一种构建山西糜子种质DNA分子身份证的SSR分子标记组合及分子身份证的构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种构建山西糜子种质DNA分子身份证的SSR分子标记组合及分子身份证的构建方法。

背景技术

糜子(Panicum miliaceum L.)又名黍稷，一年生小粒禾谷类作物，属禾本科黍属，栽培历史超过10300年，是最古老的栽培和驯化作物之一，起源于中国北方黄河流域，主要分布在亚洲(东南亚和西亚)和欧洲的半干旱地区。糜子在所有谷类作物中具有最短的生命周期和最高的水分利用效率，是干旱半干旱地区人们日常生活的粮食保障与救灾作物，还是能量和蛋白的主要来源，营养价值高，可以与水稻、小麦和玉米相媲美。糜子还可以修复土壤中的镉污染，镉胁迫显著降低了植物对必需金属元素的吸收，糜子以其较强的非生物抗逆性而闻名，在边缘地区和新开垦的土地上都可以作为先锋作物，还可以修复土壤中的镉污染，是一个很有前途的镉生物修复植物品种。

SSR(simple sequence repeats，SSR)或者称之为微卫星，是广泛应用于作物染色体图谱构建、品种选育鉴定等方面的DNA分子标记技术。与其他的分子标记技术相比，SSR标记的优点是相对丰富、基因组覆盖率高、重复性好、共显性，是分子辅助育种的理想选择。近年来，SSR标记在糜子上的研究取得了长足进展。2019年，何杰丽等用80对EST-SSR引物对分布于国内和国外的6个糜子生态栽培区的144份糜子材料进行遗传多样性分析，发现国内资源的Shannon多样性指数(I)(0.8628)和多态性信息含量(PIC)(0.4651)均高于国外资源，遗传多样性更丰富，就国内资源而言，北方春糜子区的遗传多样性最丰富；石甜甜等用144个(高、低碱基序列重复分别为64和80个)SSR标记对71份国内糜子资源和25份国外糜子资源进行遗传多样性，发现北方春糜子区材料的PIC值和I值最高，西北春夏糜子区材料最低；2020年，陈小红等基于前期转录组测序获得的1000对SSR引物，以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料，选出200对进行多态性检测，发现177对(88.5％)可以扩增出完整条带，其中80对具多态性，多态率为40％，其中单碱基序列重复引物10对，二碱基序列重复引物15对，三碱基序列重复引物55对；林元香等用80对糜子特异性SSR标记分析对56份糜子材料(中国28份，印度27份)进行遗传差异分析，结果表明中国糜子资源的I值(0.8467±0.1528)和PIC值(0.4458)均高于印度资源(0.8380±0.1435，0.3948)，遗传多样性更丰富。

DNA条形码自2003年首次提出，已在主粮作物[水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)和玉米(Zea mays)等]、果树资源[苹果(Malus pumila)、桃(Amygdaluspersica)和梨(Pyrus sorotina)等]和油料作物[花生(Arachishypogaea)、芝麻(Sesamum indicum)和油菜(Brassica napus)等]中普遍应用，实现了大批资源的数字化和网络化管理。而在糜子上的研究较少，山西是糜子起源中心，共有1592份种质资源，但是目前并没有为糜子构建DNA分子身份证，更没有实现对山西糜子种质资源进行数字化和网络化管理。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种构建山西糜子种质DNA分子身份证的SSR分子标记组合及分子身份证的构建方法，为快速鉴定糜子资源，建立大数据管理平台，为种质身份标识和溯源管理提供理论依据。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种构建山西糜子种质DNA分子身份证的SSR分子标记组合，所述SSR分子标记组合包括：RYW5、RYW7、RYW8、RYW9、RYW11、RYW16、RYW18、RYW19、RYW28、RYW31、RYW37、RYW40、RYW49、RYW53、RYW54、RYW62、RYW65、RYW67、RYW77和RYW84；

针对所述SSR分子标记组合所设计的引物对序列依次如SEQ ID NO.1～40所示。

优选的，所述DNA分子身份证包括字符串NA分子身份证、条形码NA分子身份证和二维码DNA分子身份证中的一种或多种。

本发明还提供了一种基于SSR分子标记构建山西糜子种质DNA分子身份证的方法，包括以下步骤：提取山西糜子种质资源的叶片基因组DNA为模板，利用上述SSR分子标记组合进行PCR扩增，读取PCR扩增条带并整理为基因型数据，依次计算遗传多样性指数和PIC值，构建聚类图，创建DNA分子身份证。

优选的，所述叶片包括三叶期糜子叶片。

优选的，所述PCR扩增的体系和程序所述PCR扩增的体系以20μL计，包括：2×MasterMix 10μL、引物各0.8μL、DNA模板1μL和余量的ddH

所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性40s，不同Tm退火40s，72℃延伸1min，36循环；72℃再延伸10min。

优选的，所述基因型数据包括0和1。

优选的，用PopGen 1.32计算遗传多样性指数，用PowerMarker 3.25分析PIC值，用MEGA 5.0基于UPGMA构建聚类图，用资源特征分析软件ID Analysis 4.0创建DNA分子身份证。

优选的，基于不同SSR标记读带结果依次排序构建字符串DNA分子身份证，利用在线条形码生成器将对应字符串生成可扫描的条形码DNA分子身份证，利用二维码在线技术将材料基本信息转化成二维码，即二维码DNA分子身份证。

优选的，所述材料基本信息包括：名称、统一编号、生态区、来源地、材料类别和字符串DNA分子身份证。

本发明还提供了利用上述方法构建得到的山西糜子种质DNA分子身份证。

有益效果：本发明提供了一种构建山西糜子种质DNA分子身份证的SSR分子标记组合，所述SSR分子标记组合均多态性较好、条带清晰，可将272份山西核心种质材料完全区分，构建其DNA分子身份证，以期对山西糜子种质资源进行数字化和网络化管理。本发明实施例中，20对SSR引物共检测到等位变异(Na)60个，平均每个位点检出3个；检测到有效等位变异(Ne)为2.4145(RYW16)～2.9882(RYW5)，平均值为2.7873；I值为0.9578(RYW16)～1.0967(RYW5)，平均值为1.0552；Nei’s基因多样性指数(Nei)为0.5858(RYW16)～0.6654(RYW5)，平均值为0.6402；PIC为0.6044(RYW77)～0.7821(RYW146)，平均值为0.6921。综合PIC和I值，高于平均值的SSR引物有9对(RYW37、RYW28、RYW5、RYW18、RYW54、RYW11、RYW49、RYW53和RYW8)。

附图说明

图1～图7为本发明272份糜子资源的分子身份证图，各图中编号与表2标号一致。

具体实施方式

本发明提供了一种构建山西糜子种质DNA分子身份证的SSR分子标记组合，所述SSR分子标记组合包括：RYW5、RYW7、RYW8、RYW9、RYW11、RYW16、RYW18、RYW19、RYW28、RYW31、RYW37、RYW40、RYW49、RYW53、RYW54、RYW62、RYW65、RYW67、RYW77和RYW84；

针对所述SSR分子标记组合所设计的引物对序列依次如SEQ ID NO.1～40所示。

本发明针对上述SSR分子标记设计的引物序列如表1所示，表中F表示正向引物，R表示反向引物，且序列均为5′-3′。

表1本发明所涉及的引物信息

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本发明所述DNA分子身份证优选包括字符串DNA分子身份证、条形码DNA分子身份证和二维码DNA分子身份证中的一种或多种。

本发明还提供了一种基于SSR分子标记构建山西糜子种质DNA分子身份证的方法，包括以下步骤：提取山西糜子种质资源的叶片基因组DNA为模板，利用上述SSR分子标记组合进行PCR扩增，读取PCR扩增条带并整理为基因型数据，依次计算遗传多样性指数和PIC值，构建聚类图，创建DNA分子身份证。

本发明所述叶片优选包括三叶期糜子叶片。本发明对从所述叶片中提取基因组DNA的方法并没有特殊限定，优选包括CTAB法提取。本发明对提取得到的基因组DNA进行质量检测，所述质量检测方法优选参考何杰丽等的方法(何杰丽,石甜甜,陈凌,等.糜子EST-SSR分子标记的开发及种质资源遗传多样性分析.植物学报,2019,54(6):723-732.)

本发明对符合要求的DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增的体系和程序所述PCR扩增的体系以20μL计，包括：2×MasterMix 10μL、引物各0.8μL、DNA模板1μL和余量的ddH2O；

所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性40s，不同Tm退火40s，72℃延伸1min，36循环；72℃再延伸10min。本发明的扩增产物后，优选利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，0.1％硝酸银染色显影，而后将PCR扩增条带并整理为基因型数据，所述基因型数据优选包括0和1，并用Excel转换成不同软件相应格式。

本发明在创建DNA分子身份证时，优选用PopGen 1.32(Yeh F C,Boyle TJ.Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers andquantitative traits.Belgian Journal ofBotany,1997,129:157.)计算遗传多样性指数，用PowerMarker 3.25(Liu K,Muse S V.PowerMarker:an integrated analysisenvironment for genetic marker data.Bioinformatics,2005,21:2128-2129.)分析PIC值，用MEGA 5.0(Tamura K,Peterson D,PetersonN,et al.MEGA5:molecularevolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distanceand maximum parsimony methods.Molecular Biology and Evolution,2011,28:2731-2739.)基于UPGMA构建聚类图，用东北农业大学开发的资源特征分析软件IDAnalysis 4.0(胡振帮,高运来,齐照明,等.作物分子身份证构建软件ID analysis的编制.中国农业科学,2016,49(12):2255-2266.)创建分子身份证。基于不同SSR标记读带结果依次排序构建字符串DNA分子身份证，利用在线条形码生成器(http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php)将对应字符串生成可扫描的条形码DNA分子身份证，利用二维码在线技术(https://cli.im/)将材料基本信息(包括名称、统一编号、生态区、来源地、材料类别及字符串DNA分子身份证)转化成可扫描的二维码，即二维码DNA分子身份证。

本发明还提供了利用上述方法构建得到的山西糜子种质DNA分子身份证。

本发明实施例中对来源于山西省的糜子核心种质资源272份材料(表2)构建DNA分子身份证，实现对山西糜子种质资源进行数字化和网络化管理。

表2本发明所涉及到的272份材料

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下面结合实施例对本发明提供的一种构建山西糜子种质DNA分子身份证的SSR分子标记组合及分子身份证的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、材料和方法

1.1试验材料

供试材料为272份山西糜子资源(表2)，来源于国家种质资源库，包括82份农家种，180份地方品种，10份育成品种，85对预选引物序列详细信息见王瑞云等(王瑞云,刘笑瑜,王海岗,等.用高基元微卫星标记分析中国糜子遗传多样性.中国农业科学,2017,50(20):3848-3859.)。

1.2方法

1.2.1DNA提取

剪取三叶期糜子叶片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，DNA质量检测方法同何杰丽等(何杰丽,石甜甜,陈凌,等.糜子EST-SSR分子标记的开发及种质资源遗传多样性分析.植物学报,2019,54(6):723-732.)。

1.2.2SSR引物的筛选

以6份地理来源不同的糜子资源(表3)为试验材料，用85对引物进行PCR扩增，PCR反应体系(20μL)包括2×MasterMix(中科瑞泰2×Taq PCR MasterMix)10μL、引物(终浓度为0.4μmol/L)各0.8μL、ddH

表3 6份地理来源不同的糜子资源

1.2.3数据分析

读取PCR扩增条带并整理为基因型数据(0，1)，用Excel转换成不同软件相应格式。用PopGen 1.32计算遗传多样性指数，用PowerMarker 3.25分析PIC值，用MEGA5.0基于UPGMA构建聚类图，用东北农业大学开发的资源特征分析软件IDAnalysis 4.0创建分子身份证。基于不同SSR标记读带结果依次排序构建字符串DNA分子身份证，利用在线条形码生成器(http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php)将对应字符串生成可扫描的条形码DNA分子身份证，利用二维码在线技术(https://cli.im/)将材料基本信息(包括名称、统一编号、生态区、来源地、材料类别及字符串DNA分子身份证)转化成可扫描的二维码，即二维码DNA分子身份证。

二、结果与分析

2.1SSR引物的筛选

对表3中的6份糜子资源，利用上述85对SSR引物对材料进行PCR扩增，结果发现69对引物的多态性较好、条带清晰。

用69对SSR引物扩增山西省糜子核心种质资源272份材料，结果发现47对SSR引物的扩增条带清晰，通过读取条带发现，部分引物的结果一样，利用软件ID analysis 4.0分析，20对引物可以将272份材料分开，20对引物的详细信息见表1。

2.2基于SSR的山西糜子核心种质的遗传多样性

用上述20对SSR引物扩增山西糜子核心种质的272份材料，其遗传多样性分析结果见表4。从表4可以看出，20对SSR引物共检测到等位变异(Na)60个，平均每个位点检出3个；检测到有效等位变异(Ne)为2.4145(RYW16)～2.9882(RYW5)，平均值为2.7873；I值为0.9578(RYW16)～1.0967(RYW5)，平均值为1.0552；Nei’s基因多样性指数(Nei)为0.5858(RYW16)～0.6654(RYW5)，平均值为0.6402；PIC为0.6044(RYW77)～0.7821(RYW146)，平均值为0.6921。综合PIC和I值，高于平均值的SSR引物有9对(RYW37、RYW28、RYW5、RYW18、RYW54、RYW11、RYW49、RYW53和RYW8)。

表4 20对SSR引物的遗传多样性参数

2.3基于SSR的山西糜子核心种质DNA分子身份证的构建

以272份山西糜子核心种质资源为材料，基于20对SSR引物进行PCR扩增，利用IDAnalysis 4.0软件分析检测，发现20对引物组合(RYW67、RYW53、RYW37、RYW65、RYW62、RYW77、RYW5、RYW49、RYW84、RYW19、RYW11、RYW40、RYW54、RYW28、RYW31、RYW7、RYW16、RYW8、RYW9和RYW18)可区分全部材料。以材料1为例，其字符串DNA分子身份证为10011101101111101111，表示在上述标记顺序下材料显示条带为：RYW67有，RYW53无，RYW37有，RYW65有，依次类推，到RYW18有。将上述字符串DNA分子身份证导入在线条形码生成器，获得条形码DNA分子身份证。将各供试材料的基本信息和字符串DNA分子身份证录入在线二维码生成框得到二维码DNA分子身份证。272份材料的条形码和二维码DNA分子身份证见图1～图7。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。