靶向内毒素的功能聚合物和内毒素分离材料及制备与应用
文献发布时间:2024-04-18 19:48:15
技术领域
本发明提供了一种靶向内毒素的功能聚合物及其应用,属于材料科学、高分子科学及生物医学工程技术领域。本发明通过自由基聚合设计合成靶向细菌内毒素的功能聚合物,所述的功能聚合物与内毒素具有较高的特异性和亲和力,同时具有良好的抗污染性能、抗干扰性能和血液相容性,能够在血液中实现对内毒素的原位、精准清除。本发明所述的靶向内毒素的功能聚合物可广泛应用于生物医学的各个领域,如生物分离、生物检测、血液净化、疾病诊疗等领域。
背景技术
脓毒症是一种高发病率、高死亡率的危重病症,全球每年新增近5000万脓毒症病例,造成1000万患者死亡,占全球死亡人口总数的五分之一,是世界范围内ICU患者的首要死因,严重威胁人类生命健康。
内毒素(Endotoxin),一类由革兰氏阴性菌产生的具有属种特异性的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),是脓毒症发病和进展中最主要的病原体相关分子模式(PAMP)。内毒素是一种毒性很强的致炎和热原物质,由法国科学家Pfeiffer在霍乱弧菌的研究中首次发现并提出,主要在细菌死亡后从细胞壁裂解并大量释放,能诱发宿主天然免疫反应,引起肿瘤坏死因子、白细胞介素等多种细胞因子或其他炎症介质的表达和全身性释放。特别是当机体处于严重创(烧)伤、感染或外科大手术等应激状态时,机体屏障功能遭到破坏,大量内毒素从肠道或感染部位侵入血液,引发瀑布式炎症级联反应,导致机体过度的免疫应答,极易诱发脓毒症。病情进一步发展可引起脓毒性休克、弥散性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合症、全身炎症反应综合症、多器官功能衰竭等一系列危重病症并导致死亡。
及时清除血液中的内毒素对脓毒症治疗具有至关重要的作用。然而,内毒素的结构可变性及其诱发脓毒症的极低阈值,导致血液中的内毒素特异性清除面临巨大挑战。如何有效清除内毒素依然是临床诊疗、生物医药等领域研究的热点和难点。目前,一些天然和人工配体已被报道可用于内毒素结合。尽管大多数配体在体外实验中表现良好,但其特异性不足的缺点导致其在血液中内毒素清除的体内应用中伴随支持性治疗药物及其他体内免疫活性物质的大量丢失,使得血液净化在脓毒症治疗中往往得不偿失。因此,亟待开发特异性强、结合力强、血液相容性好的分离材料,实现在血液中对内毒素的原位、快速、精准清除。
噬菌体展示技术(phage display technology)是一种快速、高效、高通量的配基筛选方法。该技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达,同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性,以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,与靶分子特异性结合的噬菌体得到高度富集,最终通过DNA测序得到其外源蛋白或多肽的氨基酸序列,从而筛选得到靶分子的特异性结合配基。
结合功能聚合物设计,将筛选得到的特异性结合配基与功能单体整合后,可以实现不同功能的按需整合,从而得到兼具靶分子特异性结合性能、抗污染性能、血液相容性或其他性能的功能聚合物,进而实现对血液中的内毒素或其他目标毒素的特异性清除,对推动精准血液净化领域的发展具有重要的积极意义。
发明内容
本发明的目的在于填补内毒素精准分离领域的技术空白,提供一种能够特异性结合内毒素的功能聚合物。该功能聚合物与内毒素具有较高的特异性和亲和力,并具有良好的抗污染性能、抗干扰性能和血液相容性。对血液净化、生物医药等涉及内毒素精准分离的领域发展具有一定的指导意义。本发明技术方案如下:
第一个方面,本发明的目的是提供一种能够靶向内毒素的功能聚合物,
具体地,所述靶向内毒素的功能聚合物由抗污单元(PEGMEA,x括号内部分,x=1~10000)、内毒素结合单元(PEP),以及用于连接聚合物与内毒素结合单元的偶联单元(GMA,y括号内除PEP以外部分,y=1~10000)组成,其分子结构示意如下(聚合反应过程PEGMEA和GMA为无规共聚合,xy部分无序连接):
进一步具体地,所述功能聚合物中的抗污单元为聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯(PEGMEA);内毒素结合单元为内毒素亲和多肽,其氨基酸序列为His-Trp-Lys-Ala-Val-Asn-Trp-Leu-Lys-Pro-Trp-Thr(PEP-1)、Ser-Ser-Phe-Phe-His-Leu-Arg-His-His-Ala-His-Leu(PEP-2)、Gly-Leu-Ser-Arg-Tyr-Lys-Pro-Gly-Arg-Ser-Lys-Leu(PEP-3)、Trp-Arg-Ser-Ala-Gly-Glu-Ser-His-Phe-Gly-Leu-Thr(PEP-4)或
Cys-Pro-Arg-Thr-Leu-Ala-Ser-Arg-Ser-Asn-Cys-Tyr(PEP-5);
用于连接聚合物与内毒素亲和多肽的偶联单元为甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA),通过环氧开环反应,与内毒素亲和多肽的端氨基或氨基侧基反应。
第二个方面,本发明的另一目的是提供所述内毒素特异性结合聚合物在血液净化中的用途。
第三个方面,本发明所述的内毒素特异性结合聚合物,与内毒素具有较高的特异性和亲和力,并具有良好的抗污染性能、抗干扰性能和血液相容性。
本发明的特点和有益效果是:本发明的内毒素特异性结合聚合物,对内毒素的亲和力高、特异性高、抗污染性能好,能够在血液中实现对内毒素的精准分离,对重症血液净化,特别是脓毒症治疗,具有一定的指导意义。
所述的功能聚合物与内毒素具有较高的特异性和亲和力,同时具有良好的抗污染性能、抗干扰性能和血液相容性,能够在血液中实现对内毒素的精准清除,本可广泛应用于生物医学的各个领域,如生物分离、生物检测、血液净化、疾病诊疗等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为利用可逆加成-断裂链转移聚合合成poly(PEGMEA-co-PEP-1)的合成示意图。
图2为利用常规自由基无规共聚合合成poly(PEGMEA-co-PEP-2)的合成示意图。
图3为SiO
图4为SiO
图5为SiO
图6为poly(PEGMEA-co-PEP-1)对内毒素或血浆蛋白质的QCM吸附动力学曲线。
图7为poly(PEGMEA-co-PEP-1)修饰的金芯片表面的内毒素或血浆蛋白质吸附量。
图8为SiO
图9为PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球血液灌流柱在血液中的内毒素清除性能(动物实验)。
具体实施方式
SEQ ID No.1的信息
(a)序列特征
*长度:12氨基酸
*类型:氨基酸
*链型:单链
(b)分子类型:蛋白
序列描述:
SEQ ID No.1:His-Trp-Lys-Ala-Val-Asn-Trp-Leu-Lys-Pro-Trp-Thr(简称为:PEP-1);
SEQ ID No.2的信息
(a)序列特征
*长度:12氨基酸
*类型:氨基酸
*链型:单链
(b)分子类型:蛋白
序列描述:
SEQ ID No.2:
Ser-Ser-Phe-Phe-His-Leu-Arg-His-His-Ala-His-Leu(简称为:PEP-2);
SEQ ID No.3的信息
(a)序列特征
*长度:12氨基酸
*类型:氨基酸
*链型:单链
(b)分子类型:蛋白
序列描述:
SEQ ID No.3:
Gly-Leu-Ser-Arg-Tyr-Lys-Pro-Gly-Arg-Ser-Lys-Leu(简称为:PEP-3);
SEQ ID No.4的信息
(a)序列特征
*长度:12氨基酸
*类型:氨基酸
*链型:单链
(b)分子类型:蛋白
序列描述:
SEQ ID No.4:Trp-Arg-Ser-Ala-Gly-Glu-Ser-His-Phe-Gly-Leu-Thr(简称为:PEP-4);
SEQ ID No.5的信息
(a)序列特征
*长度:12氨基酸
*类型:氨基酸
*链型:单链
(b)分子类型:蛋白
序列描述:
SEQ ID No.5:Cys-Pro-Arg-Thr-Leu-Ala-Ser-Arg-Ser-Asn-Cys-Tyr(简称为:PEP-5)以上5种内毒素亲和多肽均委托南京杰肽生物科技有限公司合成;
实施例1:
利用可逆加成-断裂链转移聚合合成靶向内毒素的功能聚合物(图1)
(1)合成聚(聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯-co-甲基丙烯酸缩水甘油酯)[poly(PEGMEA-co-GMA)]:所用聚合方法为可逆加成-断裂链转移(reversible addition-fragmentation chain transfer,RAFT)聚合,所用引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN,CASNo.78-67-1),所用链转移剂为4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPPA,CAS No.201611-92-9),所用反应单体为聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯(PEGMEA,CAS No.32171-39-4,聚合度:n=9,Sigma-Aldrich试剂)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA,CAS No.106-91-2,上海阿拉丁试剂)。具体合成步骤如下:PEGMEA(4.8g,10mmol),GMA(1.14g,10mmol),AIBN(20.5mg,0.125mmol)和CPPA(70mg,0.25mmol)溶解在100mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,并在三次“冷冻-抽真空-充氮气-解冻”循环后(冷冻温度-80℃、时间20min,解冻温度为常温、时间20min,抽真空真空度100Pa,充氮气的压力100kPa),在65℃下磁力搅拌反应24h。反应物置于透析袋内在超纯水中透析纯化3天(透析袋截留分子量:3500Da),对透析袋内溶液真空冷冻干燥(真空度:100Pa,温度-40℃、时间48h)后得淡粉色粘性液体产物poly(PEGMEA-co-GMA)2.0g。通过核磁、红外、凝胶渗透色谱表征证明poly(PEGMEA-co-GMA)的成功合成(结构见图1,x=30~50y=30~50)。数均分子量=24920Da,多分散性(PDI)=1.9。(2)内毒素亲和多肽修饰合成聚(聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯-co-内毒素亲和多肽)[poly(PEGMEA-co-PEP-1)]:基于poly(PEGMEA-co-GMA)聚合物链中GMA分子的环氧基团与内毒素亲和多肽末端氨基的环氧开环反应,将内毒素亲和多肽PEP-1(本发明所涉及的5种多肽均委托南京杰肽生物科技有限公司合成)修饰到poly(PEGMEA-co-GMA)聚合物上,得到能够靶向内毒素的功能聚合物[poly(PEGMEA-co-PEP-1)]。具体合成步骤如下:PEP-1(20mg)和poly(PEGMEA-co-GMA)(20mg)溶于2mL超纯水中,40℃下磁力搅拌48h。反应物置于透析袋内在超纯水中透析纯化(透析袋截留分子量:3500Da),对透析袋内溶液真空冷冻干燥(真空度:100Pa,温度-40℃、时间48h)后得淡粉色粘性液体产物poly(PEGMEA-co-PEP-1)25mg。通过核磁、凝胶渗透色谱表征证明poly(PEGMEA-co-PEP-1)的成功合成(结构见图1,x=30~50y=30~50),二维核磁结果表明多肽与poly(PEGMEA-co-GMA)聚合物的结合方式为poly(PEGMEA-co-GMA)中的GMA单元与内毒素亲和多肽PEP-1的端氨基(组氨酸氨基)或氨基侧基(赖氨酸的氨基侧基)的环氧开环反应(反应处的产物连接结构为-CH(OH)-NH-)。数均分子量=31220Da,PDI=2.3。
实施例2:
利用常规自由基无规共聚合合成靶向内毒素的功能聚合物(图2)
(1)合成聚(聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯-co-甲基丙烯酸缩水甘油酯)[poly(PEGMEA-co-GMA)]:所用聚合方法为自由基无规共聚合,所用引发剂为过氧化二苯甲酰(BPO,CAS No.94-36-0,上海阿拉丁试剂),所用反应单体为聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯(PEGMEA,CAS No.32171-39-4,聚合度:n=9,Sigma-Aldrich试剂)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA,CAS No.106-91-2,上海阿拉丁试剂)。具体合成步骤如下:PEGMEA(4.8g,10mmol),GMA(1.14g,10mmol),BPO(1.06mg,12.5μmol)溶解在100mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,在65℃下磁力搅拌反应24h。反应物置于透析袋内在超纯水中透析纯化3天(透析袋截留分子量:3500Da),对透析袋内溶液真空冷冻干燥(真空度:100Pa,温度-40℃、时间48h)后得粘性液体产物poly(PEGMEA-co-GMA)3.4g。通过核磁、红外、凝胶渗透色谱表征证明poly(PEGMEA-co-GMA)的成功合成(结构见图2,x=300~400y=300~400)。数均分子量=204kDa,多分散性(PDI)=2.9。(2)内毒素亲和多肽修饰合成聚(聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯-co-内毒素亲和多肽)[poly(PEGMEA-co-PEP-2)]:基于poly(PEGMEA-co-GMA)聚合物链中GMA分子的环氧基团与内毒素亲和多肽末端氨基的环氧开环反应,将内毒素亲和多肽PEP-2(委托南京杰肽生物科技有限公司合成)修饰到poly(PEGMEA-co-GMA)聚合物上,得到能够靶向内毒素的功能聚合物[poly(PEGMEA-co-PEP-2)]。具体合成步骤如下:PEP-2(20mg)和poly(PEGMEA-co-GMA)(20mg)溶于2mL超纯水中,40℃下磁力搅拌48h。反应物置于透析袋内在超纯水中透析纯化(透析袋截留分子量:3500Da),对透析袋内溶液真空冷冻干燥(真空度:100Pa,温度-40℃、时间48h)后得粘性液体产物poly(PEGMEA-co-PEP-2)26mg。通过核磁、凝胶渗透色谱表征证明poly(PEGMEA-co-PEP-2)的成功合成(结构见图2,x=300~400y=300~400),二维核磁结果表明多肽与poly(PEGMEA-co-GMA)聚合物的结合方式为poly(PEGMEA-co-GMA)中的GMA单元与内毒素亲和多肽PEP-1的端氨基(丝氨酸氨基)的环氧开环反应(反应处的产物连接结构为-CH(OH)-NH-)。数均分子量=271kDa,PDI=3.5。
实施例3
SiO
首先通过表面可逆加成断裂链转移聚合,将poly(PEGMEA-co-GMA)接枝到二氧化硅微球表面,随后通过GMA的环氧基团与内毒素亲和多肽的末端氨基之间的开环反应,将内毒素亲和多肽修饰到聚合物上。具体反应步骤如下:
(1)SiO
(2)SiO
(3)SiO
实施例4
SiO
为了考察所述功能聚合物的内毒素清除性能,将2mg SiO
为了进一步研究SiO
实施例5
石英晶体耗散微量天平(QCM-D)吸附实验
首先制备poly(PEGMEA-co-PEP)修饰的石英晶体微天平(QCM)芯片:(i)将一片QCM芯片(频率:4.95MHz±50kHz,直径:14mm,RQ5MTAP,深圳仁路晶体有限公司)在2mLβ-巯基乙胺的乙醇溶液(1mM)中静置浸泡12h,得到β-巯基乙胺修饰的QCM芯片。(ii)将4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPPA,100mg,0.35mmol),N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC,333mg,1.61mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,192mg,1.67mmol)溶解于35mL DMF中,30℃下搅拌2h后,将一片β-巯基乙胺修饰的QCM芯片加至2mL上述反应液中,30℃下继续反应48h,随后依次用DMF和超纯水冲洗三次,得到链转移剂修饰的QCM芯片。(iii)将GMA(142mg,1mmol)、PEGMEA(480mg,1mmol)、AIBN(0.41mg,2.5μmol)溶于50mL DMF,并进行三次“冷冻-抽真空-充氮气-解冻”循环(冷冻温度-80℃、时间20min,解冻温度为常温、时间20min,抽真空真空度100Pa,充氮气的压力100kPa),得到反应液。随后将一片链转移剂(4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸)修饰的QCM芯片加至2mL上述反应液中,于65℃反应24h,随后依次用DMF和超纯水冲洗三次,得到poly(PEGMEA-co-GMA)修饰的QCM芯片。(iv)将一片poly(PEGMEA-co-GMA)修饰的QCM芯片加至5mL内毒素亲和多肽PEP-1(委托南京杰肽生物科技有限公司合成)的水溶液中(1mg/mL),于40℃反应48h,依次用DMF和超纯水洗涤,得到poly(PEGMEA-co-PEP-1)修饰的QCM芯片。
QCM-D测试在20℃下,使用Q-Sense E4系统(Biolin Scientific)进行。首先,用超纯水充分清洗QCM通道和管道,并用氮气吹干。然后将poly(PEGMEA-co-PEP-1)修饰的QCM芯片装入测试池。用超纯水和TBS清洗至基线信号稳定后,以100L/min的速度泵入内毒素(LPS)、人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白G(IgG)或转铁蛋白(TRF)的TBS溶液(5mg/mL,pH7.4),并通过Q-Sense软件记录频率和耗散随时间的变化曲线(图6),并通过Sauerbrey方程计算吸附量(图7):
Δm:芯片质量变化;Δf:振荡频率变化;C:常数,对于5MHz的晶体,C=17.7ng/(cm
如图6~7所示,泵入内毒素溶液后,可观察到芯片频率显著下降(Δf=-23.6Hz),表明内毒素在poly(PEGMEA-co-PEP)聚合物表面发生结合。相反,在泵入HSA、IgG或TRF溶液时,芯片频率变化不明显,这表明了poly(PEGMEA-co-PEP)聚合物对内毒素具有良好的选择性。根据Sauerbrey方程,内毒素在聚合物表面的吸附量为139.1ng/cm
实施例6
将10mg实施例3制备所得SiO
实施例7
PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球制备(i)PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)滴球原液制备:将聚醚砜(PES,重均分子量为51kDa,Ultrason E6020P,巴斯夫欧洲公司)、实施例1制备所得poly(PEGMEA-co-PEP-1)和二甲基乙酰胺(DMF)按质量比12:6:88混合,搅拌溶解完全后,经放置“熟化”(熟化条件:4℃静置48h)制得PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)滴球原液;(ii)PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球制备:用计量泵经针头内孔中挤出(针头型号:26G,针头直径:0.45mm,浙江欧健医用器材有限公司),PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)滴球原液滴出速度为30~40个/min;初生液滴在空气中经15cm距离后垂直滴于水/DMF混合浴(体积比1:1)中凝固成型得到PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球;(iii)PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球的后处理:微球(粒径1~3mm)在温度4℃下用超纯水浸泡72h,以除去残留的溶剂。
实施例8
PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球血液灌流动物实验(i)将实施例7的10mL体积的PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球装入灌流器(HC-0120-01,北京瑞达恒辉科技发展有限公司)中,用125IU/mL的肝素生理盐水对灌流器和管路进行预冲。随后在经1.5%戊巴比妥钠(1.5mL/kg)麻醉后的脓毒症动物模型(脓毒症建模:雄性新西兰兔,按500μg/kg剂量经耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素,注射后1h进行血液灌流实验)的左侧股动脉—左股静脉插管建立灌流系统(用一次性使用采血针将血液从血管导出或导入,采血针与灌流器通过一次性医用软管连接),灌流速度:5mL/min;灌流时间:2h。灌流过程中每隔0.5h从左股动脉处采集血样1mL,3500rpm离心15min后收集上层血浆,通过动态浊度法鲎试剂(KT-125,湛江安度斯生物有限公司),根据产品使用说明书,通过内毒素检测仪检测检测血液内毒素水平。如图9所示,用PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球灌流柱灌流2h后,血液中的内毒素水平由2.63±0.01EU/mL降至0.78±0.05EU/mL,血液内毒素清除率达70%以上。与空灌流柱对照组(用未填充吸附材料的灌流器进行血液灌流)和PES微球灌流组(用实施例6所得PES微球装填的灌流器进行血液灌流)相比,PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球灌流柱具有更好的内毒素清除效率。该结果表明PES/poly(PEGMEA-co-PEP-1)微球灌流柱具有良好的血液净化功能,能有效降低血液中的内毒素水平,对脓毒症治疗具有积极作用。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
- 聚合物在内毒素吸附剂中的应用
- 靶向内毒素的功能聚合物和内毒素分离材料及制备与应用
- EGCG在制备对抗脓毒症细菌内毒素靶向药物中的应用