaggtgaattatccttatgtgctgccctagcagccggccatttggttcaaagtcatatgacccacaacaggaaacctgctgaaccaacaaaacctaacaatttggacgccactgatataaatcgtttgaaagatgggtccgtcacctgcattaaatcctaa。

进一步地，所述法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20ww是对法尼基焦磷酸合酶基因ERG20 96位苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，127位天冬酰胺(Asn)突变为色氨酸(Trp)得到。

进一步地，进一步地，所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的NCBI编号是NP_015208.1，所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的NCBI编号是NP_013636.1，所述的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因的NCBI编号是NP_015297.1，β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶的NCBI编号是NP_013580.1，甲羟戊酸激酶的NCBI编号是NP_013935.1，磷酸甲羟戊酸的NCBI编号是NP_013947.1、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶的NCBI编号是NP_014441.1，所述的柠檬烯合成酶的NCBI编号是AAC37366.1。

本发明的第二个目的是提供所述的重组酵母菌株在发酵生产D-柠檬烯中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明在前期构建的菌株MKL8的基础上继续优化前体乙酰辅酶A和NADPH辅因子水平，为胞内柠檬烯合成创造了较优条件，在此基础上增加胞内柠檬烯合酶拷贝数由2个至8个，确定最佳拷贝数，摇瓶发酵实现产量由原来的657mg/L，提升至1248mg/L，比原产量提高1.90倍，胞内柠檬烯合成已达到峰值。再运用区室化工程将柠檬烯合成全途径酶定位至线粒体，实现所述重组酿酒酵母菌株柠檬烯在线粒体内的同步高效合成。综合运用细胞质与线粒体双重调控使柠檬烯的产量得到进一步的提升至1392mg/L，最终实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，重组酵母菌株相对于原菌株具有较好的生长速率，具有较大的应用推广价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

材料和方法：

酿酒酵母MKL8的构建方法参见公开号为CN114606146A的中国专利。

气相-质谱联用检测方法如下：使用带有FID检测器和色谱柱(Thermo；25m，0.32mm，0.25μm)的Thermofisher Scientific TSQ8000仪器进行检测。进样器温度为180℃，载气为氦气，流速为1mL/min，压力为5.8psi。程序从70℃开始，以20℃/min的速率将温度升至150℃，保持3分钟，然后以2℃/min的速度将温度升至190℃，保持3分钟。

实施例1：使用CRISPR-cas9技术敲除柠檬酸合酶基因CIT2

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物CIT2-U-F、CIT2-U-R扩增得到基因CIT2上游1000bp基因片段，采用引物CIT2-D-F、CIT2-D-R扩增得到基因CIT2下游1000bp基因片段。

(b)使用核酸酶SwaI和BelI

(c)采用引物CIT2-oligo2-F和CIT2-oligo1-R梯度退火，具体方法是，体系中按照1:1比例加入上述两种引物，设置PCR仪温度从98℃至12℃，按照每秒0.1℃的速率退火。

(d)将(b)所得线性化片段与(c)经退火后的引物使用T4 DNA连接酶连接，具体方法是加入(b)(c)所得体系各1μL，T4 DNA连接酶1μL，T4 DNA连接酶10×buffer 1μL，去离子水6μL，置于22℃反应3小时。即可得到pML104-CIT2 CRISPR-Cas9的质粒。连接完成后转入大肠jM109或DH5α感受态均可。将转化成功的菌测序，测序正确的单菌落接入2mL LB培养基内，培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒用于后续酵母化转。

(e)制备酿酒酵母MKL8感受态，并将扩增好的CIT2上、下游1000bp基因片段，pML104-CIT2质粒共同转入MKL8感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-CIT2U-F，YZ-CIT2D-R进行菌落PCR验证。

(f)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL9。

引物序列：

CIT2-U-F：cagtggcaacaggaatatcttcagg

CIT2-U-R：ctaatcaagaagtactagaatggttccgttttatttggcgtttcaagggc

CIT2-D-F：gcccttgaaacgccaaataaaacggaaccattctagtacttcttgattagcacgc

CIT2-D-R：ctcattattaagtttcagggaacaatatcaacacatatc

CIT2-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACagatcttttgtttagcggac

CIT2-oligo1-R：gatcgtccgctaaacaaaagatctGTTTTAGAGCTAG

YZ-CIT2U-F:ccaagaaggggaagcgcc

YZ-CIT2D-R:gctaactggcgaggttccaac。

实施例2：使用CRISPR-cas9技术敲除谷氨酸脱氢酶(NADP(+))GDH1

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物GDH1-U-F、GDH1-U-R扩增得到基因GDH1上游1000bp基因片段，采用引物GDH1-D-F、GDH1-D-R扩增得到基因GDH1下游1000bp基因片段。

(b)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物GDH1-oligo2-F和GDH1-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-GDH1 CRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL9感受态，并将扩增好的GDH1上、下游1000bp基因片段，pML104-GDH1质粒共同转入MKL7感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-GDH1U-F，YZ-GDH1D-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL10。

引物序列：

GDH1-U-F：gtggctgatagagttaatgcggg

GDH1-U-R：ctatgatcgactatgccacaaacggggcacaaaactctcaaagaatcacatgg

GDH1-D-F：tgtgattctttgagagttttgtgccccgtttgtggcatagtcgatcatagc

GDH1-D-R：taagaagtagcagcaaaggccgg

GDH1-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACtggacgagcaccagcaatgt

GDH1-oligo1-R：gatcacattgctggtgctcgtccaGTTTTAGAGCTAG

YZ-GDH1U-F：ggtgatatcggtgttggtggtcg

YZ-GDH1D-R：ccagagacgtcaattctcgccc。

实施例3：在基因组上增加柠檬烯合酶tLims可拷贝数至最优

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段PGAL10-tLimS-TCYC1，后采用引物tLimS-TRP-F、tLimS-1021D-R将其扩增,以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物1021b-U-F、1021b-U-R扩增得到1021b上游500bp基因片段，采用引1021b-U-F、1021b-D-R扩增得到整合位点1021b下游500bp基因片段。采用引物loxP-TRP-F、loxP-TRP-R扩增loxP-TRP标签片段。

(b)制备酿酒酵母MKL10感受态，并将扩增好的基因片段PGAL10-tLimS-TCYC1,1021b上、下游500bp基因片段，loxP-TRP标签片段共同转入MKL10感受态中，待SD TRP筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-tLimS-1021b-F，YZ-1021b-tLimS-R进行菌落PCR验证，验证成功的菌送测序。测序无误的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL11。

引物序列：

1021b-U-F:ATATTAAGATGGGGAAAGAAAGATCCTTTAACGC

1021b-U-R:attgttatccgctcacaattccacaCAGGAATGGTTTAACTGCTAAGAGACAC

1021b-D-F:TTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATATGGCATTATGAGTTAAGAGATAATACGCACG

1021b-D-R:TGAATCTAGTACCCTTCCCCATTCA

tLimS-1021D-R:TATTATCTCTTAACTCATAATGCCATATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGG

tLimS-TRP-F:gatgcggtattttctccttacgcatggccgcaaattaaagccttcg

TRP-1021U-F:TCTCTTAGCAGTTAAACCATTCCTGtgtggaattgtgagcggataacaa

TRP-tLimS-R:cgctcgaaggctttaatttgcggccatgcgtaaggagaaaataccgcatcag

YZ-tLimS-1021b-F:ccaattctgatgctctgataacatgc

YZ-1021b-tLimS-R:TCTGCGGAATTTCACCAACTGAC

(c)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P

(d)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物208a-oligo2-F和208a-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-208a CRISPR-Cas9的质粒。

(e)制备酿酒酵母MKL11感受态，并将扩增好的208a位点上、下游1000bp基因片段，pML104-208a质粒共同转入MKL11感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-208aU-tLimS-F，YZ-tLimS-208aU-R进行菌落PCR验证。

(f)将步骤(e)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL12。

引物序列：

tLimS-208aU-F:TCTGATTTTTTTTTCAATGAGTGCAggccgcaaattaaagccttcg

tLimS-208aD-R:GATATTCAGTTTTTGTCATTGCCGTTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAG

208a-U-F:CTGTTACCAAATACTCCTCCTCTACTC

208a-U-R:cgctcgaaggctttaatttgcggccTGCACTCATTGAAAAAAAAATCAGAGAAAGCC

208a-D-F:TTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAACGGCAATGACAAAAACTGAATATC

208a-D-R:TTACTTTACATGTTATCGGAGGCCTG

208a-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACagatcttttgtttagcggac

208a-oligo1-R:gatcgtccgctaaacaaaagatctGTTTTAGAGCTAG

YZ-208aU-tLimS-F:GGTTCACTACACGAGCATTCATTG

YZ-tLimS-208aU-R:gagattggctgatgatttgggtac

(g)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P

(h)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物308a-oligo2-F和308a-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-308a CRISPR-Cas9的质粒。

(i)制备酿酒酵母MKL12感受态，并将扩增好的308a位点上、下游1000bp基因片段，pML104-308a质粒共同转入MKL12感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-308aU-tLimS-F，YZ-tLimS-308aU-R进行菌落PCR验证。

(j)将步骤(e)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL13。

引物序列：

tLimS-308aU-F:taccatccaataccttgatgaacttttcaggccgcaaattaaagccttc

tLimS-308aD-R:ggtagcaatatgtagcaaagaagacTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGG

308a-U-F:cgttgattcgtcaacttaaagatgacc

308a-U-R:aggctttaatttgcggcctgaaaagttcatcaaggtattggatggtatat

308a-D-F:TTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAgtcttctttgctacatattgctaccac

308a-D-R:gattctcaccgcatgacaagt

308a-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACTATATTCTGTTTGACAAGTG

308a-oligo1-R:gatcCACTTGTCAAACAGAATATAGTTTTAGAGCTAG

YZ-308aU-tLimS-F:ctacagggaatcgatgaggttgtaag

YZ-tLimS-308aU-R:gatggttctacggtggtcataagcc

(k)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P

(l)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物720a-oligo2-F和720a-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-720a CRISPR-Cas9的质粒。

(m)制备酿酒酵母MKL13感受态，并将扩增好的720a位点上、下游1000bp基因片段，pML104-720a质粒共同转入MKL13感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-720aU-tLimS-F，YZ-tLimS-720aU-R进行菌落PCR验证。

(n)将步骤(e)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL14。

引物序列：

tLimS-720aU-F:GTTTGTTACTGTTGATTGTTCGTTTggccgcaaattaaagccttcg

tLimS-720aD-R:gcgagcgcagaagcgaacacttgtcTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGG

720a-U-F:GTTGATGCCGTTATTATCGATGCTGAC

720a-U-R:cgctcgaaggctttaatttgcggccAAACGAACAATCAACAGTAACAAACCG

720a-D-F:TTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAgacaagtgttcgcttctgcgc

720a-D-R:atctccatatgaataccaacaggttg

720a-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACCAACAATTGTTACAATAGTA

720a-oligo1-R:gatcTACTATTGTAACAATTGTTGGTTTTAGAGCTAG

YZ-720aU-tLimS-F:ccaattctgatgctctgataacatgc

YZ-tLimS-720aU-R:ATTGAGGAAAGCACTGATGATCTAG

(o)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P

(p)参照例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物YPRCδ15c-oligo2-F和YPRCδ15c-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-YPRCδ15cCRISPR-Cas9的质粒。

(q)制备酿酒酵母MKL14感受态，并将扩增好的YPRCδ15c位点上、下游1000bp基因片段，pML104-YPRCδ15c质粒共同转入MKL14感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-YPRCδ15cU-tLimS-F，YZ-tLimS-YPRCδ15cU-R进行菌落PCR验证。

(r)将步骤(e)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL15。

引物序列：

tLimS-YPRCδ15cU-F:tttggtttcgattgttggcaaagacggccgcaaattaaagccttcg

tLimS-YPRCδ15cD-R:ggacgcgaatgcaagacagaagtccTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGG

YPRCδ15c-U-F:gctcgcactcaggatcgaac

YPRCδ15c-U-R:cgctcgaaggctttaatttgcggccgtctttgccaacaatcgaaaccaaac

YPRCδ15c-D-F:TTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAggacttctgtcttgcattcgcg

YPRCδ15c-D-R:cacacgtcggcacttactatcc

YPRCδ15c-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACAATCCGAACAACAGAGCATA

YPRCδ15c-oligo1-R:gatcTATGCTCTGTTGTTCGGATTGTTTTAGAGCTAG

YZ-YPRCδ15cU-tLimS-F:ggctttaccaacaatggaatttcgac

YZ-tLimS-YPRCδ15cU-R:gatggttctacggtggtcataagcc

(s)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段P

(t)参照例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物1014a-oligo2-F和1014a-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-1014a CRISPR-Cas9的质粒。

(u)制备酿酒酵母MKL15感受态，并将扩增好的1014a位点上、下游1000bp基因片段，基因片段P

(v)将步骤(e)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL16。

引物序列：

tLimS-1014aU-F:tagcccttaacaacaatggaatacgggccgcaaattaaagccttcgag

tLimS-1014aD-R:agaagtctgtatgagttacggaagcTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGG

1014a-U-F:gctctaccattgagccaccg

1014a-U-R:cgctcgaaggctttaatttgcggcccgtattccattgttgttaagggctac

1014a-D-F:TTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAgcttccgtaactcatacagacttctatcg

1014a-D-R:ccagagatgactggccaacagc

1014a-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACttatgtgcgtattgctttca

1014a-oligo1-R:gatctgaaagcaatacgcacataaGTTTTAGAGCTAG

YZ-1014aU-tLimS-F:gacatgaatgatgagaaatagtcatcagac

YZ-tLimS-1014aU-R:gatggttctacggtggtcataagcc。

实施例4：验证MVA途径基因与柠檬烯合成酶基因的线粒体定位情况

选择酵母细胞色素氧化酶(CoxIV)的亚单位IV中26AA作为N-末端线粒体定位信号(MLS，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：atgctttcactacgtcaatctataagatttttcaagccagccacaagaactttgtgtagctctagatatctgcttcag)，与上述目标基因的N-末端融合，后在上述目标基因的C-末端融合绿色荧光蛋白eGFP，使用诱导型启动子GAL10，以质粒PY15为表达载体，构建9个不同的质粒。以质粒PY26为载体，在红色荧光蛋白mCherry的N-末端融合信号肽(MLS)序列。依次将构建完成的PY26与PY15质粒转入酵母细胞，使用共聚焦显微镜观察荧光显色区域以验证基因的线粒体定位情况。

实施例5：使用CRISPR-cas9技术将MVA途径基因ERG10与ERG13连接线粒体定位信号肽MLS整合至酿酒酵母基因组1414a位点

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段PGAL1-MLS-ERG10-TADH1-PGAL10-MLS-ERG13-TCYC1，后采用引物ERG10-13-F、ERG10-13-R将其扩增，以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物1414a-U-F、1414a-U-R扩增得到1414a上游500bp基因片段，采用引物1414a-D-F、1414a-D-R扩增得到整合位点1414a下游500bp基因片段。

(b)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物1414a-oligo2-F和1414a-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-1414aCRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL14感受态，并将扩增好的1414a位点上、下游500bp基因片段，基因片段PGAL1-MLS-ERG10-TADH1-PGAL10-MLS-ERG13-TCYC1，pML104-1414a质粒共同转入MKL14感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-1414a-F，YZ-1414a-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL17。

引物序列：

1414a-U-F：cagaatctcggcctactgagc

1414a-U-R：cgctcgaaggctttaatttgcggccgatgtgcacatgtcgttttttgagc

1414a-D-F：tctcaggtatagcatgaggtcgctccacgtttattgcttgggagtaagg

1414a-D-R：gcaaatgcgcactcggagtc

ERG10-13-R：accttactcccaagcaataaacgtggagcgacctcatgctatacctgaga

ERG10-13-F：gctcaaaaaacgacatgtgcacatcggccgcaaattaaagccttcgag

1414a-oligo2-F：CTAGCTCTAAAACgacccttgaaactgtggcgc

1414a-oligo1-R：gatcgcgccacagtttcaagggtcGTTTTAGAGCTAG

YZ-1414a-F：cgctaagtagattgattacccctttg

YZ-1414a-R：ctatgttggatctgacgacttacaag。

实施例6：使用CRISPR-cas9技术将MVA途径基因ERG8、ERG12、ERG19连接线粒体定位信号肽MLS整合至酿酒酵母基因组HIS3b位点

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段PGAL1-MLS-ERG8-TADH1-PGAL10-MLS-ERG19-TCYC1-PGAL7-MLS-ERG12-TTDH3，后采用引物ERG8-12-19-F、ERG8-12-19-R将其扩增,以酿酒酵母S288C基因组为模版,采用引物HIS3b-U-F、HIS3b-U-R扩增得到HIS3b上游500bp基因片段，采用引物HIS3b-D-F、HIS3b-D-R扩增得到整合位点HIS3b下游500bp基因片段。

(b)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物HIS3b-oligo2-F和HIS3b-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-HIS3bCRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL17感受态，并将扩增好的HIS3b位点上、下游500bp基因片段，基因片段PGAL1-MLS-ERG10-TADH1-PGAL10-MLS-ERG13-TCYC1，pML104-HIS3b质粒共同转入MKL17感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-HIS3b-F，YZ-HIS3b-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL18。

引物序列：

ERG8-12-19-F:aagtcataacacagtcctttcccgcAAGGGAAAGATATGAGCTATACAGCG

ERG8-12-19-R:ctttgccttcgtttatcttgcctgcgagcgacctcatgctatacctgagaa

HIS3b-D-F:tctcaggtatagcatgaggtcgctcgcaggcaagataaacgaaggcaaag

HIS3b-D-R:gcgcgcctcgttcagaat

HIS3b-U-F:ctcgacatcacaatgaagtcaaccc

HIS3b-U-R:GCTGTATAGCTCATATCTTTCCCTTgcgggaaaggactgtgttatgac

HIS3b-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACcctctagtacactctatatt

HIS3b-oligo1-R:gatcaatatagagtgtactagaggGTTTTAGAGCTAG

YZ-HIS3b-R:gaaacagacttgggtgggactg

YZ-HIS3b-U:gccatatggatccgctgcac。

实施例7：使用CRISPR-cas9技术将MVA途径基因tHMG1与IDI连接线粒体定位信号肽MLS整合至酿酒酵母基因组YOLCd1b位点

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段PGAL1-MLS-tHMG1-TADH1-PGAL10-MLS-IDI-TCYC1，后采用引物tHMG1-IDI-F、tHMG1-IDI-R将其扩增,以酿酒酵母S288C基因组为模版,采用引物YOLCd1b-U-F、YOLCd1b-U-R扩增得到YOLCd1b上游500bp基因片段，采用引物YOLCd1b-D-F、YOLCd1b-D-R扩增得到整合位点YOLCd1b下游500bp基因片段。

(b)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物YOLCd1b-oligo2-F和YOLCd1b-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-YOLCd1bCRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL18感受态，并将扩增好的YOLCd1b位点上、下游500bp基因片段,基因片段PGAL1-MLS-tHMG1-TADH1-PGAL10-MLS-IDI-TCYC1，pML104-YOLCd1b质粒共同转入MKL18感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-YOLCd1b-F，YZ-YOLCd1b-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL19。

引物序列：

tHMG1-IDI-F:tggaatttcgttccaacatcaataccggccgcaaattaaagccttcg

tHMG1-IDI-R:atcaggatagttactaccgttagccgagcgacctcatgctatacctgag

YOLCd1b-D-F:tctcaggtatagcatgaggtcgctcggctaacggtagtaactatcctgatg

YOLCd1b-D-R:ctgtggcaattatcagcattctcatac

YOLCd1b-U-D:gctcgaaggctttaatttgcggccggtattgatgttggaacgaaattccaatatc

YOLCd1b-U-F:cgacaccttcaggcacttgt

YOLCd1b-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACctagaatttccattttgcgt

YOLCd1b-oligo1-R:gatcacgcaaaatggaaattctagGTTTTAGAGCTAG

YZ-YOLCd1b-F:gggtgaattttgagagaattgttggg

YZ-YOLCd1b-R:ccgtatccatgccatccatcg。

实施例8：使用CRISPR-cas9技术将MVA途径基因ERG20

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，人工合成基因片段PGAL1-MLS-tHMG1-TADH1-PGAL10-MLS-IDI-TCYC1，后采用引物tHMG1-IDI-F、tHMG1-IDI-R将其扩增,以酿酒酵母S288C基因组为模版,采用引物106a-U-F、106a-U-R扩增得到106a上游500bp基因片段，采用引物106a-D-F、106a-D-R扩增得到整合位点106a下游500bp基因片段。

(b)参照实施例1(b)(c)步骤类似的方法，采用引物106a-oligo2-F和106a-oligo1-R梯度退火，参照实施例1步骤(d)类似的方法，构建获得质粒pML104-106a CRISPR-Cas9的质粒。

(c)制备酿酒酵母MKL19感受态，并将扩增好的106a位点上、下游500bp基因片段,基因片段PGAL1-MLS-tHMG1-TADH1-PGAL10-MLS-IDI-TCYC1，pML104-106a质粒共同转入MKL19感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物YZ-106a-F，YZ-106a-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为MKL20。

引物序列：

106a-D-F:tctcaggtatagcatgaggtcgctcccggcagaaagattttcgctacc

106a-D-R:cagaaccagcaacaacgtttaatg

106a-U-F:cagagcatgtagtatgggactcaag

106a-U-R:cgctcgaaggctttaatttgcggccctagcattgacacacatctcaagtc

ERG20ww-tLimS-F:gacttgagatgtgtgtcaatgctagggccgcaaattaaagccttcg

ERG20ww-tLimS-R:cgggtagcgaaaatctttctgccgggagcgacctcatgctatacctg

106a-oligo2-F:CTAGCTCTAAAACgggcgctaccctgaccgtat

106a-oligo1-R:gatcatacggtcagggtagcgcccGTTTTAGAGCTAG

YZ-106a-F:gataggttgcagttgtctgcgg

YZ-106a-R:ggctgatgatttgggtacatctg。

实施例9：重构酿酒酵母工程菌的发酵培养

挑取固体YPD平板上的酿酒酵母工程菌单菌落，接种到在2ml YPD液体培养基中，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种初始OD为0.2的原则接入含有40mL大豆蛋白胨液体培养基的250mL圆底带挡板摇瓶内，10％正十二烷直接覆盖于发酵液上方进行双相发酵，30℃，220rpm培养96h。发酵结束后，发酵结束后离心取有机相用于气相质谱联用检测。

发酵结果

样品使用正己烷稀释200倍，后送Thermo TSQ8000三重四级杆气质联用仪检测，所使用色谱柱型号为TG-5MS。其中菌株MKL8柠檬烯产量为450mg/L，MKL9柠檬烯产量为486mg/L，MKL10柠檬烯产量为584mg/L，MKL11柠檬烯产量为670mg/L，MKL12柠檬烯产量为748mg/L，MKL13柠檬烯产量为905mg/L，MKL14柠檬烯产量为1248mg/L，MKL15柠檬烯产量为923mg/L，MKL16柠檬烯产量为909mg/L，MKL20柠檬烯产量为1392mg/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。