五没食子酰葡萄糖在制备抗抑郁药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及五没食子酰葡萄糖在制备抗抑郁药物中的应用。

背景技术

抑郁症是现在最常见的一种心理疾病，根据美国《精神疾病诊断与统计手册》分类标准，抑郁症被定义为一种严重的情绪紊乱，患者常表现出悲伤、绝望、快感缺乏和不舒服等核心症状并伴随着认知及躯体不适，对日常生活积极性显著降低。抑郁症己经成为最常见的一种精神疾病和导致残疾的主要原因之一。抑郁症患病率逐年增长，据报道全世界范围约有3.5亿抑郁症患者。

目前，药物治疗大多以化学合成的西药为主，如五羟色胺再摄取抑制剂以及五羟色胺和去甲肾上腺素双重再摄取抑制剂等。这些药的主要作用与增加突触间隙神经递质含量密切相关。但这些化学合成抗抑郁药普遍具有见效慢、周期长、副作用大的缺点，而传统中药因具有副作用小，来源丰富，靶点广泛等的优点，使得中药在抑郁症治疗方面的应用日益广泛，因此，有必要开发出更多能治疗抑郁症的中药。

1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖是一种天然多酚类化合物，存在于如芍药、牡丹、天竺葵等植物中，并具有多种生物学活性，包括抗氧化、抗炎、细胞保护、抗病毒等生物学活性，已被证明在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等诸多恶性肿瘤疾病中发挥一定作用。有文献报道，PGG在前列腺癌、鼻咽癌等疾病中可诱导自噬，也可以通过增强自噬体的形成来提高机体内在的抗病毒活性。但在神经系统以及抑郁疾病中，未见其相关报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了五没食子酰葡萄糖在制备抗抑郁药物中的应用。本发明发现五没食子酰葡萄糖可改善CUMS小鼠快感缺失的抑郁样行为，可改善小鼠的行为绝望状态，可增加CUMS小鼠的探究行为，即五没食子酰葡萄糖具有改善小鼠抑郁样行为的作用；同时也发现15mg/kg五没食子酰葡萄糖能显著提升小鼠结肠LC3B，beclin1和p62的水平，30mg/kg五没食子酰葡萄糖能显著增加小鼠前额皮层中LC3B，Beclin1和p62的水平，即五没食子酰葡萄糖能够增强小鼠结肠和前额皮层的自噬。本发明首次发现了五没食子酰葡萄糖的抗抑郁作用及作用机理，对抑郁症的治疗意义重大。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种五没食子酰葡萄糖在制备抗抑郁药物中的应用，所述抗抑郁药物的药效剂量为每日每千克体重10～40mg的五没食子酰葡萄糖。

优选的，所述抗抑郁药物的药效剂量为每日每千克体重15～30mg的五没食子酰葡萄糖。

优选的，所述五没食子酰葡萄糖作为所述抗抑郁药物的唯一活性成分。

优选的，所述抗抑郁药物包括五没食子酰葡萄糖药学上可接受的盐、共晶、立体异构体、前药、溶剂化物、代谢产物中的至少一种。

优选的，所述抗抑郁药物还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂、色素中的至少一种。

优选的，所述抗抑郁药物可被制成任意一种药学上可接受的剂型，所述剂型包括乳液、霜剂、丸剂、滴丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、涂剂、巴布剂、喷雾剂、口服液、汤剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂中的任意一种。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

(1)本发明发现五没食子酰葡萄糖可改善CUMS小鼠快感缺失的抑郁样行为，也可改善小鼠的行为绝望状态，还可增加CUMS小鼠的探究行为，说明五没食子酰葡萄糖可改善小鼠抑郁样行为。

(2)CUMS的处理改变了自噬相关信号分子的表达，包括LC3B，Beclin1和p62的水平，而五没食子酰葡萄糖处理逆转了这些变化。具体而言，15mg/kg五没食子酰葡萄糖处理组显著提升了小鼠结肠LC3B，beclin1和p62的水平，而30mg/kg五没食子酰葡萄糖处理组未能提升小鼠结肠beclin1和p62的水平，但是30mg/kg五没食子酰葡萄糖处理组小鼠前额皮层中LC3B，Beclin1和p62的水平显著增加。说明五没食子酰葡萄糖增强了小鼠结肠和前额皮层的自噬。

(3)本发明首次发现了五没食子酰葡萄糖的抗抑郁作用及相应作用机理，对抑郁症的治疗具有十分重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例4中的行为学测试结果，其中A为糖水偏爱实验结果，B为悬尾实验结果，C为旷场实验结果；

图2为本发明实施例5中的自噬标志物水平检测结果，其中A-C为小鼠结肠LC3B、Beclin1、p62的水平，D-F为小鼠前额皮层LC3B、Beclin1、p62的水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例1动物分组与处理

选用健康雄性C57BL/6N SPF小鼠38只，体重20±5g，在医学动物实验室中饲养，并在正式实验开始前进行7天的适应性喂养过程。饲养条件：室温21±2℃，相对适度30-40％，光照明暗12小时(7：00-19:00，暗19:00-7:00)。将小鼠随机分为5组，对照组、慢性不可预知温和应激抑郁模型组(CUMS)、氟西汀组(FLX)、五没食子酰葡萄糖低剂量组(PGG15mg/kg)、五没食子酰葡萄糖高剂量组(PGG 30mg/kg)。对照组动物正常饲养，没有刺激；模型组、FLX组及PGG组动物实行慢性不可预知温和应激方式，持续8周，同时FLX组和PGG组接受3周的治疗。

实施例2药物的制备

PGG(99.61％纯度，CAS号14937-32-7)购自成都麦德生科技有限公司(中国成都)(批号RP210608)。PGG组分别接受15mg/kg、30mg/kg剂量的1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖，每天通过灌胃法进行一次。PGG溶液制备如下：分别将84mg、168mg PGG溶解在纯水中，PGG的最终浓度为1.5mg/mL、3mg/mL。

氟西汀(FLX)购自北京沃凯生物科技有限公司(中国北京)(批号OKA20210408)。FLX组接受20mg/kg剂量的氟西汀，每天通过灌胃法进行一次。FLX溶液制备如下：将112mgFLX溶解在纯水中，FLX的最终浓度为2mg/mL。

实施例3CUMS模型的制备

诱发CUMS的方法是每天交替暴露在压力源下，连续8周。刺激方式包括束缚3h、通宵照明、禁食24h、禁水24h、4-8℃的冰水游泳、2分钟的夹尾，刺激随机安排于一周内，每日一种，连续8周同种刺激不能连续出现。动物断头处死前进行糖水偏嗜实验、悬尾实验和旷场实验。

实施例4行为学测试

1糖水偏嗜实验(SPT)

在实验开始前一天，对动物进行适应含糖饮用水的训练，给与每只小鼠两个含有1％蔗糖的水瓶24小时。在第二天的24小时内，每个笼子里放置一瓶纯水和1％蔗糖的水瓶，第三天禁食禁水24小时后，同时给每只小鼠一瓶纯水和一瓶1％的蔗糖水。一小时后，记录剩余纯水和蔗糖溶液的体积。按下式计算动物对糖水的偏嗜性(％)。

动物对糖水的偏嗜率(％)＝糖水摄入(g)/总摄入(g)。

2悬尾实验(TST)

每只小鼠被悬挂在离地面50厘米的水平杆上，尾巴用胶带固定。整个实验过程持续了6分钟。记录每只小鼠在最后4分钟内的活动情况。不动时间(S)被定义为小鼠放弃挣扎并保持完全不动所需的时间。

3旷场实验(OFT)

每只小鼠在行为操作室中放置10分钟进行适应，然后移至中心区，开始摄像并计时，观察小鼠的行为，时间为5分钟。每次实验后，立即用75％的酒精清洗盒子。使用国际公认的行为分析软件(EthoVision软件分析系统，Noldus信息技术公司，Leesburg,VA,USA)进行OFT。

三个实验的实验数据采用SPSS25软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，实验数据采用均数加减标准差(x±s)表示，当P<0.05则认为差异有统计学意义。其中糖水偏爱实验结果如图1A所示，悬尾实验结果如图1B所示，旷场实验结果如图1C所示。

由图1A可知：与对照组相比，CUMS组糖水偏嗜率显著下降(P<0.001)；与CUMS组相比，FLX组、PGG组糖水偏嗜率升高(P<0.01)，提示PGG可改善CUMS小鼠快感缺失的抑郁样行为。

由图1B可知：与对照组相比，CUMS组不动时间显著上升(P<0.001)；与CUMS组相比，FLX组、PGG组不动时间下降(P<0.05)，提示PGG可改善小鼠的行为绝望状态。

由图1C可知：与对照组相比，CUMS组在旷场中心区停留时间下降(P<0.05)；与CUMS组相比，FLX组、PGG组在旷场中心区停留时间上升(P<0.05)，提示PGG可增加CUMS小鼠的探究行为。

以上行为学测试说明PGG摄入可缓解CUMS诱导的小鼠抑郁样和焦虑样行为。

实施例5自噬标志物水平检测

PGG治疗组分别采用15mg/kg的低剂量和30mg/kg的高剂量，通过RT-qPCR以检测用PGG治疗3周后小鼠结肠和前额皮质中三种常用的自噬标志物LC3B，Beclin1和p62的水平，以研究CUMS诱导的抑郁样条件下的自噬。

总RNA是使用索莱宝总RNA提取试剂盒(北京)按照制造商的说明从小鼠的结肠和前额皮层匀浆组织中提取的。使用反转录试剂盒和SYBR预混型qPCR试剂盒(艾科瑞)和基因特异性引物在Bio-rad Cx96检测系统(美国生物雷达)上进行定量，其中PCR所用引物如表1所示。

表1LC3B、Beclin1、p62引物序列

每个cDNA一式三份进行测试。热源条件为95℃30分钟，95℃5秒钟，60℃30秒钟，扩增40次循环。PCR产物的相对定量归一化，GAPDH作为内参。

实验数据同样采用SPSS25软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，实验数据采用均数加减标准差(x±s)表示，当P<0.05则认为差异有统计学意义。检测结果如图2所示，其中图2A-图2C为小鼠结肠LC3B、Beclin1、p62的水平，图2D-图2F为小鼠前额皮层LC3B、Beclin1、p62的水平。

结果显示：CUMS的处理改变了自噬相关信号分子的表达，包括LC3B，Beclin1和p62的水平，而PGG的处理逆转了这些变化。如图2A-图2C所示，与对照组相比，15mg/kgPGG处理组显著提升了小鼠结肠LC3B，Beclin1和p62的水平，但30mg/kgPGG处理组未能提升小鼠结肠beclin1和p62的水平。但是由图2D-图2F可知，30mg/kgPGG处理组小鼠前额皮层中LC3B，Beclin1和p62的水平显著增加。这些数据表明PGG增强了小鼠结肠和前额皮层的自噬。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。